Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Yazarlar ESRF beamtime için teşekkür ederim.

Not: Üretim, arıtma ve GCSH kristalleşme ek dosya 1' de açıklanmıştır.
1. kısa tanımı çevrimdışı hazırlık ve kristal montaj
<ol><li>Pozisyon bir naylon döngü ya da başka bir kristal montaj desteği zaten bir veya daha fazla kristalleri altında bir omurga pin sabit ve onları yağış çözüm (0,5 M sodyum formiat pH 4.0 + 25 µL protein çözüm 20 µL) dışarı kaldırın.<ol>
<li>Crystal(s) çevresinde toplu sıvı mount herhangi bir aşırı sıvı emmek için bir kağıt fitil ile dokunarak kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crystal(s) yağış çözüm artı % 30 gliserol içeren cryoprotective çözümünde emmek; ardından, kristal destek ve crystal(s) kaldırın.<ol>
<li>Crystal(s) çevresinde toplu sıvı mount herhangi bir aşırı sıvı emmek için bir kağıt fitil ile dokunarak kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mount sıvı azot ile dolu bir omurga şişe içine dalma ve saklayın, beraber benzer şekilde hazırlanan, Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL) içinde herhangi bir diğer / ESRF değiştirici puck9 sıvı azot sıcaklıkta örnekleme. Not: beamtime kullanılabilir duruma gelene kadar crystal(s) bu durumda stabildir.</li>
</ol>2. talep beamtime MASSIF-1
<ol><li>Beamtime (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying) adresindeki ESRF ana üzerinde mümkün olduğu kadar erken isteyin. Not: ESRF MX beamlines erişim mümkün modları bir dizi vardır. Laboratuvarlar topluca, bir blok ayırma grup (2 yıl için ayrılan beamtime için çanta), bir parçası olarak uygulayabilirsiniz. Grupları tek tek uygulamak isterseniz, onları akran sonra beamlines hızlı erişim sağlayan erişim, haddeleme için uygulayabilirsiniz. Grubun teklifi gözden geçirilecek ve ek bilgi isteyen ESRF Emanet grup tarafından temizlenir. Önerisi kabul edilirse, bir deney numarası ve şifre bildirilecektir. Özel araştırma beamtime satın alarak yapılabilir.</li>
	<li>Güvenlik (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining) eğitim online tamamlayın.</li>
	<li>MASSIF-1 takvim üzerinde kitap beamtime. Not: En fazla 50 örnek sahipleri vardiya çözümlenmesi için rezervasyon mümkündür.</li>
	<li>Bir posta içinde deneyi (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), ilan etmek A-biçimli ölçülecek olan örnekleri için gerekli güvenlik bilgileri ile birlikte doldurunuz.</li>
</ol>3. ISPyB bir kırınım planı oluşturulması
Not: Kırınım planı ISPyB bir örnek için gereken bütün bilgileri tutan ve her örnek için gerçekleştirilen deneme terzi için ek bilgi içerir.
<ol><li>ISPyB (https://exi.esrf.fr/) açın.</li>
	<li>MX deneylerseçin.</li>
	<li>Deney numarası ve parola ile oturum.</li>
	<li>Tıklatın Sevk irsaliyesi üzerinde | Ekle yeni ve gerekli bilgileri sağlayın. Kaydet' i tıklatın.</li>
	<li>Ekle parsel tıklatın ve istenen bilgileri doldurun. Kaydet' i tıklatın.</li>
	<li>Ardından Ekle kapsayıcı, puck barkod adı olarak vermek ve omurga diskiseçin. Kaydet' i tıklatın.</li>
	<li>Konteyner sembolü ve Düzenletıklayın ve tercih edilen iş akışı, puck, vb, kristal bulunduğu protein adı gibi gerekli bilgileri örnekleri ile ilgili doldurun.</li>
	<li>ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanmış protein (örneğin, GCSH veya lizozim) seçin.</li>
	<li>Tek tek her örnek tanımlayacak benzersiz örnek adını girin. İsteğe bağlı olarak PIN barkod taramak mümkündür. Aşağıdaki bilgileri geri kalanı isteğe bağlıdır.</li>
	<li>İsteğe bağlı bilgileri girin.<ol>
<li>Tek tek her örnek için deneme türü girin (örneğin, MXPressE_SAD, PUANIMI veya MXPressO, vs, varsayılan MXPressE) Exp. türü' nün altında. Bu otomatik iş akışı her kristal işlemek için kullanılan tanımlar. GCSH kristal iğneler olduğunu göz önüne alındığında, MXPressPseçin.</li>
		<li>Bir alan grubu (örneğin, P1, C2 veya P212121), biliniyorsa girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamalar için ve otomatik veri işleme boru hatları kullanılabilir tarafından kullanılacaktır.</li>
		<li>İstediğiniz çözünürlüğü girin (varsayılan: ddk 2.0 Å =). Bu kristal dedektörü mesafe ilk kafes taramaları, karakterizasyonu ve varsayılan veri toplama için tanımlar.</li>
		<li>Bu sınırı diffract değil kristalleri tam veri toplama önlemek için istediğiniz eşik (1.5 Å veya 2.3Å gibi) olarak ayarlayýn. Bu veri depolama alanı ve analiz zaman kazanabilirsiniz.</li>
		<li>Gerekli bütünlüğü ayarlayın (varsayılan: 0,99). Gerekli çeşitlilik ayarlayın (varsayılan: 4). örnek destek birden fazla kristal içeriyorsa, kristaller çözümlenmesi için maksimum sayısını ayarlayın. Varsayılan değeri 1 veya 5 MXPressP için bu.</li>
		<li>Uygun ışın boyutu seçin (varsayılan: 50 µm). Belirli bir değer seçili değilse, X x-ray merkezleme ve veri toplama stratejisi hesaplamalar 50 µm ışın büyüklüğü ile gerçekleştirilecek. Not: tam veri kümeleri herhangi bir sonraki toplama sırasında ışın boyutu otomatik olarak adapte.</li>
		<li>Alan grubunda, biliniyorsa, zorla alan grubu sütununa koyun. Kristaller (1 varsayılan değeri ile yüksek düşük duyarlılık için 0.5-2.0) radyasyon duyarlılığını ayarla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsterseniz, tam veri koleksiyon için tahsil edilecek toplam dönüş açısını ayarlayın (varsayılan: eEDNA tarafından belirlenen toplam dönüş açısı).</li>
	<li>Değerleri kaydedin. Gönderiler için geri' yi tıklatın. ESRF sevkıyata göndertuşuna basın.</li>
	<li>Sevkiyat Etiketi yazdırabilir ve örnekleri gönderebilirsiniz. Kullanıcılar bir pikap ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile düzenlemelisiniz. Not: (Bkz: https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement) örnekleri sorunsuz dönüşü izin vermek için INCLUDE iade etiketini seçmek çok önemlidir.</li>
</ol>4. veri toplama, görüntüleme ve alma
Not: deneme günü, örnekleri MASSIF-1 yüksek kapasite Dewar (HCD) için transfer edilir. Beamline bilim adamları daha sonra kullanıcıların uzaktan takip edilecek veri toplama başlatmak. Her farklı örnek türü için kullanıcıların veri toplama başlandığını bildiren bir e-posta. Yukarıda belirtildiği, tüm iş akışları tüm adımlarını yürütülmesini çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilmelidir kullanıcı yolu ile ISPyB, hangi sonuçlar görüntülenebilir ve indirilen tarafından.
<ol><li>Analiz her örnek için ISPyB (https://exi.esrf.fr/) otomatik denemenin sonuçları inceleyin.<ol>
<li>Giriş, parola ve deney numarası kullanarak ve istediğiniz deneysel oturumu ID30A -1 tıklayın.</li>
		<li>Tercih edilen (üst puanlı) işlenirken boru hattı (örneğin, el bombası veya XDS_APP) seçin ve doğru alan grubunda en yüksek bütünlüğü ve en yüksek çözünürlük ile En son toplamak sonuçlar ' ı tıklatarak yazılan veri indirme ve, o zaman, indir. Not: Tüm mesh, çizgi ve karakterizasyonu için her örnek, /MXPressE_01 adlı bir alt dizin içinde görüntülerdir. ESRF beş ayrı işleme paketi, yani EDNA_proc12, el bombası12, XDS_APP14, autoPROC15ve XIA216otomatik olarak çalışır. Veri tümleştirmesi XDS aramalar üzerinde dayanır XIA2 dışında dayanır. Tüm paketleri de varsa protokolleri phasing SAD kullanılmak üzere veri, anormal bir sinyal, otomatik olarak algılanmasını sağlayan anormal ve nonanomalous modlarında çalışır. Her paket farklı parametreleri ve karar ağaçları, bazı paketleri belirli örnekleri ile daha iyi çalışmasına anlam kullanır. Ancak, bu kaç para olduğu ve olası alan grupları sorumluydu zaman çok sayıda sonuçları için yapmak. Bu nedenle, sonuçları kabaca çözünürlük ve en düşük çözünürlük kabuk, CC(1/2) ve bütünlüğü Rbirleştirme gibi diğer kalite ölçümleri göre sıralanır. Bu kullanıcının en iyi veri kümeleri için yol gösterici hedefleniyor, ama tüm olası alan grupları ve sonuçları dikkatle kontrol edilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm günlük dosyalarını ve birleştirilmemiş XDS_ASCII yer alacak indirilen klasörü açmak. HKL ve birleştirilmiş ve ölçekli .mtz dosyaları. Not: faiz veya yakın bir homolog protein yapısını (PDB formatında) ISPyB deneme başlatmak için tarih oldu diye, işlenirken boru hattında ESRF otomatik olarak çalıştır'ı kullanma bu yapı olarak moleküler yerine (MR)-ecek yapmak En iyi çözüm puanlama modelinde arayın. Bay boru hattı sonuçlarını ISPyB içinde görüntülenir ve işlenmiş veri klasörü (örneğin, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ bulunabilir. mrpipe_dir /). Burada, son modelinde coot1.pdb ve yansıma veri sidechains.mtz olarak adlandırılır. Boru hattı bir çözüm bulma olasılığını artırmak için hücre (ilkel hücre azaltma) simetri azaltmak unutmayın. Burada durumda, Bay boru hattı çözüm monoclinic hücre (C2) yerine bir Ortorombik hücre (C2221) yazdı. Moleküler yerine gerçekleştirmek hakkında ayrıntılı bilgi el ile çalıştırmak (için ikinci en iyi skor işlenirken çözüm örneği) Ek dosyalarıdahil.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tam otomatik beamlines otomatik karakterizasyonu ve veri toplama makromoleküllerin kristalleri varlığı olmadan çok sayıda gelen bir bilim adamı, beamline veya uzaktan, gerekli sağlar. Tümüyle otomatik beamlines kullanarak el ile çalışması için karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. İçin örnek, merkezleme, otomatik örnek x-ışını mesh temel ve satır tarar, daha kesin insan gözü ile gerçekleştirilen daha termal veya optik etkileri tarafından etkilenmez. Nitekim, bu mesh ve satır taramalar veri toplamak için kullanılacak doğru ışın boyutu belirlemede önemli olan ek veri (yani, kristal ve kristalin bölge diffracting en iyi detaylı boyutları) sağlamak — özellikle küçük kristalleri için 18— ve genellikle elde edilen kırınım veri kalitesinin bir neden. Ayrıca, kullanıcı tanımlı parametreleri otomatik deneyler kurulumunda yararlanarak, belirli iş akışları adımda en uygun sistem altında eğitim, böylece daha fazla deney başarı oranı en iyi duruma getirme için uygun olabilir.
Birlikte, iş akışları kullanılabilir, beamline (bir takvim [yukarı bakın] kullanan kullanıcılar otomatik olarak zamanlama,) ve MASSIF-1'in tam otomatik yaklaşım kolay erişim sağlar titiz, güvenilirliği yüksek üretilen iş ve zaman kazandıran alarak Klasik uygulamalı MX deneyler ve daha gelişmiş işlemleri ve uygulamaları otomatik iş akışları içine uygulamak için potansiyel alternatif. Yakın gelecekte, kristal haritacılık 3D19 kristal dehidratasyon deneyler20gibi daha karmaşık protokoller otomatik yapılır iken X-ray, merkezleme doğruluğunu geliştirmek için uygulanacaktır. Bu tamamen özerk veri toplama kötü kristalleri diffracting ve otomatik olarak faz sağlayan çok sayıda tarama en iyi duruma getirme MX, küçük molekül parça ekranlar için yüksek kaliteli veri sağlayan standart bir yöntem olacağını ümit ediliyor Kristal yapıları de novo çözmek için bilgi. Kristalleri21otomatik hasat içinde gelişmeler ile birlikte, protein kristal yapısı çözüm imkanı otomatik bir servis olarak iyi bir gerçeklik haline gelebilir.

Spesifik proteinlerin üç boyutlu yapısını belirleme Biyolojide çok önemlidir. İşin üzerinden elde edilen bilgi çok biyolojik işlev ve şekil ve özgüllük molekül altında eğitim içerdiği etkin ve/veya bağlayıcı sitelerin bir ışık tutuyor. Çoğu durumda, bu potansiyel mekanizmaları tespit edilecek veya uygun yerde, için eylem sağlar gelişmiş olması tedavi molekülleri. MX yapısal bilgi elde etmek için en sık kullanılan teknik, ama bir performans sorunu iyi diffracting kristalleri elde etmek için en uygun koşullar belirlenmesi. Bu nedenle, kristalizasyon denemeler çok sayıda farklı koşullarda yapılır ve daha sonra kırınım veri toplamak için kullanılacak en iyi kristalleri bulmak için ekranlı. Kristalizasyon denemeler1 Kur Otomasyonu açıkça bu konuda yardımcı oldu. Ancak, sonraki adımları (yani, kristal montaj, kırınım tarama ve kırınım veri toplama) genellikle el ile bir sürü zaman, çaba ve kaynakları kadar alarak devam etmektedir. Bu nedenle, otomasyon kırınım tarama ve veri toplama zaman ve verimlilik büyük bir kazanç demektir.
MX kırınım tarama ve veri toplama en sık hangi otomasyon kolaylaştırdı büyük ölçüde bu işlem sinkrotron MX beamlines yapılır. Ancak, çoğu durumda, bu bilim adamı bir deney sırasında beamline bulunması veya uzaktan çalıştırmak için gereklidir. Son zamanlarda, tümüyle otomatik MX beamlines yeni nesil gelişmiş2oldu. Burada, kullanıcıların fiziksel olarak veya uzaktan, deneysel bir oturum sırasında bulunması gerekmez. Bu gece, tarama kristaller ve kırınım verilerin toplanması daha az rutin görevleri, harcama tüm gün yerine ve genellikle daha fazla vakit geçirmek için bilim adamları sağlar. Dünyanın ilk tam otomatik beamline ağır otomatik örnek seçimi entegre tesis (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 Avrupa sinkrotron radyasyon tesisi (ESRF), olduğunu. Beamline'nın gonyometre4,5olarak da davranır bir robot örnek değiştirici ile tandem örnek içeren bir yüksek kapasiteli dewar çalıştığı bir benzersiz örnek ortamına sahiptir. MASSIF-1'dir sabit bir dalga boyu 0.969 çalışan bir tek foton sayma hibrid piksel dedektörü ile6, donanımlı bir undulator beamline Å (12,84 keV) yoğun bir röntgen ışını (2 x 1012 fotonlar/s) ile. Örnek konumundaki ışın boyutu en az 10 µm (yuvarlak kiriş) en fazla 100 µm x 65 µm (yatay dikey kiriş boyutuna göre) arasında ayarlanabilir. Ortalama olarak, beamline işlemek, tamamen otomatik (aşağıya bakınız), 120 kristalleri 24 h moda. Beamline operasyon iş akışları7her biri altında eğitim örnekten en iyi olası veri ölçüm sağlamak için akıllı kararlar iş akışında, önceki adımları sonucunu temel alır, bir dizi dayanmaktadır. Özellikle, tek tek bir örnek kırınım özelliklerinin değerlendirilmesi hesap kristal birim ve akı alır ve sağlar, kristal kristal yalnızca en iyi bölgesi sonraki veri için kullanılır röntgen ışını daha büyük nerede koleksiyon. Böylece, kırınım veri kümeleri için simge durumuna küçültülmüş radyasyon hasarı2,3ile maksimum çözünürlük getirilmiştir. Zorlu veri koleksiyon, her iki yerel ve tek dalga boyu anormal kırınım (SAD) veri toplama için sözde Helisel (çok pozisyonlu) veri toplama stratejileri gibi aynı zamanda kullanılabilir8iletişim kurallarıdır.
Kristallerin istenen beamline donanımları standart için uygun bir manyetik örnek mount montaj omurga9istenen deneysel parametreleri girmeden, iğne ve tamamen otomatik deneyler MASSIF-1 dahil cryocooling ' kırınım planı ' masa Protein kristalografi beamlines (ISPyB) için10, MX deneyler, bir örümcek ağı esaslı bilgi yönetim sistemi entegre sisteminde ve örnekler için beamline gönderme. ESRF tüm örnekleri / beamline dan taşıma maliyetlerinin ESRF kullanıcı Office tarafından desteklenen (Ayrıntılar için ESRF11 Web sitesine bakın). MASSIF-1, döngü boyutu üzerinde hiçbir kısıtlamalar konur veya crystal kalite. İçin verilen bir kristal kırınım planı seçerken, kullanıcı varsayılan ayarları kullanabilir veya her örnek için özelleştirilebilir belirli iş akışları arasından seçim. Birkaç önceden programlanmış iş akışları kullanılabilir. MXPressE3 iş akışında örnek içeren döngünün ilk optik merkezleme kullanarak örnek konumunu hizalanır. Sonra X-x-ray tabanlı merkezleme kristalin en iyi bölge için röntgen ışını ortalanır sağlar. Veri toplama stratejileri sonra eEDNA, özellikle hesap kristal birim ve beamline, gerçek zamanlı akışa dikkate alarak online veri analizi X-ray deneyler alanında için eklenti tabanlı uygulamalar geliştirmek için bir çerçeve kullanılarak hesaplanır. Tam kırınım veri kümesi koleksiyonu, bu daha sonra bir dizi otomatik veri işleme boru hatları12 kullanılarak işlenir ve sonuçları ISPyB içinde muayene ve indirmek için kullanılabilir yapılır. MXPressE SAD3 iş akışı hedef protein kristalleri selenomethionine içeren hedefleniyor ve Se K kenarına MASSIF-1'in işletim enerjidir aslında patlatır. Burada, MXPressE eEDNA veri toplama stratejisi üzgün veri toplama için optimize edilmiştir (yani, yüksek fazlalık ve Bijvoet çiftleri arasında Rbirleştirme % 5 altında olduğu yere ayarla çözünürlük ile). Kırınım özellikleri bir dizi kristalleri sonraki veri toplama olmadan ekran için MXScore3 iş akışı analiz kristalleri tam kalite değerlendirilmesi üretmek için kullanılabilir. MXPressI3 iş akışında 180 ° dönüş veri 0.2 ° salınımlar ve başlangıç phi açı ve bir eEDNA strateji tarafından belirlenen çözünürlük kullanarak toplanır. MXPressO 3 iş akışı içine preobserved bir çözünürlük içerir (varsayılan: ddk = 2 Å). Bir kristalizasyon deneme kaynaklanan kristalleri ilk bir değerlendirmesini yapmak, MXPressM3 iş akışı sunulmaktadır. Bu yüksek doz kafes gerçekleştirir örnek destek hiçbir veri toplama ile en geniş yönünü üzerinden tarama veya merkezleme. Son zamanlarda, iki yeni deneme iş akışları, MXPressP ve MXPressP_SAD, pseudohelical Veri toplamalarını gerçekleştiren uygulanan8olmuştur. Tüm iş akışları tüm adımlarını yürütülmesini çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir kullanıcı, ISPyB tarafından.
İşte tam otomatik bir MX deney MASSIF-1 karşı hazırlıklı olma ve almak ve deneyden kaynaklanan verileri çözümlemek göstermektedir. Örnek olarak, biz insan mitokondriyal glisin bölünme sistem protein H (GCSH) kullanın. Bu lipoic asit içeren protein glisin bölünme sistem glisin bozulması için sorumlu bir parçasıdır. Bu sistem daha fazla P protein, piridoksal fosfat bağımlı glisin dekarboksilaz, T protein, tetrahydrofolate gerektiren bir enzim ve lipoamide dehidrogenaz L protein içerir. GCSH glisin methylamine grup T protein P protein aktarır. H protein kusurları insanlar13' te nonketotik hiperglisinemi (NKH) neden olur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

Yüksek-parlaklık röntgen ışınları otomasyon ile birleştiğinde Yapısal Biyoloji bile en zorlu projelerde sinkrotron tabanlı makromoleküllerin x-ışını kristalografisi (MX) beamlines kullanımına yol açmıştır. Ancak, çoğu İmkanları hala deneyler gerçekleştirmek için bir bilim adamı Çekme Makinası varlığını gerektirir. Otomatik beamlines tam otomatik karakterizasyonu ve veri toplama, adanmış yeni nesil kristalleri biyolojik oluştururlar, son zamanlarda geliştirilmiştir. Bu beamlines ilk kristalizasyon denemeler ve/veya kırınım veri kümeleri, çok sayıda topluluğu sonuçlarını beamline kendilerini kontrol zorunda olmayan kullanıcılar ekran yapısal biyologlar için yeni bir araç temsil eder. Burada nasıl bir deney otomatik tarama ve veri toplama, için göstermek nasıl bir deney beamline yapılır, nasıl elde edilen veri kümesi işlenir ve nasıl, mümkün olduğunda, biyolojik makromolekül kristal yapısı çözülmüş olacak.

MXPressP iş akışı ESRF beamline MASSIF-1 tam otomatik olarak, mount, röntgen ışını ortalamak, karakterize ve tam kırınım veri kümeleri bir dizi insan GCSH kristalleri toplamak için kullanıldı. Örnekleri monte edildi ve döngü (şekil 1, sol) inceden inceye gözden geçirmek için bir alan için analiz edilebilir. Kırınım Analizi sonra dört puan veri toplama (şekil 1, sağ) için kristal içinde seçildi. Sonraki otomatik veri analiz boru hatları, Bay çözümünü bulunduğu için yüksek kaliteli veri kümeleri (Tablo 1) vermiştir Bay boru hattı da dahil olmak üzere işleme. İkinci elde edilen veri kümesi ve kullanılan arama modeli tarafından Moleküler değiştirme phasing için uygun olup olmadığını hızlı bir şekilde değerlendirmek kullanıcılar sağlar. Buna ek olarak, ligandlar varlığı, böylece kullanıcı sadece en umut verici veri kümeleri daha ayrıntılı bir çözümleme için odaklanmak için izin karar olabilir. Sonra tek bir iyileştirme döngüsü (şekil 2a) otomatik manuel yapı belirlenmesi MR tarafından bir yüksek kaliteli elektron yoğunluğu harita vermiştir. Bu veri kümesi için çözünürlük Å 1,32, verileri otomatik boru hattı kesilmiş; Ancak, kullanıcılar hala farklı kalite yüksek çözünürlük kabuk (CC1/2, < I/σ(I) >, Rölçü) istatistiklere ulaşmak için daha düşük çözünürlükte veri kesmeye karar verebilirler. İnsan GCSH yapısı kristal yapısını sığır protein (3KlR)16benzemektedir.
Sürekli elektron yoğunluğu N-terminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görünürdür. İnsan ve sığır GCSH ayırt dört oyuncu değişikliği, üç elektron yoğunluğu (Ile/Val66, Asp/Glu98 ve Leu/Phe149; kolayca tanınır Şekil 2b -d). Bu daha az için elektron yoğunluğu yan zincirinin sadece kısmen esneklik nedeniyle (1e rakam) çözümlenir Asp/Lys125 değişimi için açıktır. Şu anda elde edilen modeli Riş ve %20,4 ve % 23,8, Rücretsiz değerleri sırasıyla vardır ve daha fazla otomatik ve manuel model kurma ve daha fazla döngüsü tarafından optimize edilebilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>El bombası boru hattı</td>
			<td>XDS_APP boru hattı</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Veri toplama ve işleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaynak x-ışını / satır kiriş</td>
			<td colspan="2">ESRF / MASSIF-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dalga boyu (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözünürlük (Å)</td>
			<td>41.88-1,48 (1,53-1,48)</td>
			<td>41.86-1,32 (1.39-1,32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Toplam benzersiz yansımalar</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dizin oluşturma, ölçekleme ve birleştirme alanı Grup</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cep boyutları</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>42,20, 83.75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83,72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0,05</td>
			<td>0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rbeni (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9,6 (1,3)</td>
			<td>7,6 (0,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99,7 (53.9)</td>
			<td>99,7 (19,1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bütünlüğü (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99,5 (98.6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çeşitlilik</td>
			<td>4.5 (4,4)</td>
			<td>4.4 (4,2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Ön modeli arıtma ve moleküler değiştirme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phasing için alan grubu</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cep boyutları</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42,18, 95,82</td>
			<td>42.19, 83,72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>α, β, γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Arama modeli için Bay (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protein molekülleri / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protein artıkları</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riş/Rücretsiz (%) sonra 1 arıtma</td>
			<td>24,3 / 26,5</td>
			<td>20,4 / 23,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 arıtma sonrasında RMSD bağ uzunluğu (Å)</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 arıtma sonra RMSD bond açısı (°)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer aykırı (%) sonra 1 arıtma</td>
			<td>1,07</td>
			<td>4,29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran sevdigi/izin/izin verilmeyen (%) sonra 1 arıtma</td>
			<td>95.93 / 4.07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4.88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: x-ışını kırınım veri toplama, arıtma ve doğrulama istatistik. En yüksek çözünürlük kabuk için değerleri parantez içinde verilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> Şekil 1: örnek analiz veri toplama önce. (A) tarama kırmızı bir kutuyla gösterilir için seçilen bölge. (B) analiz kırınım görüntülerin bir ısı haritası gösterilir. Dört pozisyon bulunduğu kristal içinde veri toplama için seçildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> Şekil 2: elektron yoğunluğu haritaların görsel doğrulama elde arıtma sonra. 1 x r.m.s seviyesi (insan GCSH Leu) (d) Phe149 civarında ve (e), 2 x r.m.s. seviyesi (insan GCSH Ile) (bir) Trp143, (b) Val66 civarında ve (c) Glu98 (insan GCSH nda Asp) ve haritalar konturlu elektron yoğunluğu haritalar konturlu Lys125 (insan GCSH nda Asp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X-Ray kristalografisi, proteinlerden elde edilen 3 Boyutlu yapısal bilgileri belirlemek için baskın bir tekniktir. Senkrotron ışını hatları proteinlerin ürettiği küçük, zayıf difüzif kristallerden veri elde etmek için gereklidir. Devasa olan benzersiz bir ışın hattıdır çünkü biyolojik makromoleküllerden veri toplama işlemini tam olarak otomatleştirir.Örnek montaj, konum ve son veri toplama. Araştırmacıların ışın hattında veri toplamak yerine laboratuvarda zaman geçirmelerine olanak sağladığı için bu tür tam otomasyon çok önemlidir. Işın hattı da akıllı ve ortalama olarak, ışın hattı insanlar tarafından işletilen zaman daha iyi veri toplayabilir.Bu protokolü başlatmak için, kristal montaj gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi Massive one üzerinde ışın süresi isteyin. Protein kristalografi ışın çizgileri veya ISPyB web sitesi için bilgi sistemine gidin. MX denemelerini seçin, deneme numarası ve parolayla giriş yapın.Sevkiyata tıklayın, yeni ekleyin ve gerekli bilgileri sağlayın. Ardından kaydet'i tıklatın. Paket ekle'yi tıklatın ve istenen bilgileri doldurun.Kaydet'i tıklatın, ardından kapsayıcı ekle'yi tıklatın. Disk barkod adını verin ve omurga diski seçin, tekrar kaydet'i tıklatın. Kapsayıcı sembolüne tıklayın ve edit ve diskte protein adı, tercih edilen iş akışı ve kristal konumu gibi örneklerle ilgili gerekli bilgileri doldurun.ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanan proteini seçin. Her bir örneği tanımlamak için benzersiz bir örnek adı girin. İsteğe bağlı olarak, pin barkod tazyik.İçerecek bilgilerin geri kalanı da isteğe bağlıdır. Her bir örnek için deneme türünü girin. Bu, her kristali işlemek için hangi otomatik iş akışının kullanılacağını tanımlar.GCSH kristallerinin iğne olduğu göz önüne alındığında, MX tuşuna basın P.Next'i seçin, bir uzay grubuna girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamaları için kullanılacak ve kullanılabilir otomatik veri işleme boru hatları tarafından. İstenilen çözünürlüğü girin.Bu, kristalden dedektöre ilk kafes taramalarından, karakterizasyondan ve varsayılan veri toplamadan uzaklığı tanımlar. Şimdi, bu sınıra difüzif olmayan kristallerden tam veri kümelerinin toplanmasını önlemek için istenen eşik çözünürlüğünü ayarlayın. Bu, veri depolama alanından tasarruf sağlayabilir ve zamanı analiz eder.Gerekli bütünlüğü ayarlayın. Sonra gerekli çokluğu ayarlayın. Örnek desteğinde birden fazla kristal bulunursa, analiz edilecek maksimum kristal sayısını ayarlayın.Varsayılan değer, MX tuşuna basmak için bir veya beştir P.Uygun ışın boyutu da seçilebilir. Uzay grubuna, eğer biliniyorsa, kuvvet uzay grubu sütununa koyun. Sonra kristallerin radyasyon hassasiyetini ayarlayın.İstenirse, tam veri kümesi koleksiyonu için toplanacak toplam dönüş açısını ayarlayın. Tüm bilgiler sisteme girdikten sonra değerleri kaydedin. Tıklayın, sevkiyatlara geri dönün ve ESRF'ye gönderi gönderme tuşuna basın.Sevkiyat etiketini yazdırın ve örnekleri gönderin. Kullanıcılar ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile bir pikap düzenlemelidir. Deney günü, numuneler Massive one yüksek kapasiteli çiy-er aktarılır.Işın hattı bilim adamları daha sonra uzaktan kullanıcılar tarafından takip edilebilir veri toplama, başlatmak. Her farklı örnek türü için, kullanıcılar veri toplamanın başladığını bildiren bir e-posta alır. Tüm iş akışlarındaki tüm adımların yürütülmesi çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.Bu, ISPyB'e giriş yaparak kullanıcı tarafından erişilebilir. Sonuçlar da görüntülenebilir ve indirilebilir. Analiz edilen her örnek için ISPyB'deki otomatik denemenin sonuçlarını inceleyin.ID30A1'de istenilen deneysel oturuma tıklayın. Tercih edilen otomatik işleme ardışık hattını seçin. Doğru alan grubunda yazılan verileri en yüksek tamve en yüksek çözünürlüğe sahip olarak indirin.Son toplama sonuçlarına tıklayıp indirebilirsiniz. MX basın P iş akışı ESRF ışın hattı Massive tarafından kullanılan tam otomatik olarak monte etmek, x-ışını ışın merkezi, karakterize, ve insan GCSH kristalleri bir dizi tam kırınım veri setleri toplamak. Örnekler monte edildi ve döngü tarayan bir alan için analiz edildi.Kırınım analizlerinden sonra, veri toplama için kristal içinde dört nokta seçilmiştir. Moleküler replasman ile manuel yapı tayini, tek bir otomatik arıtma döngüsünden sonra yüksek kaliteli elektron yoğunluğu haritası nı ortaya koydu. Bu veri kümesi için, otomatik boru hattı bir noktada üç iki angstrom çözünürlüğü veri kesti.Ancak, kullanıcılar verileri daha düşük çözünürlükte kesmeye karar verebilir. Sürekli elektron yoğunluğu eterminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görülebilir. İnsan ve büyükbaş hayvanı GCSH'yi ayıran dört ikameden üçü elektron yoğunluğunda kolayca tanımlanabilir.Bu daha az aspartik asit lizin için daha az açıktır 125 ikame. Hangi yan zincirin elektron yoğunluğu sadece kısmen esneklik nedeniyle çözülür. Şu anda elde edilen model 20 nokta dört yüzde bir R çalışma değeri ve 23 nokta sekiz yüzde R serbest değeri ve daha otomatik ve manuel model oluşturma ve arıtma ek döngüleri ile optimize edilebilir.Gereksinimleri sisteminize uyarlamak önemlidir. Örneğin, zaten gözlenen çözünürlüğü bilinen bir değere ayarlamak zamandan tasarruf edebilir ve daha iyi veri toplama sağlayabilir. Tam otomatik veri toplama kristalografi demokratikleştirilmiş ve şimdi bile küçük laboratuvarlar bu sadece büyük insan gücü ile daha önce mümkün iken ünlü proje girişmek olabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...