Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

Forfatterne takker ProMab Biotechnologies og ACEA Biosciences for at levere de reagenser og instrumenter, der udnyttes i denne undersøgelse.

1. generering af bil-kodning lentivirus
Bemærk: når den specifikke bil T-Cell plasmid konstruktion er afsluttet (CD47 og andre), lentiviral biler genereres af den standardprocedure, ved hjælp af 293 ft celler, en lentiviral emballage mix, og transfektering agenter (Se tabellen over materialer) som beskrevet29. Brug derefter en kvantitativ reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR) kit og en termisk variator (Se tabellen over materialer) til at bestemme virus titer ved at måle lentiviral RNA beløb i henhold til producentens protokol. Det er vigtigt, at alle lentivirale procedurer udføres strengt efter sikkerhedskravene.
<ol><li>Frø 15 x 106 HEK293FT celler i dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) og Inkubér cellerne natten over ved 37 °c i 1 150 mm skålen inde i en befuret 5% Co2 inkubatoren.</li>
	<li>Forbered 2 15 ml rør med transfektering kompleks. Det første rør indeholder lentiviral vektor plasmid DNA (5 μg) og lentiviral emballage mix (22,5 μg) i 2,5 ml transfektering fortyndings opløsning. Det andet rør indeholder 82,5 μl transfektering reagens i 2,5 ml transfektering fortyndings opløsning (Se tabellen over materialer).</li>
	<li>Pipet indholdet af tube 1 i tube 2, og Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 15 minutter.</li>
	<li>Indholdet af røret dråbevis overføres til skålen med HEK293FT celler, og prøven inkubates natten over ved 37 °c i en befugret 5% Co2 -inkubator.</li>
	<li>Næste dag skal det eksisterende medium udskiftes med 19 mL frisk DMEM-kulturmedium, og cellerne fortsætter med at inkubere natten inde i den befugdede 5% CO2 -inkubator ved 37 °c.</li>
	<li>Overfør mediet fra skålen til et 50 mL centrifugeglas. Hold røret med det virus holdige medium i køleskabet.</li>
	<li>Gentag ovenstående procedure, tilføje frisk DMEM og indsamle det igen efter 1 dag.</li>
	<li>Kombiner to samlinger af medierne i ét centrifugeglas. Centrifugeret røret ved 2.000 x g i 30 minutter ved 4 °c.</li>
	<li>Det meste af den lentivirus-holdige supernatanten overføres til et ultraklear centrifugeglas. Efterlade en minimumsvolumen, ca. 1 mL, af supernatanten for at undgå at forstyrre pellet, som kan indeholde celler og/eller snavs.</li>
	<li>Ultracentrifuge ovenstående præciserede supernatanten ved 110.000 x g for 100 min ved 4 °c.</li>
	<li>Fjern supernatanten forsigtigt og tilsæt forsigtigt 100 μL DMEM medium til virus pellet ved rørbunden. Lad røret på is i 15 min. Bland opløsningen forsigtigt og alikvot lentivirus opløsningen til forkølede sterile rør. Opbevar disse virus Stam slanger i a-80 °C fryser.</li>
	<li>Brug en kvantitativ RT-PCR kit til at bestemme titer af lentivirus i henhold til producentens protokol, som ekstrakter og måler lentiviral RNA.</li>
</ol>2. generering og udvidelse af bil T-celler
<ol><li>Aktiver tidligere frosne humane Pbmc'er (ca. 1 x 106 til 2 x 106 celler) i 1 ml T-celle medium med et lige antal CD3/CD28-coatede mikroperler (Se tabellen over materialer) og Inkubér cellerne ved 37 °c i en befuret 5% Co2 -inkubator i 24 timer.</li>
	<li>Tø en alikvot af lentivirus bestanden på is.</li>
	<li>Tilsæt 1 μL transduktion forbedre agent i brønden med cellerne og bland.</li>
	<li>Tilsæt lentivirus til cellerne ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5:1 og bland forsigtigt. Næste dag gentages dette trin (24 timer efter den første transduktion).</li>
	<li>Overvåg T-cellevæksten hver 2-3 dage. Tilsæt mere frisk bil T-celle medium for at vedligeholde cellerne ved en densitet på 1 x 106 til 2 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Fryse ned bilen T celler med en standardprotokol ved hjælp af frysning løsning (Se tabellen over materialer).</li>
	<li>Tø bil T celler ved hjælp af en standardmetode og preculture dem i bilen T-Cell medium for omkring ~ 2-4 h med IL-2 (300 enheder/mL), før du anvender dem til analysen.</li>
</ol>3. påvisning af BILUDTRYK ved strømnings cytometri
<ol><li>Overfør 3 x 105 bil-t-celler og ikke-Transducerede t-celler til to separate 1,5 ml mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>Rørene centrifugeres ved 300 x g i 2 minutter, og cellerne resuspenderes i 200 μl fluorescens-aktiverede celle sorterings-(FACS) buffer, der indeholder 1% humant serum.</li>
	<li>Pipet 100 μL celle opløsning i to 5 mL polystyren FACS rør og holde rørene på is i 5 min.</li>
	<li>Tilsæt 1 μL biotinyleret ged anti-Mouse F (AB ')2 til et rør af hver celletype. Tilsæt derefter 2 μL PE-mærket anti-tag antistof (Se tabellen over materialer) til det andet rør af hver celletype. Bland godt og Inkuber dem på is i 30 minutter.</li>
	<li>Cellerne vaskes med 3 mL FACS-buffer i hvert rør, og rørene centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Fjern Supernatanterne og vortex meget kort eller Ryst rørene kortvarigt for at resuspendere cellerne i rest væsken.</li>
	<li>Tilsæt 2 μL APC anti-CD3 og 2 μL 7-AAD-antistof opløsning (Se tabellen over materialer) til hvert rør. I røret af celler farvet med anti-F (AB ')2 AB tilsættes 1 μl PE-mærket streptavidin. Bland kortvarigt og Inkubér rørene på is i 30 minutter mere.</li>
	<li>Brug FACS-bufferen til at vaske cellerne igen som beskrevet i trin 3,5, og tilsæt yderligere 200 μL FACS-buffer til hvert rør.</li>
	<li>Brug flowcytometry til at analysere cellerne ved først at gating på T-cellerne i en Forward scatter vs. side scatter plot og derefter gating på de levende celler (7-AAD-negativ) i en CD3 vs. 7-AAD plot. Det sidste skridt er at analysere anti-tag, anti-ScFv eller anti-F (AB ')2 vs. CD3.</li>
</ol>4. Real-time cytolyse styrke assay
Bemærk: Udfør RTCA-analysen i henhold til producentens anbefalede betingelser. Kort sagt, første plade målcellerne i brøndene af E-pladen, efterfulgt af tilsætning af bil T celler på den næste dag. Cytolyse aktivitet af bil T celler mod målceller overvåges i realtid. T-celler og mock-transduced T-celler (mock CAR T-celler) anvendes som negative effektor celle kontroller. Følgende protokol beskriver en in vitro real-time cytolyse potens analyse for overholder tumorcellelinjer.
<ol><li>Tilsæt 100 μL målcelle kulturmedium til hver brønd af xCELLigence E-pladen, Placer pladen inde i xCELLigence instrumentet, og tag en baggrunds aflæsning. Derefter overføres E-pladen til en vævskultur hætte for celle såning.</li>
	<li>Brug en standardprotokol til trypsinize Målret mod kræftceller fra kultur enheden. Derefter overføres cellerne til et 15 mL centrifugeglas, og der tilsættes frisk dyrkningsmedium op til 15 mL. Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 200 x g. Supernatanten kasseres, der tilsættes 5 mL frisk medium, og der anvendes en serologisk pipette til forsigtigt at resuspendere celle pellet. Tæl tætheden af levende celler ved hjælp af et hemocytometer og mikroskop.</li>
	<li>Juster celletætheden korrekt, og tilsæt derefter 100 L af cellesuspensionen til hver brønd af E-pladen. Målcellens nummer er typisk omkring 10.000 celler/godt for konvedent cellelinjer (BxPC3, Hela-CD19 og SKOV3), eller 30.000 celler/godt for suspension celler som Raji (se nedenfor for detaljer om præbelægning brønde med antistoffer for at tøjle flydende kræftceller).</li>
	<li>Ækvibrere E-pladen ved stuetemperatur i 30 min for at tillade cellerne at bosætte sig jævnt på bunden af brønden (dette er kritisk; spring ikke dette trin over).</li>
	<li>Placer E-pladen i xCELLigence instrumentet inde i cellen kultur inkubator og begynd at måle impedans, vises som celle indeks vs. tid, automatisk hver 15 min.</li>
	<li>Den næste dag, forberede Effector bil T-celler. Sørg for at forberede passende kontrol (dvs., mock bil T-celler, ikke-transduced Control T-celler, og/eller uafhængige bil T-celler) forud for tid til at sikre, at alle cellerne er klar på samme tid. Justér Effector cellerne og kontrol cellerne til den rette tæthed, og Forbered serielle fortyndinger for at sikre, at de ønskede E:T-forhold opnås, når 100 μL Effector cellesuspension tilsættes til hver brønd i trin 9.</li>
	<li>Sæt xCELLigence-dataindsamlingen på pause, og Bring E-pladen fra inkubator til en cellekultur hætte.</li>
	<li>Fjern 100 μL medium fra hver brønd. Mængden af rest medium i hver brønd er nu 100 μL.</li>
	<li>Tilsæt 100 μL serielt fortyndede Effector-bil-T-celler eller andre kontrol celler (dvs. mock-bil-T-celler) for at opnå de ønskede E:T-nøgletal.</li>
	<li>Aftal E-pladen ved stuetemperatur i 30 minutter, så Effector-cellerne kan bosætte sig, og Placer derefter E-pladen i xCELLigence-instrumentet igen. Genoptage dataindsamling.</li>
	<li>Hvis det ønskes, kan xCELLigence-dataindsamlingen på centrale tidspunkter afbrydes midlertidigt og pladen fjernes for at indsamle små prøver, der skal analyseres ved ortogonale analyser (dvs. måling af cytokinproduktion ved ELISA eller flowcytometri).</li>
	<li>I EGFR-GITR-CD3-bil-T-celle-eksperimentet måles INFγ Yield med et ELISA-Kit (Følg producentens anvisninger; Se tabellen over materialer). BEMÆRKNING vedrørende brugen af flydende KRÆFTFORMER: til afprøvning af ikke-vedhængende hæmatologiske cancerceller, før tilsætning af celler, er E-pladens brønde først belagt med et antistof, der er specifikt for et antigen, der udtrykkes på overfladen af kræftcellerne. For Raji B-celle linjen anvendes en tethering reagens baseret på anti-CD40 (Se flydende tumor drab assay kit i tabellen over materialer). Nedenfor er proceduren for belægning af pladen:</li>
	<li>Tethering reagens (anti-CD40) fortyndes med tethering buffer til en koncentration på 4 μg/mL.</li>
	<li>Ved at arbejde inde i en vævs kulturhætte tilsættes 50 μL af det fortyndede tethering reagens til hver brønd på E-pladen. Lad E-pladen ligge ved stuetemperatur eller i en 37 °C-inkubator i 3 timer.</li>
	<li>Fjern tethering reagenset og vask E-pladen mindst 2x med vaskebuffer. På dette tidspunkt er E-pladen klar til at såning de Raji målceller (30.000 celler/brønd).</li>
	<li>Fortsæt med trin 4,1 (ovenfor) for at udføre resten af proceduren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+Therapy:+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy.">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>June, C. H., O&#8217;Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>. FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017)</li><li>. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017)</li><li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China.">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology &#38; Oncology. 10 (1), 166 (2017).</li><li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy.">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li><li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells.">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li><li>. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017)</li><li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf.">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li><li>D&#8217;Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &#38; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors.">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li><li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric-antigen+receptor+T+(CAR-T)+cell+therapy+for+solid+tumors:+challenges+and+opportunities.">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors.">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li><li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy.">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li><li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis.">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li><li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+chromium-51+release,+cell-mediated+cytotoxicity+assay:+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells.">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li><li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry.">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).</li><li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse.">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Unit+7:+51Cr+release+assay+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+(ADCC).">Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).</a> Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements.">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li><li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays.">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li><li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability.">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li><li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies:+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels.">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering &#38; Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li><li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth.">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li><li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer.">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation.">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li><li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system.">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).</li><li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells.">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li><li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape.">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules.">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).</li><li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47/SIRPalpha+axis.">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li><li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD47:+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy.">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li><li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine,+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+(P4455).">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer.">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy.">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening.">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).</li><li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technology+and+patient+cells:+from+early+drug+development+to+precision+medicine.">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li></ol>

Forfatterne udfører forskning i bil T-celle udvikling og tilhørende potens assays, som er forretningsmæssige interesser ProMab Biotechnologies og ACEA Biosciences, hhv. Dette ændrer imidlertid ikke forfatternes tilslutning til Jove's mission om at øge udbredelsen af videnskabelig viden. Vilkårene i denne publikation er blevet revideret og godkendt af ProMab Biotechnologies og ACEA Biosciences i overensstemmelse med dens forskningspolitik.

Chimeric antigen receptorer er multi Domain proteiner bestående af en ekstracellulær enkelt-kæde variabel fragment (scfv region), en hængsel region, en transmembran region, og en cytoplasmisk domæne sammensat af TCR signalering domæner og yderligere costimulatory domæner fra receptorer såsom CD28 og OX4011,40. At designe sikre, selektive og effektive biler, er det bydende nødvendigt, at de forskellige permutationer i udformningen af bilerne er grundigt testet ved hjælp in vitro-potens assays og, i sidste ende, dyremodeller. I denne undersøgelse har vi givet en protokol og en arbejdsgang for, hvordan en real-time in vitro styrke analyse kan informere udformningen af effektive biler.
Ved udformningen af nogen form for styrke analyse, især til fremstillings formål, er det bydende nødvendigt, at analysen være følsom, robust, konsekvent, og så tæt på virkningsmekanismen som muligt16,17,41. Den realtids styrke analyse, der er beskrevet her, er designet til at måle den cytolytiske aktivitet i bilens T-celle direkte i stedet for at bruge en surrogatmarkør såsom cytokinfrigivelse. Det er vigtigt, at analysen ikke kræver yderligere komponenter såsom farvestoffer eller reagenser bortset fra analyse pladen (E-pladen) og de anbefalede medier til vedligeholdelse af cellerne. Derudover er analysen udsøgt følsom og giver meget reproducerbare data sammenlignet med andre etiketbaserede assays42,43,44. Desuden er xCELLigence-analysen modtagelig for at anvende meget lave effektor-til-mål-nøgletal, som er ideelle til vurdering af specifik cytolyse.
For at demonstrere fleksibiliteten og nytten af xCELLigence systemet, har vi fokuseret på to tumortyper, nemlig tumorer i Hæmatologisk oprindelse og solide tumorer. For at vurdere styrken af CD22-rettede bil T-celler, blev Raji-celler (dvs. en B-celle lymfom cellelinje) bundet til E-pladerne ved hjælp af et anti-CD40 antistof. Tethering af Raji celler til bunden af E-pladerne resulterer i et impedans signal, som afspejler levedygtigheden og antallet af Raji celler i brønden. Efter tilsætning af CD22-bil T-celler, er de Raji celler selektivt dræbt i en tid-og Effector-afhængige måde, kulminerende i en tidsafhængig fald i impedans signal. Faldet i impedans betyder cytolyse eller tab af levedygtighed af Raji celler17. Denne selektive tethering tilgang ved hjælp af antistoffer kan udvides til andre flydende tumorcellelinjer. En alternativ strategi til at bruge tumorcellelinjer af Hæmatologisk oprindelse er at bruge vedlige kræftceller, der er konstrueret til stabilt at udtrykke tumor antigener, såsom CD19 udtrykt i HeLa celler. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at forældrenes HeLa-celler er let tilgængelige og kan bruges som en negativ kontrol for specificitet. En sådan fremgangsmåde er allerede blevet valideret med CHO-CD22 vs. CHO cells og CHO-BCMAs vs. CHO cells29. Ved hjælp af sådanne forskellige tilgange, bil T-Cell design og effektivitet kan let testes. XCELLigence-analysen er i sagens natur fleksibel, og Analysebetingelserne kan justeres for at opnå maksimalt omtrentlige fysiologiske forhold.
En stor fordel ved styrken assay vi beskrev her er, at det er en simpel funktionel analyse og kan bruges i forbindelse med genteknologi teknikker til at designe optimale og effektive biler i en høj gennemløb mode. Som det blev vist her for bil T celler designet til at målrette EGFR-positive kræftceller, analysen kan bruges til at evaluere den relative aktivitet af forskellige BILKONSTRUKTIONER/mutanter. For eksempel viste vi, at når GITR-domænet er placeret opstrøms for CD3-domænet, viser det meget mere robust cytolytisk aktivitet, end når det er placeret neden for CD3 domænet.
Selv om det ikke korrelerer perfekt med in vivo bil T celle aktivitet, in vitro cytokinfrigivelse har historisk set været brugt som et mål for bil T celle potens. Selv om den xCELLigence-baserede styrke analyse, der er beskrevet her, kan anvendes til vurdering af cellebaserede terapier under fremstillingen, eller før den frigives til klinisk anvendelse, er det endnu ikke blevet påvist, hvor godt disse resultater korrelerer med in vivo-effekt Etableret. In vivo effekt afhænger af en række faktorer og variabler, som ikke kan gentages i en in vitro-analyse. Sådanne variabler omfatter: homing af bilen T celler til stedet for tumoren, stimulering og aktivering af bilen T celle og dens evne til at fortsætte inden for patienten, og tumor mikromiljø. Med yderligere raffinement xCELLigence assay kan være i stand til at modellere nogle af disse komplekse processer in vitro.
Protokollen forudsat her gælder for de fleste vedlige Cancer cellelinjer og nogle af de flydende tumorcellelinjer. Kliniske prøver såsom primære cancerceller, dog, skal testes yderligere og optimeres på grund af kompleksiteten af tumortyper og faser. Det er bestemt værd at bemærke, at in vitro-styrken analyse system, der er beskrevet her, bruger Cancer cellelinjer kun for at afspejle den potentielle aktivitet af bilen T-celler. Den virkelige tumor situation inde i den menneskelige krop er meget mere kompleks, især når en solid tumor er målrettet, på grund af den dynamiske tumor miljø og udvikling. Derfor kan styrken evaluering resultat ikke oversætte meget godt i den kliniske effekt af de testede bil T-celler.
Kort sagt, den præsenterede impedans-baserede xCELLigence platform tillader label-fri overvågning af celle drab i en længere periode, nemlig op til 10 dage. Denne kapacitet til en så lang tidsmæssig skala for dataindsamling differentierer teknologien fra andre analyser, der i øjeblikket er i brug, og som kræver opsætning af flere eksperimentelle replikater til tidspunkt indsamling og omstændelig prøve manipulation. Desuden forenkler det minimale signal bidrag fra Effector immuncellerne dataanalyse. Softwaren kan behandle data automatisk og generere nyttige parametre såsom procentdelen af cytolyse, KT50, etc. Teknologien har allerede vist høj følsomhed (med E:T ratio så lavt som 1:20) og et stort dynamisk område (med E:T nøgletal fra 20:1 til 1:20), som ikke let opnås med andre assays. Samlet set bør gennemførelsen af denne teknologi give mulighed for en mere præcis dataanalyse på en højere gennemløbs skala, der vil forbedre udviklingen af bil T-celle reagenser, fremme feltet i et meget højere tempo.

I de seneste år, bil T-celleterapi har været en af de mest fremtrædende gennembrud i Cancer immunterapi for recidiverende og refraktære hæmatopoietiske maligniteter. Med den seneste amerikanske Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af CD19-instrueret bil T celler for akut lymfoblastær leukæmi, non-Hodgkin lymfom, og diffus stor B-celle lymfom, og udpegelsen af gennembrud terapi for B-celle modning antigen (bcma)-instrueret bil T celler for multipelt Myeloma, denne teknologi har genereret stor spænding i det videnskabelige samfund og har næret talrige grundlæggende, anvendt, og kliniske undersøgelser på verdensplan1,2,3, 4,5. I januar 2019 blev der registreret mere end 700 kliniske forsøg i databasen over kliniske forsøg (clinicaltrials.gov). omkring 450 af disse forsøg var enten ved at starte eller var aktivt at rekruttere patienter. De fleste af de kliniske forsøg er fokuseret på hæmatologiske maligniteter, og kliniske forsøg udnytter bil T celler rettet mod CD20, CD22, og bcmas, ud over CD19, er i gang samt6,7. Mens de fleste af de forsøg, der bruger autologt bil t-celleterapi, et betydeligt antal af dem er også at udforske nytten af allogen bil t celler8,9,10. Trods lovende resultater med hæmatologiske maligniteter, brugen af bil T celler til at målrette solide tumorer har vist sig at være langt vanskeligere i klinikken for en række forskellige årsager, herunder men ikke begrænset til manglen på gode mål, der udelukkende udtrykkes i tumoren, heterogeniteten af solide tumorer og tumor "undslippe", og den vanskelighed, at bil T celler har i adgang til tumor mikromiljø11,12,13,14, 15. der er et kritisk behov for udvikling af solide TUMOR specifikke bil-T-celler, som kan overvinde disse barrierer for effektivitet og problemet med "on Target-off tumor" toksicitet. Mens et væld af in vitro og in vivo tilgange er berettiget i design og afprøvning af bil T-celler, en robust og forudsigende in vitro-styrke analyse er af primær betydning16,17.
For at vurdere styrken af bil T-celler, forskellige in vitro-metoder er blevet udviklet. Generelt kan disse potens analyser opdeles i to brede kategorier, afhængigt af om de (i) direkte måler den cytolytiske aktivitet af bil t-celler mod måltumor celler, eller (II) måler surrogatmarkører som cytokiner, der frigives af bilens t-celler, da de dræber målcellerne. Teknikker, der måler cytolytisk aktivitet direkte omfatter chrom-51 Release assay (CRA)18, Imaging-baserede assays, som måler apoptose af målceller ved hjælp af fluorescerende sonder19,20, og flow flowcytometri assays at detektere apoptotiske mål celler21. I disse assays, er bil T celler typisk Co-kultiveret med målceller, som er blevet præ-mærket med radioaktive eller fluorescerende sonder, efterfulgt af passende måling. Selv om det længe har været betragtet som guldstandarden på området på grund af sin følsomhed, CRA har nogle ulemper. For det første er det en endepunkts analyse og giver ikke kinetisk information. For det andet skal målcellerne mærkes med chrom-51, som har tendens til at udtrænge ud af cellerne og kan øge baggrundsstøjen22markant. Endelig kræver det passende forholdsregler og bortskaffelse af det radioaktive affald. Alternative assays, som måler biprodukter af bil T-celle interaktion med målceller som en indikation af potens, omfatter kvantitation af forskellige cytokiner frigivet af bil T-celler ved hjælp af enten flow cytometri-baserede metoder eller enzym-sammenkædede immunosorbent assays. Endnu en gang er der tale om endepunkts analyser, som måler den kumulative frigivelse af cytokinerne på et givet tidspunkt, og som således ikke nødvendigvis afspejler den faktiske cytolytiske aktivitet i bil-T-cellerne.
Ved udvikling af en styrke analyse, især en, der definerer frigivelse kriterier for en celle-baseret terapi såsom en bil T-celle, er det afgørende, at analysen involverer minimal manipulationer og hands-on tid, fordi hver interaktion er en anden variabel, der skal regnskabsmæssigt og kan mindske den samlede robusthed og konsistens af analysen. Desuden er samspillet mellem bil T-celler med tumorcellerne en dynamisk proces, og tilvejebringelse af oplysninger om disse dynamiske interaktioner, såsom hastigheden af cytolyse, er af største betydning for styrke evaluering. Med disse kriterier i tankerne, vi udviklet en label-fri kinetiske styrke assay for bil T-celler, der udnytter xcelligence real-time celle analyse (rtca) platform. xCELLigence udnytter specialiserede mikrotiterplader (E-plader), der indeholder guld biosensorer indlejret i bunden af hver brønd. Arbejde med enten klæber solide tumorceller, eller flydende kræftceller, der er blevet tøjret ved hjælp af specifikke antistoffer, disse biosensorer overvåge i realtid bil T celle-induceret ændringer i Target celle nummer, Cellestørrelse, celle-substrat vedhæftningsstyrke, og celle-celle interaktioner (dvs. barriere funktion)17,23,24,25,26,27,28. Arbejdsprocessen er enkel og involverer blot såning målcellerne i brøndene af E-plader, efterfulgt af tilsætning af bilen T celler ved forskellige Effector-til-mål nøgletal (figur 1). Efterfølgende, da Biosensorerne løbende overvåger levedygtigheden af målcellerne, vises dataene automatisk i realtid.
I løbet af de sidste 15 år xcelligence assay er blevet valideret til vurdering af styrken af naturlige Killer (NK) celler, t-celler, bil T-celler, check point-hæmmere, bispecifikke antistoffer, onkolytisk vira, og nogle Kombinationsbehandlinger17,29,30,31,32,33,34. For nylig blev xCELLigence-styrke analysen evalueret for fremstilling af T-celle receptor (TCR)-konstruerede T-celler35. Her rapporterer vi ansætte RTCA system til at evaluere in vitro-styrken af bil T-celler designet til at målrette faste tumorer og flydende tumorer i kliniske behandlinger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

Chimeric antigen receptor (bil) T-celleterapi for kræft har opnået betydelige kliniske fordele for resistente og refraktære hæmatologiske maligniteter såsom barndom akut lymfocytisk leukæmi. Indsatsen er i øjeblikket i gang for at udvide denne lovende terapi til solide tumorer i tillæg til andre hæmatologiske kræftformer. Her beskriver vi udviklingen og produktionen af potente bil T-celler rettet mod antigener med unikke eller præference udtryk på faste og flydende tumorceller. In vitro-styrken af disse bil T-celler evalueres derefter i realtid ved hjælp af den meget følsomme impedans-baserede xCELLigence-analyse. Specifikt, virkningen af forskellige costimulatory signalering domæner, såsom glukokortikoid-induceret tumor nekrose faktor receptor (TNFR)-relaterede protein (GITR), på in vitro-styrken af bil T celler undersøges. Denne rapport indeholder protokoller for: generering af bil T-celler til prækliniske studier ved hjælp af lentiviral gentransduktion, ekspanderende bil-T-celler, validering af bilekspression og kørsel og analyse af xCELLigence potens assays.

BIL lentivirus forberedelse og bil T-celle generation og styrke vurdering De titre af CAR lentivirus præparater blev bestemt ved hjælp af en kvantitativ RT-PCR Kit (Se tabellen over materialer) i henhold til fabrikantens protokol. Titrerings protokollen udvundet virus RNA først og derefter målt lentiviral RNA kopi nummer, som indikerede mængden af infektiøse virale partikler. Titer af virus genereret fra 1 150 mm parabol ved hjælp af ovenstående protokol normalt spænder mellem 109-1010 virale kopier/ml. Figur 2A viser RT-PCR-cyklus nummeret vs. signalstyrken fra et repræsentativt kvantitativt PCR-resultat. Når virus kvaliteten var opfyldt, da titer var større end 1 x 108 PFU/ml, det blev frosset ned for efterfølgende T-celle transduktion. Efter at bilen T celler blev transduceret med lentivirus, T-cellerne blev dyrket i yderligere 12-14 dage, opretholde deres tæthed omkring 1 x 106 til 2 x 106 celler/ml. BIL T-cellerne blev derefter kontrolleret med anti-ScFv-specifikke antistof ved hjælp af et flow flowcytometer før en downstream-applikation eller fryse ned. En god repræsentativ batch resultat er vist i figur 2B. Ved hjælp af anti-ScFv antistoffer, omkring 50% af bilen T celler farvede positive (Q2 50,6% vs. T-celler 1%), hvilket indikerer ekspression af bil i omkring 50% af T-cellerne. Efterfølgende blev RTCA-styrke analysen udført for cytolyse bestemmelse, før hver batch af bil T-celler blev frosset ned og klar til fremtidig anvendelse. En cyklus af bilen T-Cell design, generation, og vurdering procedure tog omkring 1 måned.
Drab af Raji lymfomer B-celler af CD22-bil T-celler Anti-CD40 Liquid tumor tethering Kit (Se tabellen over materialer) blev anvendt i en koncentration på 4 μg/ml til at belægge en E-plade for 3 h ved 37 °c. Efter vask brøndene med tethering buffer, B-celle lymfomer celler blev føjet til E-pladen ved en tæthed af 30.000 celler/godt. Efter at have ladet cellerne bosætte sig i 30 minutter blev E-pladen placeret tilbage inde i xCELLigence instrumentet, og impedans målinger blev straks initieret for at fange celle fastgørelse og spredning. Den følgende dag blev der tilføjet enten CD22-bil T-celler, mock-bil-T-celler eller ikke-transducerede T-celler. I figur 3blev der anvendt et E:T-forhold på 10:1 for alle celletyper. CD22-positive Raji-celler, behandlet med CD22-bil T-celler, viste signifikant drab (grønt spor) sammenlignet med de negative kontroller (utransducerede T-celler og mock CAR T-celler).
Effektiv drab af bugspytkirtelkræft celler af CD47-bil T-celler CD47 er en transmembran overflade glykoprotein af immunglobulin super familie. Som en integrin-associeret protein, det er stærkt udtrykt i både hæmatologiske kræftformer (leukæmi, lymfom, og multipelt Myeloma) og solide kræftformer (såsom æggestokkene, småcellet lungekræft, pancreas, glioblastoma) og andre typer af kræft36,37. CD47 er også kendt som en ikke-spise-mig signal til makrofager, som har gjort det en potentiel terapeutisk mål i nogle kræftformer. CD47-bil T-celler blev produceret og testet mod BxPC3 kræftceller i bugspytkirtlen, som udtrykker høje niveauer af CD4738,39. BxPC3 celler blev seedet i E-pladen på dag 1 ved en tæthed på 10.000 celler/godt. Realtidsovervågning viste, at disse celler nåede konfluency efter 16 timer. På dette tidspunkt blev der tilføjet bil T-celler ved E:T-forholdet på 10:1 (figur 4A). Kontrol Effector celler som ikke-transducerede T-celler og mock bil T-celler blev også tilføjet. Resultaterne viser tydeligt, at CD47-bil T-celler selektivt dræber målet BxPC3 cellerne29. Figur 4B viser også, at impedans signalet, når CD47-Car T-celler tilsættes til en tom brønd, er væsentligt lavere end impedans signalet genereret af Target BxPC3 cells. Celle indeksværdien fra brønde med CD47-bil T-celler alene nåede et maksimum på 0,14, som kun er lidt højere end signalet fra medium alene (0,02). Dette indikerer, at i denne heterogene drab analyse, impedans signalet er afledt næsten udelukkende fra målet kræftceller.
Costimulation af bil T celler af GITR domæne Når udtrykt i en EGFR-GITR-CD3 bil, GITR costimulatory domæne blev tidligere rapporteret at forbedre drab af EGFR-positive SKOV3 cancerceller, men ikke EGFR-negative MCF-7 cancerceller30. For bedre at afklare rollen af GITR domæne, BILKONSTRUKTIONER, der indeholder fuld længde GITR domæne, eller slettede eller omarrangerede versioner af domænet, blev genereret og testet for evnen til at coactivate bil T-celler (figur 5A). Den xCELLigence data i figur 5B, C viser, at gitr costimulatory domæne øger bil T celle drab af EGFR-positive mål celler over, hvad der er observeret med den oprindelige bil konstruere som mangler gitr domæne. Desuden, sletning af 10 aminosyrer fra GITR domæne (aminosyrer 184-193) afskaffet denne stimulerende aktivitet. I modsætning hertil, omarrangere den relative positionering af GITR domæne i bilen konstruere viste sig at være mindre skadelig for dens stimulerende kapaciteter. Brug af slutpunkt data, IFNγ produktion som en surrogat af T-celle aktivering viste også den stimulerende aktivitet af GITR domæne (figur 5B). I modsætning til slutpunkts data, som blot er "snap shot", belyser xCELLigence-instrumentets kontinuerlige impedans profil tydeligt subtile forskelle i de forskellige behandleres dræbende kinetik (figur 5C). De resultater, der opnås her, stemmer overens med resultaterne af en in vivo-undersøgelse30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Figur 1: RTCA-systemet (real-time Cell Analysis) i xCELLigence registrerer aflivning af målceller ved effektor celler. Der er tre vigtigste konceptionelle skridt til at måle drab aktivitet af bil T Effector celler mod Target cancerceller. Trin 1: frø målcellerne (dvs. tumorceller) ind i brønden af en E-plade. Cellerne tillægger guld biosensor mikroelektroderne, og dette hæmmer strømmen af elektrisk strøm mellem elektroderne. Denne impedans værdi måles og afbildes som en enhedsløs parameter kaldet celle indeks. Celle indeksværdien øges, når cellerne vokser og når et plateau, når cellerne nærmer sig sammenløbet. Trin 2: Effector celler-ikke-vedhængende immunceller-tilsættes efterfølgende. Da disse celler ikke overholder guld mikroelektroderne, forårsager de ikke direkte en impedans ændring. Trin 3: Hvis Effector cellerne angriber målet cancerceller, er ødelæggelsen af tumorcellerne afspejlet af et fald i celle indekset over tid. Denne cytolytiske aktivitet af Effector celler, eller styrken af Effector celler, kan være sensitivt og præcist overvåges. Den kontinuerlige erhvervelse af impedans data fra xCELLigence-systemet gør det muligt at dræbe kinetisk analyse i realtid for flere tilstande samtidigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Figur 2: måling af lentivirus-og flowcytometri-vurderingen af bil-T-cellerne. A) bestemmelse af lentiviral titer. De forskellige farve linjer er repræsentative prøver for cyklus nummer vs. Delta RN. lav cyklus tal indikerer en relativt høj mængde virus RNA skabelon til stede i prøverne. B) efter transduktion blev bil-T-celler dyrket og vedligeholdt med en densitet på mindre end 2 x 106 celler/ml og derefter underkastet strømnings analyse. Y-aksen afspejler farvning for T-celler, med positive værdier afspejlet i områder Q1 og Q2. Begge prøver er 100% positive for T-celler. Ekspression af bil scFV bestemmes ved hjælp af en scFv-specifik AB (x-akse). Resultatet viser, at mere end 50% af T-cellerne er scFv positive i CD22-bil T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Figur 3: dræber dynamikken i CD22-Car T-celler mod Raji Burkitt's lymfomer celler. Mens den røde kurve er de Raji celler alene, den grønne kurve er de Raji celler behandlet med CD22-bil T-celler. Den lyserøde og blå kurver er mock bil T-cellebehandling og ikke-transduceret T-cellebehandling, hhv. E:T-forholdet er 10:1. Fejllinjer er standardafvigelse. Tidsskalaen er sat op med 2 h intervaller for nem visning, selv om flere datapunkter er tilgængelige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Figur 4: effekten af CD47-bil T-celler mod pancreas solide tumorceller. (A) pink er målet BxPC3 celler alene, mens rød er BXPC3 med CD47-bil T-celler tilføjet. Grøn er BxPC3 med tilsætning af ikke-transducerede T-celler, og blå er med mock bil T-celler. E:T-forholdet er 10:1. (B) i samme indstilling, rød er tom (mangler målceller) kontrol BRØNDE med CD47-bil T-celler kun og grøn er mediet kun. Fejllinjer er standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Figur 5: GITR domæne øger bil T celle cytotoksiske aktivitet mod EGFR-positive tumorcellelinjer. A) forskellige bilkonstruktioner. (B) bar plots af% cytolyse for forskellige bilkonstruktioner på 4 h (venstre) og 24 h (midten). IFNγ produktion på 24 h er vist til højre. (C) kontinuerlig drab evaluering for alle konstruktioner. Den sorte kurve er vækstkurven for BxPC3 kræftceller i æggestokkene kun. Den grønne kurve er de målceller, der kun behandles med T-celler, den blå kurve er målcellerne behandlet med mock CAR T-celler, den røde kurve er målcellerne behandlet med EGFR-GITR-CD3-CAR T-celler, den lyserøde kurve er målcellerne behandlet med EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T-celler, og den brune kurve er målcellerne behandlet med EGFR-CD3-GITR-CAR T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Vi beskriver en kvantitativ Real-Time in vitro cytolyse assay system til at evaluere styrken af chimerisk antigen receptor T celler rettet mod flydende og solide tumorceller. Denne protokol kan udvides til at vurdere andre immun Effector celler, samt Kombinationsbehandlinger.

En real-time styrke assay for Chimeric antigen receptor T celler rettet mod solide og hæmatologiske cancer celler

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence cellanalyse i realtid giver dig mulighed for kvantitativt at overvåge aflivning af kræftceller af immunceller under etiketfrie forhold og i løbet af flere dage. Dette system giver et komplet tidsforløb af målkræft celle drab tillader samtidig screening af et stort antal konstruktioner, effektor celletyper, eller kombinationsbehandlinger ved lav effektor til målforhold. Begynd med at så 1,5 gange 10 til de syv HEK293FT celler i DMEM kultur medium i en 150 milliliter cellekultur fad til en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med fugtighed.Næste morgen blandes 2,5 milliliter transfektionfortyndingsopløsning suppleret med fem mikrogram lentiviral vektorplasmid-DNA og 22,5 mikrogram lentiviral emballageblanding med 82,5 mikroliter transfektionsreage hos 2,5 milliliter transfektionfortyndingsopløsning. Efter en 15 minutters inkubation ved stuetemperatur, overføre reaktionsfaldet klogt ind i skålen af HEK293FT celler og returnere cellerne til inkubatoren i en anden natten inkubation. Den næste morgen, erstatte supernatant med 19 milliliter frisk DMEM kultur medium og returnere cellerne til kuvøse natten over.Supernatanten opsamls i et enkelt 50 milliliter konisk rør i fire grader Celsius-opbevaring i de næste to dage, før den udvisker lentivirus ved centrifugering den anden morgen for at fjerne celler eller snavs fra opløsningen. Overfør alle, men omkring en milliliter af lentivirus indeholdende supernatant til en ultra klar centrifuge rør til ultracentrifugering. Efter ultracentrifugering, omhyggeligt aspirere den resterende virus, der indeholder supernatant, forsigtigt tilføje 100 mikroliter DMEM til pellet, og placere røret på is i 15 minutter.Ved inkubationens afslutning blandes opløsningen forsigtigt, og lentivirusopløsningen anbringes i forkølede sterile rør til opbevaring ved minus 80 grader Celsius. Derefter bestemme titer af lentivirus ved kvantitativ RT-PCR i henhold til producentens anvisninger. Til generering og ekspansion af CAR-T-celler aktiveres en til to gange 10 til de seks perifere mononukleare celler i en milliliter CAR-T-cellemedium med et tilsvarende antal CD3/CD28-belagte mikroperler i en brønd af en 24-brøndplade i cellekulturkubvøsen i 24 timer.De følgende to morgener blandes en mikroliter af transduktionsforstærker med cellerne efterfulgt af tilsætning af lentivirus ved en mangfoldighed af infektion på fem til en. T-cellevæksten overvåges hver anden til tredje dag og tilsættes frisk CAR-T-cellemedium efter behov for at holde cellerne på en en til to gange 10 til de seks celler pr. milliliterkoncentration. For at detektere T-celle CAR-ekspression ved flowcytometri overføres tre gange 10 til de femte CAR- og ikke-transucerede T-celler til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Cellerne opsamls ved centrifugering og opstimer pellets i 200 mikroliter FACS-buffer suppleret med 1% humant serum. Opdel hver celleprøve i 100 mikroliter aliquots i individuelle fem milliliter polystyren FACS rør på is. Efter fem minutter tilsættes en mikroliter biotinyleret FAB2-fragmenter af ged-antimusen FAB2 til et rør af hver celletype og to mikroliter PE-mærket anti-tag antistof til det andet rør af hver celletype med grundig blanding.Efter 30 minutter på is vaskes cellerne med tre milliliter frisk FACS-buffer og efter centrifugering dekantere supernatanterne. Opslæm pellets i de resterende supernatant og tilsæt to mikroliter af APC anti-CD3 og to mikroliter af 7-AAD til hvert rør. Tilsæt en mikroliter AF PE-mærket Streptavidin med kort blanding til røret plettet med anti-FAB2 antistof og inkubere alle rørene på is i 30 minutter.Ved slutningen af inkubationen analyseres cellerne ved flowcytometri i henhold til standardprotokoller, der gatinger T-cellerne ved fremadspistning versus side scatter og CD3 versus 7-AAD udtryk. For en real-time cytolyse potens assay, tilføje 50 til 100 mikroliter af målcellekultur medium til hver brønd af en e-plade og måle baggrunden impedans i en celle analysator instrument. Detekter målkræftcellerne fra kulturpladen ved hjælp af trypsin.Vask cellerne i 15 milliliter frisk kulturmedium og centrifuge. Resuspend kræftcelle pellet i fem milliliter frisk medium til optælling og justere celletætheden til den relevante målcellekoncentration. Tilsæt cellerne til det passende antal brønde og lad e-pladen i 30 minutter ved stuetemperatur, så cellerne kan sætte sig jævnt på bunden af brøndene.Ved afslutningen af ækvilibreringsperioden skal pladen i realtidscelleanalysatoren og automatisk påbegynde målingen af impedansen hver 15. Vedhæftning og spredning af målcellerne kan spores i realtid. Næste morgen fortyndes effektoren CAR og kontroller T-cellerne til den rette koncentration i de enkelte rør, og 50 til 100 mikroliter fjernes fra hver brønd af e-pladen, så det endelige volumen i hver brønd er 100 mikroliter.Dernæst frø effektoren og kontrol T-celler i de relevante brønde på passende effektor til mål nøgletal i 100 mikroliter af medium pr brønd. Derefter jævnbyrde e-pladen i 30 minutter ved stuetemperatur, før du returnerer pladen til celleanalysatorsystemet. For at måle effekten af T-cellen medieret drab af målet kræftceller, overvåge CAR-T medieret drab i 96 timer.Omkring 50% af CAR-T-cellerne forblev positive for anti-single kæde variabel fragment antistof, der angiver udtrykket af CAR i omkring 50% af T-cellerne. I dette repræsentative eksperiment blev der anvendt en 10-1 effekt eller mål-forholdet for alle grupperne. Kun Raji-celler og CD22-CAR T-cellebehandlede Raji-celler viste signifikant drab sammenlignet med kun kontrol-T-cellen og Mock CAR-T-cellegrupper.I dette eksperiment, kun CD47-CAR-T celler var effektive til at dræbe kræft i bugspytkirtlen celler. Desuden var impedanssignalet fra CD47-CAR-T-cellerne alene kun lidt over celleindekssignalet målt i mediet alene brønde, hvilket indikerer, at impedanssignalet fra suspensionsceller som CAR-T-celler er minimalt og ikke bidrager til det samlede impedanssignal, når CAR-T-celler føjes til målkræftcellerne. Især blev GITR-co-stimulatorisk domæne observeret for at være mere effektivt til at forbedre CAR-T-celledrab mod epitelvækstfaktorreceptor positive målceller sammenlignet med originale CAR-konstruktioner uden GITR-domænet.Mediet fra e-pladeblyde kan indsamles for at analysere cytokinprofilen på tidspunkter enten under eller efter analysen i henhold til eksperimentets behov. Samlet set har xCELLigence forbedret effektiviteten af evalueringen af styrken af forskellige immunterapier lige fra bispecifikke T-celleprotektorer og onkolytiske vira til immunkontrolpunktshæmmere i kombinationsbehandlinger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk anvendelse af<em&gt; Tornerose</em&gt; Artificial og antigen-præsenterende celler til genetisk at modificere T-celler fra perifert og navlestrengsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Fremstilling af tumorantigen-loaded dendritiske celler til immunterapi

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantificering af T-celle receptor Resektion cirkler (TRECs) og K-Sletning Recombination Resektion cirkler (KRECs) af Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...