Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Författarna vill tacka ESRF för beamtime.

Obs: Produktion, rening och kristallisation av GCSH beskrivs i kompletterande fil 1.
1. kortfattad beskrivning av offline förberedelse och crystal montering
<ol><li>Ställning en nylon-slinga eller ett annat crystal montering stöd redan fast en RYGGRAD pin under en eller flera kristaller och lyfta dem ur nederbörd lösningen (20 µL av 0,5 M natrium formate pH 4.0 + 25 µL protein lösning).<ol>
<li>Ta bort bulk vätskan runt crystal(s) genom att trycka på fästet med en papper veke att suga av någon överflödig vätska.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blöt crystal(s) i den cryoprotective lösning som innehåller den nederbörd lösning plus 30% glycerol; ta sedan bort både crystal stöd och crystal(s).<ol>
<li>Ta bort bulk vätskan runt crystal(s) genom att trycka på fästet med en papper veke att suga av någon överflödig vätska.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Störta fästet i en RYGGRAD injektionsflaskan fylld med flytande kväve och lagra det, tillsammans med eventuella andra kristaller på samma sätt beredda, i en europeisk Molecular Biology Laboratory (EMBL) / ESRF urval växlare pucken9 på flytande kväve temperatur. Obs: Crystal(s) är stabila i detta tillstånd tills beamtime finns.</li>
</ol>2. begär beamtime på MASSIF-1
<ol><li>Begära beamtime så tidigt som möjligt på ESRF hemsida (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). Obs: Det finns ett antal möjliga lägen för tillgång till den ESRF MX linjer. Laboratorier kan gäller kollektivt som en del av ett Block fördelning grupp (väska), har beamtime tilldelats för 2 år. Om grupper vill ansöka individuellt, kan de ansöka om rullande åtkomst, vilket ger dem snabb tillgång till linjer efter referentgranskning. Gruppens förslag granskas och rensas av gruppen ESRF säkerhet som kan begära ytterligare information. Om förslaget godkänns, kommer en experiment-nummer och lösenord att meddelas. Egen forskning kan utföras genom att köpa beamtime.</li>
	<li>Slutföra den nödvändiga säkerhetsutbildning online (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>Boka beamtime i MASSIF-1 kalendern. Obs: Det är möjligt att boka upp till maximalt 50 prov innehavare ska analyseras per skift.</li>
	<li>Fyll i ett-formulär att deklarera ett post-i experiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), tillsammans med nödvändiga säkerhetsinformation, för de prover som ska mätas.</li>
</ol>3. skapande av en diffraktion plan i ISPyB
Obs: Diffraktion planen håller all information som behövs för ett prov i ISPyB och kan innehålla ytterligare information för att skräddarsy experimentet utförs för varje prov.
<ol><li>Öppna ISPyB (vid https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>Välj MX experiment.</li>
	<li>Logga in med det experiment nummer och lösenord.</li>
	<li>Klicka på leverans | Lägg till ny och tillhandahålla nödvändig information. Klicka på Spara.</li>
	<li>Klicka på Lägg till skifte och fyll i den begärda informationen. Klicka på Spara.</li>
	<li>Klicka sedan på Lägg till behållare, ge pucken streckkoden som namn och välja RYGGRADEN pucken. Klicka på Spara.</li>
	<li>Klicka på behållaren symbol och Redigera, och fyll i nödvändig information, som protein namn, önskat arbetsflöde, crystal position i puck, etc., om proverna.</li>
	<li>Välj det protein (till exempel GCSH eller lysozym) som har godkänts av gruppen ESRF säkerhet.</li>
	<li>Ange ett unikt prov namn som identifierar varje enskilda prov. Det är möjligt att alternativt Skanna streckkoden pin. Resten av informationen nedan är valfritt.</li>
	<li>Ange valfri information.<ol>
<li>För varje enskilt prov, ange experiment (dvs, MXPressE_SAD, poäng eller MXPressO, etc., standard MXPressE) under Exp. typ. Detta definierar som automatiskt arbetsflöde används för att bearbeta varje kristall. Med tanke på att GCSH kristallerna är nålar, välja MXPressP.</li>
		<li>Ange en plats (till exempel P1, C2 eller P212121), om känt. Om närvarande, används detta för data collection strategi beräkningar och genom automatisk databehandling rörledningarna tillgängliga.</li>
		<li>Anger önskad upplösning (standard: dmin = 2.0 Å). Detta definierar crystal-till-detector avståndet för den ursprungliga mesh skanningar, karakterisering och standard datainsamling.</li>
		<li>Ställ in önskat tröskelvärde upplösningen (till exempel 1,5 Å eller 2.3Å), att förhindra insamlingen av full datamängder från kristaller som inte gravering till denna gräns. Detta kan spara data lagring utrymme och analys tid.</li>
		<li>Ange obligatoriska fullständighet (standard: 0,99). Ange den nödvändiga mångfalden (standard: 4). om mer än en crystal ingår prov stöd, ange det maximala antalet kristaller analyseras. Standardvärdet är 1 eller 5 för MXPressP.</li>
		<li>Välj lämplig beam storlek (standard: 50 µm). Om ett specifikt värde inte är markerad, kommer den X-stråle-centrering och data insamling strategi beräkningar att utföras med en balk med storleken 50 µm. Obs: Under någon insamling av data set, beam storlek anpassas automatiskt.</li>
		<li>Sätta i utrymmegruppen om känd, i kolumnen tvingad utrymme grupp. Ställa in strålning-känsligheten kristaller (0,5 – 2,0 för låg till hög känslighet, med ett standardvärde på 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om så önskas, ange totala rotationsvinkeln samlas för samlingen full datamängd (standard: totala rotationsvinkeln bestäms av eEDNA).</li>
	<li>Spara värdena. Klicka på återgå till transporter. Tryck på Skicka försändelsen till ESRF.</li>
	<li>Skriv ut fraktetiketten och skicka proverna. Användare bör ordna en pickup med en courier, med de ESRF kontouppgifterna. Obs: Det är mycket viktigt att välja Inkludera returetikett att tillåta sömlös återlämnande av prover (se https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4. data insamling, visning och hämtning
Obs: På dagen av experimentet, prov överförs till MASSIF-1 hög kapacitet Dewar (HCD). Beamline forskare sedan starta datainsamlingen, som kan följas av användare distans. För varje Provtyp av olika får användare ett e-postmeddelande som informerar dem om att datainsamlingen har startat. Som tidigare nämnts, utförandet av alla steg i alla arbetsflöden kan följas online och i realtid av den användare via ISPyB, där resultaten kan visas och laddas ner.
<ol><li>För varje prov som analyseras, undersöka resultatet av det automatiska experimentet i ISPyB (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>Logga in, med hjälp av experiment nummer och lösenord, och klicka på den önska experimentella sessionen på ID30A-1.</li>
		<li>Välj önskad (topp-scoring) autoprocessing rörledningen (till exempel granater eller XDS_APP) och hämta de data som skrivs ut i utrymmegruppen rätt med högsta upplösning och högsta fullständighet genom att klicka på Senaste samla resultat och, sedan Hämta. Obs: Alla mesh, linje och karakterisering bilder är i en underkatalog för varje prov, kallas /MXPressE_01. ESRF körs automatiskt fem separata bearbetning paket, nämligen EDNA_proc12, granater12, XDS_APP14, autoPROC15och XIA216. Dataintegration är baserad på XDS, med undantag för XIA2, som bygger på RATTARNA. Alla paket är också köra i avvikande och nonanomalous lägen, möjliggör automatisk identifiering av en avvikande signal, om den finns i data, för att användas i SAD fasa protokoll. Varje paket använder olika parametrar och beslutsträd, vilket innebär att vissa paket körs bättre med vissa prover. Detta kan dock göra för ett stort antal resultat när antalet paket och möjliga Utrymmegrupper redovisas. Resultatet är, därför rankas baserat ungefär på upplösning och andra mätningar av kvalitet, såsom Rsammanfoga i den lägsta upplösning shell, CC(1/2) och fullständighet. Syftet är att vägleda användaren till bästa datauppsättningar, men alla möjliga Utrymmegrupper och resultat ska inspekteras noggrant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Packa upp den nedladdade mappen, som kommer att omfatta alla loggfiler och separata XDS_ASCII. HST och sammanslagna och trappade .mtz filer. Obs: om strukturen (i PDB-format) av proteinet av intresse eller en nära homolog laddades upp till ISPyB i början av experimentet, rörledningen autoprocessing vid ESRF kommer att automatiskt utföra en molekylär ersättning (MR) körs med denna struktur som de Sök modell på bästa scoring lösning. Resultaten av rörledningen herr visas i ISPyB och kan hittas i mappen bearbetade data (till exempel /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Den slutliga modellen namnges här, coot1.pdb och den speglar data sidechains.mtz. Observera att rörledningen kan minska symmetrin av cellen (primitiva cellen minskning) för att öka sannolikheten för att finna en lösning. I det här fallet skrev rörledningen herr ut lösningen i en monoklina cell (C2) snarare än i en Ortorombiska cell (C2221). Detaljer om hur du utför en molekylär ersättning köra manuellt (exemplifierade för andra bäst scoring autoprocessing lösningen) ingår i den Kompletterande filer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Helautomatiska linjer ger automatiserad karakterisering och datainsamling från stort antal makromolekylära kristaller utan närvaro av en vetenskapsman, antingen på beamline eller distans, krävs. Med helt automatiserad linjer har många fördelar jämfört med manuell drift. För exempel, automatiserade provet centrering, baserat på röntgen mesh och line File, är mer precisa än som utförs med det mänskliga ögat som påverkas det inte av termisk eller optiska effekter. Faktiskt, dessa mesh och linje skanningar ger ytterligare data (dvs. detaljerade mått av kristallen och bästa diffracting regionen av kristallen) som är viktiga för att fastställa rätt beam storlek att använda för datainsamling – särskilt för små kristaller 18— och leder ofta till en förbättrad kvalitet av erhållna diffraktion data. Dessutom, genom att utnyttja de användardefinierade parametrarna vid installation av automatisk experiment, stegen i särskilda arbetsflöden kan skräddarsys för att bäst passa systemet under studien, således ytterligare optimera experiment framgång.
Ta tillsammans, tillförlitligheten i arbetsflödena som är tillgängliga, enkel tillgång till beamline (användare själv tidsplanera, använda en kalender [se ovan]), och den helautomatiska strategin i MASSIF-1 ger en rigorös, hög genomströmning och tidsbesparande alternativ till klassisk praktiska MX experiment och potential att genomföra mer avancerade förfaranden och program till automatiska arbetsflöden. Inom en snar framtid, kommer crystal kartografi i 3D19 att genomföras för att förbättra noggrannheten i röntgen centrering, medan mer komplexa protokoll, såsom crystal uttorkning experiment20, kommer att vara automatiserad. Förhoppningen är att helt självständigt datainsamling kommer att bli en standardmetod i MX, som tillhandahåller högkvalitativa data för små-molekylen fragment skärmar, optimera screening av stort antal dåligt diffracting kristaller och automatiskt tillhandahålla fas information för att lösa crystal strukturer de novo. I kombination med utvecklingen i den automatiserade skörden av kristaller21, möjligheten att protein kristall struktur lösning som en automatiserad tjänst kan väl bli en verklighet.

Bestämma den tredimensionella strukturen av specifika proteiner är avgörande i biologi. Den information som härleds från gör så belyser på biologiska funktion och form och specificitet av aktiv och/eller bindande platser som ingår i molekylen under studien. I många fall, detta tillåter verkningsmekanismer att bestämmas eller, i förekommande fall potentiella terapeutiska molekyler att utvecklas. MX är den teknik som vanligast att få strukturell information, men en flaskhals är bestämning av optimala förutsättningar att få väl diffracting kristaller. Därför kristallisering prövningar utförs under många olika förhållanden och screenas sedan, för att hitta de bästa kristallerna som ska användas för diffraktion datainsamling. Automatisering av inställningen av kristallisering prövningar1 har tydligt hjälpt i detta avseende. Men är de efterföljande stegen (dvs crystal montering, diffraktion screening och diffraktion datainsamling) vanligtvis utförs manuellt, tar upp mycket tid, ansträngning och resurser. Automatisering av diffraktion screening och datainsamling skulle därför innebära en enorm vinst i tid och effektivitet.
Diffraktion screening och datainsamling i MX utförs oftast vid synkrotron MX linjer där automation har i hög grad underlättat denna process. I de flesta fall är det dock nödvändigt för forskaren att närvara vid beamline under ett experiment eller att driva det distans. Nyligen har en ny generation av helt automatiserad MX linjer varit utvecklade2. Här, behöver användarna inte vara närvarande, antingen fysiskt eller på distans, under en experimentell session. Detta tillåter forskare att spendera mer tid på mindre rutinuppgifter, snarare än att spendera hela dagar, och ofta nätter, screening kristaller och diffraktion datainsamling. Världens första helautomatiska beamline är kraftigt automatiserad prov urval integrerad anläggning (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 på Europeiska Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Den har en unik prov miljö där en hög kapacitet prov-innehållande dewar driver parallellt med en robotic provväxlare som också fungerar som den beamline's goniometer4,5. MASSIVET-1 är en undulator beamline utrustad med en enda-fotonräknande hybrid pixel detektor6, som fungerar vid en fast våglängd på 0.969 Å (12,84 keV) med en intensiv X-ray balk (2 x 1012 fotoner/s). Beam storleken på provposition kan justeras mellan minst 10 µm (runda ljuskäglan) till högst 100 µm 65 µm (horisontell av lodräta balken storlek). I genomsnitt kan beamline process, i en helt automatisk mode (se nedan), 120 kristaller i 24 h. Driften av beamline är baserad på en serie av arbetsflöden7, varje som tar intelligenta beslut baserat på resultatet av föregående steg i arbetsflödet för att säkerställa att mätningen av den bästa möjliga datan från provet under studien. Särskilt utvärderingen av diffraktion egenskaper enskilda prov tar in i konto crystal volym och flux och säkerställer, där kristallen är större än röntgen balken, att endast den bästa regionen i kristallen används för efterföljande data Collection. Diffraktion datauppsättningar, således optimeras för maximal upplösning med minimerade strålning skada2,3. Krävande uppgifter samling protokoll, till exempel pseudo spiralformade (multi position) data collection strategier för både infödda och singel-våglängd avvikande diffraktion (SAD) datainsamling, är också tillgängliga8.
Helt automatisk experiment MASSIF-1 innebär cryocooling och montering kristaller på en magnetisk prov fäste passar för önskad beamline utrustning standard stift RYGGRADEN9, ange de experimentella parametrarna i den ' diffraktion plan' bord i det integrerade systemet för röntgenkristallografi linjer (ISPyB)10, ett webbaserat ledningssystem för MX experiment, och skicka proverna till beamline. Vid ESRF, alla kostnader för transport av proverna från beamline som stöds av ESRF användaren kontoret (se webbplatsen för ESRF11 för detaljer). MASSIF-1, är inga restriktioner på loop storlek eller kristall kvalitet. När du väljer en diffraktion plan för en given kristall, kan användaren antingen använda standardinställningarna eller välja från särskilda arbetsflöden, som kan anpassas för varje prov. Det finns flera förprogrammerade arbetsflöden. I MXPressE3 arbetsflödet justeras först prov-innehållande slingan till provposition med hjälp av optiska centrering. Sedan säkerställer X-stråle-baserade centrering att den bästa regionen i kristallen är centrerad till röntgen balken. Strategier för insamling av data beräknas sedan med eEDNA, en ram för att utveckla plugin-baserade program speciellt för online dataanalys i fältet röntgen experiment med hänsyn till konto crystal volym och realtid flux på beamline. Efter insamling av en full diffraktion datamängd, detta sedan bearbetas med hjälp av en serie av automatisk databehandling rörledningar12 och resultaten görs tillgängliga för inspektion och ladda ner i ISPyB. MXPressE SAD3 arbetsflödet syftar selenometionin som innehåller kristaller av Målproteinet och utnyttjar det faktum att den operativa energin av MASSIF-1 är strax ovanför kanten Se K. Här, i MXPressE eEDNA data collection strategin är optimerad för SORGLIGT datainsamling (dvs hög redundans, och med resolutionen där Rkopplingen mellan Bijvoet par är under 5%). Skärm diffraktion egenskaperna för en serie av kristaller utan efterföljande datainsamling, kan MXScore3 arbetsflödet användas att producera en fullständig bedömning av kristaller analyseras. I MXPressI3 arbetsflödet samlas 180 ° rotation data in med 0.2 ° svängningar och använda start phi vinkeln och den resolution som bestäms av en eEDNA strategi. MXPressO 3 innehåller en preobserved upplösning i arbetsflödet (standard: dmin = 2 Å). För att göra en första bedömning av kristallerna som härrör från en rättegång kristallisering, erbjuds MXPressM3 arbetsflödet. Detta utför en hög dos mesh scanna över provet stöd med ingen datainsamling bredaste orientering eller centrering. Två nya experiment arbetsflöden, MXPressP och MXPressP_SAD, som utför pseudohelical datainsamlingar, har nyligen varit genomförda8. Utförandet av alla steg i alla arbetsflöden kan följas online och i realtid av användaren, via ISPyB.
Här visar vi hur du förbereder en helt automatiserad MX experiment MASSIF-1 och hur man hämta och analysera data från experimentet. Som exempel använder vi människors mitokondrie glycin klyvning system protein H (GCSH). Detta lipoic syra-innehållande protein är en del av glycin klyvning systemet ansvarar för degraderingen av glycin. Detta system ytterligare omfattar det P-proteinet, en pyridoxal fosfat-beroende glycin dekarboxylas, proteinet T, en tetrahydrofolat-kräver enzymet och proteinet L, en lipoamide-dehydrogenas. GCSH överför metylamin gruppen av glycin från proteinet P till T-proteinet. Defekter i H proteinet är orsaken till nonketotic hyperglycinemia (NKH) i människor13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

Hög-briljans röntgen strålar tillsammans med automation har lett till användning av synkrotron-baserade Makromolekylär röntgenkristallografi (MX) linjer för även de mest utmanande projekten inom strukturbiologi. De flesta anläggningar kräver dock fortfarande närvaron av en forskare på plats att utföra experimenten. En ny generation av automatiska linjer tillägnad helautomatisk karakterisering av, och insamling av data från, kristaller av biologiska makromolekyler har nyligen utvecklats. Dessa linjer representerar ett nytt verktyg för strukturella biologer att skärmen resultaten av inledande kristallisering prövningar och insamling av stora mängder diffraktion datauppsättningar, utan användare behöva kontrollera beamline sig själva. Här visar vi hur du ställer in ett experiment för automatisk screening och datainsamling, hur ett experiment utförs på beamline, hur de resulterande datamängder behandlas, och hur, när det är möjligt kristallstrukturen i den biologiska makromolekyl är löst.

MXPressP arbetsflödet användes på den ESRF beamline MASSIF-1 till, helt automatiskt, montera, center i röntgen balken, karakterisera och samla full diffraktion datamängder från en serie av kristaller av mänskliga GCSH. Proverna var monterade och slingan analyseras för ett område att skanna (figur 1, vänster). Efter den diffraktion analysen valdes fyra punkter inom kristallen för datainsamling (figur 1, högra). Efterföljande bearbetning genom automatiserad analys datapipelines, inklusive herr rörledningen, gav hög kvalitet datamängder (tabell 1) för vilket en herr lösning hittades. Det senare tillåter användare att snabbt utvärdera om erhållna datamängden och Använd söka modellen är lämplig för utfasning av molekylär ersättning. Dessutom kan förekomsten av ligander bedömas, vilket tillåter användaren att bara fokusera på de mest lovande datamängderna för vidare analys. Manuell strukturbestämning av Herr gav en hög kvalitet elektron densitet karta efter en enda automatiserad förfining cykel (figur 2a). För denna datamängd klippa rörledningen automatiserad data på en 1,32 Å upplösning; användare kan dock fortfarande besluta att sänka data på en lägre upplösning för att komma fram till olika kvalitetsstatistik (CC1/2, < I/σ(I) >, Rmeas) i högsta upplösning shell. Kristallstrukturen av mänskliga GCSH struktur är liknande den av bovint protein (3KlR)16.
Kontinuerlig elektrontätheten är synlig för kedjan hela aminosyra, bortsett från N-terminala histidin etiketten. Av fyra substitutioner som skiljer människor och nötkreatur GCSH, är tre lätt identifierbara i elektrontätheten (Ile/Val66, Asp/Glu98 och Leu/Phe149; Figur 2b -d). Detta är mindre klar för Asp/Lys125 substitution som elektrontätheten av sidokedjan löses endast delvis på grund av flexibilitet (figur 1e). För närvarande erhållna modellen har Rarbeta och Rgratis värdena 20,4% och 23,8%, respektive, och ytterligare kan optimeras genom ytterligare cykler av automatiserade och manuella modellbygge och förfining.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>GRANATER pipeline</td>
			<td>XDS_APP pipeline</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Insamling och bearbetning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Röntga källa / helljus linje</td>
			<td colspan="2">ESRF / MASSIF-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Våglängd (Å)</td>
			<td colspan="2">0,966</td>
		</tr>
<tr>
<td>Upplösning (Å)</td>
			<td>41.88 – 1,48 (1,53-1,48)</td>
			<td>41,86-1.32 (1,39 – 1,32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Totalt/Unique reflektioner</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utrymmegruppen för indexering, skalning och sammanslagning</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cell dimensioner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>42,20, 83,75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83,72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0,05</td>
			<td>0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10,0 (110,7)</td>
			<td>11.1 (198,2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9,6 (1.3)</td>
			<td>7,6 (0,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99,7 (53,9)</td>
			<td>99,7 (19,1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullständighet (%)</td>
			<td>99,6 (99,6)</td>
			<td>99,5 (98,6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicity</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Molekylär ersättning och preliminär modell förfining</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utrymmegruppen för utfasning</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cell dimensioner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18, 95,82</td>
			<td>42.19, 83,72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sök modell för herr (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteinmolekyler / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protein rester</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rarbeta/rgratis (%) efter 1: a förfining</td>
			<td>24,3 / 26,5</td>
			<td>20,4 / 23,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bond längd (Å) efter 1: a förfining</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bond vinkel (°) efter 1: a förfining</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1,83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer avvikare (%) efter 1: a förfining</td>
			<td>1,07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran gynnade / / inaktiveras (%) efter 1: a förfining</td>
			<td>95.93 / 4,07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4,88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: röntgendiffraktion data insamling, förfining och validering statistik. Värdena för högsta upplösning skalet anges inom parentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> Figur 1: prov analys innan datainsamling. (A) regionen valt för skanning visas av en röd ruta. (B) analys av diffraktion bilder visas som en intensitetskarta. Fyra positioner inom ligger kristallen valdes för datainsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> Figur 2: visuell validering av elektronen täthet kartor erhålls efter förfiningen. Elektronen täthet kartor Konturskurna vid 2 x nivå r.m.s. runt (en) Trp143, (b), Val66 (Ile i mänskliga GCSH) och (c), Glu98 (Asp i mänskliga GCSH) och kartor Konturskurna på 1 x r.m.s nivå runt (d), Phe149 (Leu i mänskliga GCSH) och (e) Lys125 (Asp i mänskliga GCSH). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

Här, beskriver vi hur du använder automatiserade screening och data insamling alternativ som är tillgängliga på vissa synkrotron linjer. Forskare skicka cryocooled prover till synchrotron, och egenskaperna diffraktion screenas, datauppsättningar samlas in och bearbetas och, om möjligt, en struktur lösning utförs — allt utan mänsklig inblandning.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X-Ray kristallografi är den dominerande tekniken för att bestämma 3D strukturell information från proteiner. Synkrotronstrålens linjer behövs för att få fram data från de små, svagt diffraktionande kristallerna som proteinerna producerar. Massiv en är en unik strållinje eftersom den helt automatiserar processen för datainsamling från biologiska makromolekyler.Från provmontering, plats och slutlig datainsamling. Full automatisering av detta slag är mycket viktigt eftersom det tillåter forskare att tillbringa sin tid i labbet, istället för att samla in data på balken linjen. Strålen linjen är också intelligent och i genomsnitt, kan samla in bättre data än när strållinjen drivs av människor.Till att börja detta protokoll, utför kristall montering och begära stråltid på Massive en som beskrivs i textprotokollet. Navigera till informationssystemet för proteinkristallografistrålens linjer, eller ISPyB-webbplats. Välj MX experiment, logga in med experimentet nummer och lösenord.Klicka på sändning, lägg till nya, och ge nödvändig information. Klicka sedan på Spara. Klicka på Lägg till skifte och fyll i den begärda informationen.Klicka på spara, sedan på Lägg till behållare. Ge pucken streckkod som namn, och välj spine puck, igen klicka spara. Klicka på containersymbolen och redigera, och fyll i nödvändig information rörande proverna som proteinnamn, föredraget arbetsflöde, och kristallposition, i pucken.Välj det protein som har godkänts av säkerhetsgruppen ESRF. Ange ett unikt exempelnamn för att identifiera varje enskilt prov. Eventuellt skanna pin streckkoden.Resten av informationen som ska ingå är också valfri. För varje enskilt prov anger du experimenttypen. Detta definierar vilket automatiskt arbetsflöde som ska användas för att bearbeta varje kristall.Med tanke på att GCSH kristallerna är nålar, välj MX tryck P.Next, ange en rymdgrupp. Om det finns kommer detta att användas för datainsamling strategi beräkningar, och av den automatiska databehandling rörledningar tillgängliga. Ange önskad upplösning.Detta definierar kristallen till detektoravstånd från de inledande nätskanningar, karakterisering och standarddatainsamling. Nu, ställa in önskad tröskel upplösning för att förhindra insamling av fullständiga datamängder från kristaller som inte diffract till denna gräns. Detta kan spara datalagringsutrymme och analyser tid.Ställ in den nödvändiga fullständigheten. Ställ sedan in den multiplicitet som krävs. Om mer än en kristall finns på provstödet, ställ in det maximala antalet kristaller som ska analyseras.Standardvärdet är en eller fem för MX press P.Lämplig strålstorlek kan också väljas. Sätt i rymdgruppen, om den är känd, i kraftrymdsgruppkolonnen. Ställ sedan in kristallerna strålningskänslighet.Om så önskas, ställ in den totala rotationsvinkeln som ska samlas in för den fullständiga datamängdsinsamlingen. När all information har matats in i systemet, spara värdena. Klicka på, återgå till försändelser och tryck på skicka försändelse till ESRF.Skriv ut fraktetiketten och skicka proverna. Användare bör ordna en upphämtning med en kurir med hjälp av ESRF kontouppgifter. På dagen av experimentet, är tar prov överfört till den massiva en hög kapacitetdagg-er.Beam linje forskare sedan lansera datainsamling, som kan följas av användare på distans. För varje olika exempeltyp får användarna ett e-postmeddelande som informerar dem om att datainsamlingen har startat. Körningen av alla steg i alla arbetsflöden kan följas online och i realtid.Detta är tillgängligt för användaren genom att logga in på ISPyB. Resultaten kan också visas och laddas ner. För varje prov som analyseras, undersöka resultaten av det automatiska experimentet på ISPyB.Klicka på önskad experimentell session på ID30A1. Välj den prioriterade pipelinen för automatisk bearbetning. Ladda ner data som skrivits ut i rätt utrymmesgrupp med högsta fullständighet och högsta upplösning.Genom att klicka på den sista samla resultat och sedan ladda ner. MX press P arbetsflödet användes av ESRF strållinjen Massive en att helt automatiskt montera, centrum i röntgenstrålen, karakterisera, och samla in full diffraktion datamängder från en serie kristaller av mänskliga GCSH. Proverna monterades och slingan analyserades för ett område att skanna.Efter diffraktionsanalyserna valdes fyra punkter inom kristallen för datainsamling. Manuell struktur bestämning genom molekylär ersättning gav en högkvalitativ karta elektrontäthet efter en enda automatiserad förfining cykel. För denna datamängd, den automatiserade rörledningen skära data på en punkt tre två ångström upplösning.Användarna kan dock bestämma sig för att minska data med lägre upplösning. Fortlöpande elektrontäthet är synlig för den hela amino syran kedjar frånsett eterminal histidine märker. Av de fyra substitutioner som skiljer mänskliga och nötkreatur GCSH, tre är lätt identifierbara i elektron densitet.Detta är mindre klart för asparaginsyran att lysin 125 substitution. För vilka elektrontätheten i sidokedjan endast delvis löses på grund av flexibilitet. Den för närvarande erhållna modellen har ett R-arbetsvärde på 20 punkt fyra procent och ett R fritt värde på 23 punkt åtta procent och kan ytterligare optimeras genom ytterligare cykler av automatiserad och manuell modell byggnad och förfining.Det är viktigt att anpassa kraven till ditt system. Om du till exempel ställer in den redan observerade upplösningen på ett känt värde kan du spara tid och säkerställa bättre datainsamling. Helautomatisk datainsamling har demokratiserat kristallografi och nu även små laboratorier kan inleda berömda projekt när detta var genomförbart innan för endast med enorm man makt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS för Djupgående Karakterisering och kvantifiering av glutamin och asparagin Deamidering i Shotgun proteomik

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallografi av proteinkristaller och<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatisering av Protein kristaller med I3C med hjälp av Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq i bakterier: ett protokoll för insamling av prover och biblioteksförberedelser för NGS-sekvensering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstitution av Msp1-extraktionsaktivitet med helt renade komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...