Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

De auteurs bedanken ProMab Biotechnologies en ACEA Biosciences voor het leveren van de reagentia en instrumenten die in deze studie worden gebruikt.

1. generatie van auto-encoding lentivirus
Let op: zodra de specifieke auto T-cel plasmide constructie is voltooid (CD47 en anderen), worden lentivirale Auto's gegenereerd door de standaardprocedure, met behulp van 293 FT-cellen, een linviraal verpakkings mengsel en transfectie agenten (Zie de tabel met materialen) zoals beschreven29. Gebruik vervolgens een kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR)-Kit en een thermische cycler (Zie de tabel met materialen) om het virus titer te bepalen door het LENTIVIRALE RNA-bedrag te meten volgens het Protocol van de fabrikant. Het is belangrijk dat alle linvirale procedures strikt worden uitgevoerd volgens de veiligheidseisen.
<ol><li>Zaad 15 x 106 HEK293FT cellen in dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) en incueren de cellen 's nachts bij 37 ° c in 1 150 mm schotel in een bevoficeerde 5% Co2 incubator.</li>
	<li>Bereid 2 15 ml buisjes met transfectie complex. De eerste buis bevat linviraal vector plasmide DNA (5 μg) en linviraal verpakkings mengsel (22,5 μg) in 2,5 mL transfectie verdunnings oplossing. De tweede buis bevat 82,5 μL transfectiereagens in 2,5 mL transfectie oplossing (Zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Pipet teren van de inhoud van buis 1 in buis 2, en inbroed het mengsel bij kamertemperatuur 15 min.</li>
	<li>Breng de inhoud van de buis druppelsgewijs over naar het Gerecht van HEK293FT cellen en incuberen het monster 's nachts bij 37 °c in een incubator met 5% Co2 met bevoficatie.</li>
	<li>De volgende dag wordt het bestaande medium vervangen door 19 mL vers DMEM-kweekmedium en blijven de cellen 's nachts in de bevoficeerde 5% CO2 -incubator bij 37 °c incueren.</li>
	<li>Breng het medium van de schaal over in een centrifugebuis van 50 mL. Houd de buis met het virus-bevattende medium in de koelkast.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande procedure, het toevoegen van verse DMEM en het verzamelen van het na 1 dag.</li>
	<li>Combineer twee collecties van de media in één centrifugebuis. Centrifugeren van de buis bij 2.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c.</li>
	<li>Breng het grootste deel van het lentivirusbevattende supernatant over naar een glas centrifugebuis. Laat een minimum volume van ongeveer 1 mL van het supernatant achter om te voorkomen dat de pellet die cellen en/of puin kan bevatten, wordt verstoord.</li>
	<li>Ultracentrifuge de bovenstaande geklaarde supernatant bij 110.000 x g voor 100 min bij 4 °c.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig en voeg 100 μL DMEM medium toe aan de virus pellet aan de onderkant van de buis. Laat de buis 15 min op ijs liggen en meng de oplossing zachtjes en aliquot de lentivirusoplossing in voorgekoelde steriele buisjes. Bewaar deze virus voorraad buisjes in een vriezer van 80 °C.</li>
	<li>Gebruik een kwantitatieve RT-PCR-Kit om de titer van het lentivirus te bepalen volgens het Protocol van de fabrikant, dat linviraal RNA extraheert en meet.</li>
</ol>2. generatie en uitbreiding van auto T-cellen
<ol><li>Activeer eerder bevroren humane PBMCs (ongeveer 1 x 106 tot 2 x 106 cellen) in 1 ml auto T-cel medium met een gelijk aantal CD3/CD28-gecoate Microbeads (Zie de tabel van de materialen) en inculaderen de cellen bij 37 ° c in een bevoficeerde 5% Co2 broedplaats voor 24 uur.</li>
	<li>Een aliquot van de lentiviruskolf op ijs ontdooien.</li>
	<li>Voeg 1 μL transductie-agent toe aan de put met de cellen en meng.</li>
	<li>Voeg lentivirus toe aan de cellen met een veelvoud van infectie (MOI) van 5:1 en meng zachtjes. Herhaal deze stap op de volgende dag (24 uur na de eerste transductie).</li>
	<li>Monitor de T-celgroei elke 2-3 dagen. Voeg meer Fresh CAR T-Cell medium toe om de cellen te behouden met een dichtheid van 1 x 106 tot 2 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Freeze de auto T cellen met een standaardprotocol met behulp van bevriezing oplossing (Zie de tabel van de materialen).</li>
	<li>Dooi auto T-cellen met behulp van een standaardmethode en preculture ze in de auto T-cel medium voor ongeveer ~ 2-4 h met IL-2 (300 eenheden/mL) voordat u ze toepast op de assay.</li>
</ol>3. detectie van auto-expressie door flow cytometrie
<ol><li>Breng 3 x 105 auto t-cellen en niet-Transduced t-cellen over naar twee afzonderlijke 1,5 ml micro centrifugebuizen.</li>
	<li>Centrifugeer de buisjes op 300 x g gedurende 2 minuten en breng de cellen opnieuw in 200 μL fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer met 1% humaan serum.</li>
	<li>Pipet maal 100 μL celoplossing in twee buisjes van 5 mL polystyreen en houd de buisjes 5 min op het ijs.</li>
	<li>Voeg 1 μL biotinyleerd Goat anti-Mouse F (AB ')2 toe aan één buis van elk celtype. Voeg vervolgens 2 μL PE-gelabelde anti-tagantistof (Zie de tabel met materialen) toe aan de andere buis van elk celtype. Meng goed en inbroed ze 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Was de cellen met 3 mL FACS buffer in elke buis en centrifugeer de buisjes bij 300 x g gedurende 5 minuten; Gooi de supernatanten en Vortex heel kort weg of schud de buisjes kort om de cellen in de restvloeistof te hervatten.</li>
	<li>Voeg 2 μL APC anti-CD3 en 2 μL 7-AAD-antilichaam oplossing (Zie de tabel met materialen) toe aan elke buis. Voeg in de buis van cellen die zijn gekleurd met anti-F (AB ')2 AB, 1 μL PE-gelabelde streptavidin toe. Meng kort en inbroed de buisjes op ijs gedurende 30 min.</li>
	<li>Gebruik FACS buffer om de cellen opnieuw te wassen zoals beschreven in stap 3,5 en voeg een extra 200 μL FACS buffer toe aan elke Tube.</li>
	<li>Gebruik flow flowcytometrieonderzoeken om de cellen te analyseren door eerst te gating op de T-cellen in een forward Scatter versus side Scatter plot en vervolgens gating op de Live cellen (7-Aad-Negative) in een CD3 vs. 7-Aad plot. De laatste stap is het analyseren van anti-tag, anti-ScFv of anti-F (AB ')2 vs. CD3.</li>
</ol>4. real-time cytolysis-potentie test
Opmerking: Voer de RTCA-test uit volgens de aanbevolen voorwaarden van de fabrikant. In het kort, eerste plaat de doelcellen in de putjes van de E-plaat, gevolgd door de toevoeging van auto T cellen op de volgende dag. De cytolysisactiviteit van auto T-cellen tegen doelcellen wordt in real-time bewaakt. T-cellen en mock-transduced T-cellen (mock CAR T-cellen) worden gebruikt als negatieve Effector cel besturingselementen. Het volgende protocol beschrijft een in vitro real-time cytolysis potentie assay voor aanhandige tumor cellijnen.
<ol><li>Voeg 100 μL doel celkweekmedium toe aan elke put van de xCELLigence E-plaat, plaats de plaat in het xCELLigence-instrument en maak een achtergrond lezing. Breng vervolgens de E-plaat over naar een weefselkweek kap voor het zaaien van cellen.</li>
	<li>Gebruik een standaardprotocol te trypsinize doel kankercellen van het cultuur apparaat. Breng vervolgens de cellen over naar een centrifugebuis van 15 mL en voeg een vers kweekmedium toe, tot 15 mL. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 200 x g. Gooi het supernatant weg, voeg 5 mL vers medium toe en gebruik een serologische pipet om de celpellet voorzichtig te hervatten. Tel de dichtheid van levende cellen met behulp van een hemocytometer en Microscoop.</li>
	<li>Pas de celdichtheid op de juiste wijze aan en voeg vervolgens 100 L van de celsuspensie toe aan elk goed van de E-plaat. Het doelcel nummer is meestal ongeveer 10.000 cellen/goed voor aanhandende cellijnen (BxPC3, Hela-CD19 en SKOV3), of 30.000 cellen/goed voor suspensie cellen zoals Raji (zie hieronder voor details met betrekking tot precoating putten met antilichamen om vloeibare kankercellen te Tether).</li>
	<li>Laat de E-plaat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur komen om de cellen gelijkmatig op de bodem van de put te laten vestigen (dit is van cruciaal belang; sla deze stap niet over).</li>
	<li>Plaats de E-plaat in het xCELLigence instrument in de celkweek incubator en begin met het meten van de impedantie, weergegeven als celindex versus tijd, automatisch elke 15 minuten.</li>
	<li>De volgende dag, voor te bereiden Effector auto T cellen. Zorg ervoor dat u de juiste besturingselementen (d.w.z. mock CAR T-cellen, niet-transduced Control T-cellen en/of niet-gerelateerde auto T-cellen) voortijdig voorbereidt om ervoor te zorgen dat alle cellen op hetzelfde moment klaar zijn. Pas de Effector cellen en de controle cellen aan de juiste dichtheid aan en bereid seriële verdunningen om ervoor te zorgen dat de gewenste E:T-verhoudingen worden bereikt wanneer 100 μL Effector celsuspensie aan elk goed wordt toegevoegd in stap 9.</li>
	<li>Pauzeer xCELLigence data-acquisitie en breng de E-Plate van de incubator naar een celcultuurkap.</li>
	<li>Verwijder 100 μL medium van elke put. De hoeveelheid rest medium in elke put is nu 100 μL.</li>
	<li>Voeg 100 μL van de seriële verdunde Effector auto T-cellen of andere controle cellen (d.w.z. mock CAR T-cellen) toe om de gewenste E:T-verhoudingen te bereiken.</li>
	<li>Laat de E-plaat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur komen, zodat Effector cellen zich kunnen vestigen en plaats de E-plaat weer in het xCELLigence-instrument. Het verzamelen van gegevens hervatten.</li>
	<li>Indien gewenst, op sleutel tijdpunten xCELLigence gegevensverzameling kan worden onderbroken en de plaat verwijderd om kleine monsters te verzamelen om te worden geanalyseerd door orthogonale assays (d.w.z. het meten van cytokine productie door ELISA of flow cytometrie).</li>
	<li>Meet in het EGFR-GITR-CD3 CAR T-Cell experiment de INFγ-opbrengst met een ELISA-pakket (volg de instructies van de fabrikant; Zie de tabel met materialen). Opmerking over het gebruik van vloeibare KANKERS: voor het testen van niet-aanhandende hematologische kankercellen, voorafgaand aan het toevoegen van cellen worden de putjes van de E-plaat eerst bekleed met een antilichaam dat specifiek is voor een antigeen dat wordt uitgedrukt op het oppervlak van de kankercellen. Voor de Raji B-cellijn wordt een Tethering-reagens op basis van anti-CD40 gebruikt (Zie vloeibare tumordodende assay-kit in de tabel met materialen). Hieronder is de procedure voor het coaten van de plaat:</li>
	<li>Verdun het Tethering-reagens (anti-CD40) met een Tethering buffer tot een concentratie van 4 μg/mL.</li>
	<li>Werk binnen een weefselkweek afzuigkap, voeg 50 μL van het verdunde Tethering-reagens toe aan elk goed van de E-plaat. Laat de E-plaat bij kamertemperatuur of in een incubator van 37 °C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Verwijder het Tethering-reagens en was de E-plaat minimaal 2x met de reinigings buffer. Op dit punt is de E-plaat klaar voor het zaaien van de Raji-doelcellen (30.000-cellen/goed).</li>
	<li>Ga verder met stap 4,1 (hierboven) om de rest van de procedure uit te voeren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+Therapy:+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy.">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>June, C. H., O&#8217;Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>. FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017)</li><li>. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017)</li><li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China.">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology &#38; Oncology. 10 (1), 166 (2017).</li><li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy.">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li><li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells.">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li><li>. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017)</li><li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf.">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li><li>D&#8217;Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &#38; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors.">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li><li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric-antigen+receptor+T+(CAR-T)+cell+therapy+for+solid+tumors:+challenges+and+opportunities.">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors.">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li><li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy.">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li><li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis.">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li><li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+chromium-51+release,+cell-mediated+cytotoxicity+assay:+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells.">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li><li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry.">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).</li><li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse.">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Unit+7:+51Cr+release+assay+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+(ADCC).">Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).</a> Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements.">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li><li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays.">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li><li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability.">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li><li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies:+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels.">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering &#38; Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li><li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth.">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li><li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer.">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation.">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li><li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system.">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).</li><li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells.">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li><li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape.">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules.">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).</li><li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47/SIRPalpha+axis.">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li><li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD47:+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy.">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li><li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine,+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+(P4455).">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer.">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy.">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening.">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).</li><li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technology+and+patient+cells:+from+early+drug+development+to+precision+medicine.">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li></ol>

De auteurs doen onderzoek naar de ontwikkeling van auto T-cellen en bijbehorende potentie testen die zakelijke belangen zijn van respectievelijk ProMab Biotechnologies en ACEA Biosciences. Dit verandert echter niets aan de naleving door JoVE van de missie van de auteurs om de verspreiding van wetenschappelijke kennis te vergroten. De voorwaarden van deze publicatie zijn beoordeeld en goedgekeurd door ProMab Biotechnologies en ACEA Biosciences in overeenstemming met haar onderzoeksbeleid.

Chimeric antigeen receptoren zijn multi Domain eiwitten samengesteld uit een extracellulaire single-Chain variabel fragment (scFv regio), een scharnier gebied, een transmembraan regio, en een cytoplasmonisch domein samengesteld uit TCR signalering domeinen en aanvullende costimulatory domeinen van receptoren zoals CD28 en OX4011,40. Om veilige, selectieve en effectieve Auto's te ontwerpen, is het noodzakelijk dat de verschillende permutaties in het ontwerp van de Auto's grondig worden getest met behulp van in vitro potentie testen en, uiteindelijk, diermodellen. In deze studie hebben we een protocol en een workflow voorzien voor hoe een real-time in vitro potentie test het ontwerp van effectieve Auto's kan informeren.
Bij het ontwerpen van elk type potentie test, met name voor productiedoeleinden, is het noodzakelijk dat de test gevoelig, robuust, consistent en zo dicht mogelijk bij het werkingsmechanisme16,17,41is. De hier beschreven real-time potentie test is ontworpen om de cytolytische activiteit van de auto T-cel rechtstreeks te meten in plaats van een surrogaat marker zoals cytokine-afgifte te gebruiken. Belangrijk is dat de assay geen aanvullende componenten zoals kleurstoffen of reagentia vereist, anders dan de test plaat (E-plaat) en de aanbevolen media voor het onderhouden van de cellen. Bovendien is de assay uiterst gevoelig en levert deze zeer reproduceerbare gegevens in vergelijking met andere op een label gebaseerde assays42,43,44. Bovendien is de xCELLigence test vatbaar voor het gebruik van zeer lage Effector-to-target ratio's die ideaal zijn voor de beoordeling van specifieke cytolyse.
Om de flexibiliteit en nut van het xCELLigence systeem aan te tonen, hebben we ons geconcentreerd op twee tumortypes, namelijk tumoren van hematologische oorsprong en solide tumoren. Om de potentie van CD22-gestuurde auto T-cellen te beoordelen, werden Raji-cellen (d.w.z. een B-cel lymfoom cellijn) aan de E-platen vastgebonden met behulp van een anti-CD40 antilichaam. De Tethering van Raji-cellen tot de bodem van de E-platen resulteert in een impedantie signaal dat de levensvatbaarheid en het aantal Raji-cellen in de put weerspiegelt. Na de toevoeging van CD22-CAR T-cellen worden de Raji-cellen selectief gedood in een tijd-en Effector-afhankelijke manier, wat culmineert in een tijdafhankelijke afname van het impedantie signaal. De daling van de impedantie betekent cytolyse of verlies van levensvatbaarheid van de Raji-cellen17. Deze selectieve Tethering aanpak met antilichamen kan worden uitgebreid naar andere vloeibare tumor cellijnen. Een alternatieve strategie voor het gebruik van tumor cellijnen van hematologische oorsprong is het gebruik van aanhankelijk kankercellen die zijn ontworpen om stabiel uitdrukken de tumor antigenen, zoals CD19 uitgedrukt in HeLa cellen. Het voordeel van deze benadering is dat de cellen van de ouderlijke HeLa direct beschikbaar zijn en kunnen worden gebruikt als een negatieve controle op specificiteit. Een dergelijke aanpak is al gevalideerd met CHO-CD22 vs. Cho-cellen en CHO-BCMAs vs. CHO-cellen29. Met behulp van dergelijke verschillende benaderingen, auto T-cel ontwerp en werkzaamheid kunnen eenvoudig worden getest. De xCELLigence test is inherent flexibel en testcondities kunnen worden aangepast om de fysiologische omstandigheden maximaal te benaderen.
Een groot voordeel van de potentie assay die we hier beschrijven is dat het een eenvoudige functionele assay is en kan worden gebruikt in combinatie met genetische manipulatie technieken om optimale en effectieve Auto's te ontwerpen op een high-throughput manier. Zoals hier is aangetoond voor auto T-cellen die zijn ontworpen om EGFR-positieve kankercellen te targeten, kan de test worden gebruikt om de relatieve activiteit van verschillende auto constructies/mutanten te evalueren. We hebben bijvoorbeeld laten zien dat wanneer het GITR-domein zich stroomopwaarts bevindt van het domein CD3 het veel robuustere cytolytische activiteit vertoont dan wanneer het zich stroomafwaarts van het CD3 domein bevindt.
Hoewel het niet perfect correleren met in vivo auto T cel activiteit, in vitro cytokine release is historisch gebruikt als een maatstaf voor de potentie van de auto T-cel. Hoewel de hier beschreven xCELLigence-potentie test kan worden gebruikt voor het evalueren van op cellen gebaseerde therapieën tijdens de productie of voordat deze worden vrijgegeven voor klinische toepassingen, is het zo dat deze resultaten correleren met de werkzaamheid in vivo nog niet Vastgesteld. In vivo is de werkzaamheid afhankelijk van een groot aantal factoren en variabelen die niet binnen een in vitro assay kunnen worden samengevat. Dergelijke variabelen omvatten: homing van de auto T cellen op de plaats van de tumor, de stimulatie en activering van de auto T cel en haar vermogen om te blijven binnen de patiënt, en de tumor micro omgeving. Met verdere verfijning kan de xCELLigence test in staat zijn om sommige van deze complexe processen in vitro te modelleren.
Het protocol dat hier wordt toegepast is van toepassing op de meeste aanhangers van kanker cellijnen en sommige van de vloeibare tumor cellijnen. Klinische monsters zoals primaire kankercellen moeten echter verder worden getest en geoptimaliseerd vanwege de complexiteit van de tumortypen en-fasen. Het is zeker vermeldenswaard dat de in vitro potentie assay systeem hier beschreven gebruikt Cancer cellijnen alleen om de potentiële activiteit van de auto T cellen weerspiegelen. De echte tumor situatie in het menselijk lichaam is veel complexer, vooral wanneer een solide tumor is gericht, als gevolg van de dynamische tumor omgeving en ontwikkeling. Daarom kan het resultaat van de potentie-evaluatie niet zeer goed vertalen in de klinische werkzaamheid van de geteste auto T-cellen.
Kortom, het gepresenteerde op impedantie gebaseerde xCELLigence platform maakt het mogelijk om celmoord gedurende langere tijd te controleren, namelijk tot 10 dagen. Deze capaciteit voor zo'n lange temporele schaal voor het verzamelen van gegevens onderscheidt de technologie van andere assays die momenteel in gebruik zijn en waarvoor het instellen van meerdere experimentele replicaten nodig is voor het verzamelen van tijdpunten en het manipuleren van bewerkelijk monsters. Bovendien vereenvoudigt de minimale signaal bijdrage van de Effector immuuncellen data-analyse. De software kan gegevens automatisch verwerken en nuttige parameters genereren, zoals het percentage cytolysis, KT50, enz. De technologie heeft al aangetoond hoge gevoeligheid (met E:T ratio's zo laag als 1:20) en een groot dynamisch bereik (met E:T verhoudingen van 20:1 tot 1:20), die niet gemakkelijk wordt bereikt met andere testen. Over het algemeen moet de implementatie van deze technologie een nauwkeurigere gegevensanalyse mogelijk maken op een hogere doorvoer schaal die de ontwikkeling van auto-T-celreagentia verbetert, waardoor het veld in een veel hoger tempo wordt ontwikkeld.

In de afgelopen jaren, auto T-cel therapie is een van de meest prominente doorbraken in kanker immunotherapie voor gerecidiveerd en refractaire hematopoietische maligniteiten. Met de recente Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedkeuring van CD19-gestuurde auto T cellen voor acute lymfoblastische leukemie, niet-Hodgkin lymfoom, en diffuus groot B-cellymfoom, en de aanwijzing van doorbraak therapie voor B-celmaturatie antigeen (bcma)-geleide auto T-cellen voor multipel myeloom, deze technologie heeft grote opwinding in de wetenschappelijke gemeenschap gegenereerd en heeft talrijke basis, toegepaste en klinische studies wereldwijd1,2,3, 4,5. In januari van 2019 werden meer dan 700 klinische studies geregistreerd in de database van de klinische proef (clinicaltrials.gov); ongeveer 450 van deze studies waren ofwel begonnen of actief rekruteren van patiënten. Het merendeel van de klinische proeven zijn gericht op hematologische maligniteiten, en klinische proeven met behulp van auto T-cellen gericht op CD20, CD22, en bcmas, naast CD19, zijn lopende als goed6,7. Terwijl de meeste van de proeven zijn met behulp van autologe auto t-cel therapie, een groot aantal van hen zijn ook het verkennen van het nut van allogene auto t-cellen8,9,10. Ondanks veelbelovende resultaten met hematologische maligniteiten, het gebruik van auto T cellen te richten op solide tumoren is gebleken dat veel moeilijker in de kliniek om een verscheidenheid van redenen, met inbegrip van maar niet beperkt tot het ontbreken van goede doelen die uitsluitend worden uitgedrukt in de tumor, de heterogeniteit van solide tumoren en tumor "ontsnappen", en de moeilijkheid die auto T cellen hebben in de toegang tot de tumor micro omgeving11,12,13,14, 15. er is een kritieke behoefte aan de ontwikkeling van solide tumor-specifieke auto T-cellen die deze belemmeringen voor de werkzaamheid en het probleem van "op doel-off tumor" toxiciteit kunnen overwinnen. Hoewel een veelheid van in vitro en in vivo benaderingen gerechtvaardigd zijn in het ontwerp en testen van auto T-cellen, is een robuuste en voorspellende in vitro potentie test van primair belang16,17.
Om de potentie van auto T-cellen te beoordelen, zijn verschillende in vitro-methoden ontwikkeld. Over het algemeen kunnen deze potentie-assays worden onderverdeeld in twee brede categorieën, afhankelijk van of ze (i) direct de cytolytische activiteit van auto-t-cellen tegen doel tumorcellen meten, of (II) surrogaat markeringen zoals cytokines die door de auto t-cellen worden vrijgegeven als ze de doelcellen doden. Technieken die cytolytische activiteit direct meten omvatten de chromium-51 release assay (CRA)18, op Imaging gebaseerde assays die apoptosis van doelcellen meten met behulp van fluorescentie sondes19,20, en Flowcytometrie assays die apoptotic doelcellen detecteren21. In deze testen worden auto-T-cellen meestal medegekweekt met doelcellen die vooraf zijn gelabeld met radioactieve of fluorescerende sondes, gevolgd door een passende meting. Hoewel het al lange tijd beschouwd als de gouden standaard in het veld vanwege de gevoeligheid, de CRA heeft een aantal nadelen. Ten eerste is het een eindpunt test en geeft het geen kinetische informatie. Ten tweede moeten de doelcellen worden gelabeld met chromium-51 die de neiging heeft om uit de cellen te Leach en de achtergrondruis22aanzienlijk kan verhogen. Tot slot zijn er goede voorzorgsmaatregelen en verwijdering van het radioactieve afval nodig. Alternatieve assays, die bijproducten van de auto T-cel interactie met doelcellen als een indicatie van de potentie meten, omvatten de kwantatie van verschillende cytokines vrijgegeven door auto T cellen met behulp van ofwel flow cytometrie gebaseerde methoden of enzym-gebonden immunosorbent assays. Nogmaals, dit zijn endpoint assays die de cumulatieve afgifte van de cytokines op een bepaald tijdstip meten en dus mogelijk niet noodzakelijkerwijs de feitelijke cytolytische activiteit van de auto T-cellen weerspiegelen.
Bij het ontwikkelen van een potentie test, met name een die de vrijgave criteria voor een cel-gebaseerde therapie zoals een auto T-cel definieert, is het van cruciaal belang dat de assay minimale manipulaties en hands-on tijd omvat, omdat elke interactie een andere variabele is die moet worden verantwoord en de algehele robuustheid en consistentie van de assay kan verminderen. Bovendien, de interactie van de auto T cellen met de tumorcellen is een dynamisch proces, en het verstrekken van informatie over deze dynamische interacties, zoals de snelheid van cytolysis, is van primair belang voor de potentie evaluatie. Met deze criteria in gedachten ontwikkelden we een label vrije kinetische potentie test voor auto T-cellen die gebruikmaakt van het RTCA-platform (real-time Cell Analysis) van xCELLigence. xCELLigence maakt gebruik van gespecialiseerde microtiterplaten (E-plates) die gouden biosensoren ingebed in de bodem van elke put bevatten. Werken met ofwel aanhandende solide tumorcellen, of vloeibare kankercellen die zijn getethering met behulp van specifieke antilichamen, deze biosensoren bewaken in real-time auto T-cel-geïnduceerde veranderingen in het doelcel nummer, celgrootte, celsubstraat gehechtheid sterkte, en celcelinteracties (d.w.z. barrièrefunctie)17,23,24,25,26,27,28. De workflow is eenvoudig en omvat het simpelweg zaaien van de doelcellen in de putjes van E-Plates, gevolgd door de toevoeging van de auto T-cellen aan verschillende Effector-to-target verhoudingen (Figuur 1). Naarmate de biosensoren continu de levensvatbaarheid van de doelcellen bewaken, worden de gegevens automatisch in real-time weergegeven.
In de afgelopen 15 jaar is de xcelligence test gevalideerd voor het beoordelen van de potentie van Natural Killer (NK) cellen, t-cellen, auto t-cellen, controlepunt remmers, bispecifieke antilichamen, oncolytische virussen en een aantal combinatietherapieën17,29,30,31,32,33,34. Onlangs werd de xCELLigence potentie test geëvalueerd voor t-cellen die T-cel receptor (TCR) fabriceren35. Hier rapporteren we het gebruik van de RTCA-systeem voor het evalueren van de in vitro potentie van auto T-cellen ontworpen om te richten op solide tumoren en vloeibare tumoren in klinische therapieën.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

Chimeric antigeen receptor (auto) T-cel therapie voor kanker heeft significant klinisch voordeel bereikt voor resistente en refractaire hematologische maligniteiten zoals jeugd acute lymfatische leukemie. Inspanningen zijn momenteel aan de gang om deze veelbelovende therapie te verlengen tot solide tumoren naast andere hematologische kankers. Hier beschrijven we de ontwikkeling en productie van potente auto T-cellen gericht op antigenen met unieke of preferentiële uitdrukking op vaste en vloeibare tumorcellen. De in vitro potentie van deze auto T-cellen wordt vervolgens in real-time geëvalueerd met behulp van de zeer gevoelige, op impedantie gebaseerde xCELLigence test. Specifiek, de impact van verschillende costimulatory signalering domeinen, zoals Glucocorticoïde-geïnduceerde tumor necrose factor receptor (TNFR)-gerelateerde eiwitten (GITR), op de in vitro potentie van auto T cellen wordt onderzocht. Dit rapport bevat protocollen voor: het genereren van auto T-cellen voor preklinische studies met behulp van lentivirale gen-transductie, het uitbreiden van auto T-cellen, het valideren van de auto-expressie en het uitvoeren en analyseren van xCELLigence potentie-assays.

Carlinvirus bereiding en auto T-celgeneratie en potentie beoordeling De Antilichaamtiters van de CARLINVIRUS preparaten werden bepaald aan de hand van een kwantitatieve RT-PCR-Kit (Zie de tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant. Het titratie protocol heeft eerst virus RNA geëxtraheerd en vervolgens het linvirale RNA-Kopieer nummer gemeten, dat de hoeveelheid infectieuze virale deeltjes aangeeft. De titer van het virus gegenereerd uit 1 150 mm schotel met behulp van het bovenstaande protocol varieert meestal tussen 109-1010 virale kopieën/ml. Figuur 2A toont het RT-PCR-cyclusnummer versus de signaalsterkte van een representatief kwantitatief PCR-resultaat. Zodra de virus kwaliteit was voldaan, toen de titer groter was dan 1 x 108 Pfu/ml, het was bevroren voor latere T cel transductie. Nadat de auto T cellen werden getransduceerde met lentivirus, de T-cellen werden gekweekt voor een extra 12-14 dagen, behoud van hun dichtheid rond 1 x 106 aan 2 x 106 cellen/ml. De auto T-cellen werden vervolgens gecontroleerd met anti-ScFv-specifiek antilichaam met behulp van een flow-cytometer vóór een downstream toepassing of bevriezen. Een goed representatief batch resultaat wordt weergegeven in Figuur 2B. Met behulp van een anti-ScFv-antilichaam, ongeveer 50% van de auto T cellen gekleurd positief (Q2 50,6% vs. T cellen 1%), met vermelding van de uitdrukking van de auto in ongeveer 50% van de T-cellen. Vervolgens werd de RTCA-potentie test uitgevoerd voor cytolysisbepaling voordat elke batch van auto T-cellen werd bevroren en klaar was voor toekomstige toepassing. Een cyclus van de auto T-cel ontwerp, generatie, en beoordelingsprocedure duurde ongeveer 1 maand.
Het doden van Raji lymfoom B-cellen door CD22-CAR T-cellen De anti-CD40 vloeibare tumor Tethering Kit (Zie de tabel van de materialen) werd gebruikt in een concentratie van 4 μg/ml om een E-plaat te Coat voor 3 uur bij 37 °c. Na het wassen van de putten met Tethering buffer, werden B-cel lymfoom cellen toegevoegd aan de E-plaat met een dichtheid van 30.000 cellen/goed. Nadat de cellen zich gedurende 30 minuten hebben laten vestigen, werd de E-plaat terug in het xCELLigence-instrument geplaatst en werden de impedantie metingen onmiddellijk geïnitieerd om celhechting en proliferatie vast te leggen. De volgende dag werden ofwel CD22-CAR T-cellen, mock CAR T-cellen of niet-getransteerde T-cellen toegevoegd. In Figuur 3werd een E:T-verhouding van 10:1 gebruikt voor alle celtypen. CD22-positieve Raji-cellen, behandeld met CD22-CAR T-cellen weergegeven significant doden (groene trace) in vergelijking met de negatieve controles (ongetransducteerde T-cellen en mock CAR T cellen).
Effectief doden van pancreaskanker cellen door CD47-CAR T-cellen CD47 is een transmembraan oppervlak glycoproteïne van de immunoglobuline superfamilie. Als een integrine-geassocieerde eiwit, het is sterk uitgedrukt in zowel hematologische kankers (leukemie, lymfoom en multipel myeloom) en vaste kankers (zoals ovariële, kleincellige longkanker, pancreas, glioblastoma) en andere vormen van kanker36,37. CD47 is ook bekend als een doe-niet-Eat-me-signaal aan macrofagen, waardoor het een potentieel therapeutisch doelwit is in sommige kankers. CD47-Car T-cellen werden geproduceerd en getest tegen BxPC3 pancreaskanker cellen die hoge niveaus van CD4738,39uitdrukken. BxPC3 cellen werden op dag 1 in de E-plaat geseeid met een dichtheid van 10.000 cellen/goed. Real-time monitoring toonde aan dat deze cellen confluentie bereikten na 16 uur. Op dit moment werden auto T-cellen toegevoegd aan de E:T-verhouding van 10:1 (Figuur 4A). Controle Effector cellen zoals nontransduced T cellen en mock auto T cellen werden ook toegevoegd. De resultaten tonen duidelijk aan dat CD47-CAR T cellen selectief het doel BxPC3 cellen29doden. Ook toont Figuur 4B dat het impedantie signaal wanneer CD47-Car T-cellen worden toegevoegd aan een lege put aanzienlijk lager is dan het impedantie signaal dat wordt gegenereerd door doel BxPC3 cellen. De Cell index waarde van Wells met CD47-CAR T cellen alleen bereikt een maximum van 0,14, die is slechts iets hoger dan het signaal van medium alleen (0,02). Dit geeft aan dat in deze heterogene Killing Assay, het impedantie signaal bijna uitsluitend wordt afgeleid van de doel kankercellen.
Costimulatie van auto T-cellen door het GITR-domein Wanneer uitgedrukt in een EGFR-GITR-CD3 auto, de GITR costimulatory domein werd eerder gemeld ter verbetering van het doden van EGFR-positieve SKOV3 kankercellen, maar niet EGFR-negatieve MCF-7 kankercellen30. Om de rol van het GITR-domein beter te verduidelijken, werden auto constructies met het volledige GITR-domein, of verwijderde of opnieuw gerangschikte versies van het domein, gegenereerd en getest op de mogelijkheid om auto T-cellen te coactiveren (Figuur 5A). De xCELLigence gegevens in Figuur 5B, C toont aan dat de gitr costimulatory domein verbetert auto T cel doden van EGFR-positieve doelcellen boven wat wordt WAARGENOMEN met de oorspronkelijke auto construct die mist de gitr domein. Bovendien, verwijderen van 10 aminozuren uit de GITR domein (aminozuren 184-193) afgeschaft deze stimulerende activiteit. Daarentegen bleek het herschikken van de relatieve positionering van het GITR-domein binnen de auto constructie minder nadelig te zijn voor zijn stimulerende capaciteiten. Met behulp van eindpuntgegevens toonde de IFNγ-productie als surrogaat van T-cel activering ook de stimulerende activiteit van het GITR-domein (Figuur 5B). In tegenstelling tot eindpunt gegevens die slechts een "snapshot" zijn, verlicht het continue impedantie Profiel van het xCELLigence instrument duidelijk subtiele verschillen in de Killing kinetiek van de verschillende behandelingen (Figuur 5C). De hier verkregen resultaten zijn consistent met die van een in vivo onderzoek30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Figuur 1: de xCELLigence real-time Cell Analysis (RTCA) systeem detecteert het doden van doelcellen door Effector cellen. Er zijn drie belangrijke conceptionele stappen voor het meten van de moord activiteit van auto T Effector cellen tegen doel kankercellen. Stap 1: zaai de doelcellen (d.w.z. tumorcellen) in de put van een E-plaat. De cellen hechten aan de gouden biosensor micro elektroden en dit belemmert de stroom van elektrische stroom tussen de elektroden. Deze impedantie waarde wordt gemeten en uitgezet als een unitless parameter genaamd Cell index. De celwaarde stijgt naarmate de cellen groeien en bereikt een plateau als de cellen samenvloeiing benaderen. Stap 2: Effector cellen-niet-aanhandige immuuncellen-worden vervolgens toegevoegd. Omdat deze cellen niet voldoen aan de gouden micro elektroden, veroorzaken ze niet direct een impedantie verandering. Stap 3: als de Effector cellen de doel kankercellen aanvallen, de vernietiging van de tumorcellen wordt weerspiegeld door een afname van de celindex na verloop van tijd. Deze cytolytische activiteit van de Effector cellen, of de potentie van de Effector cellen, kan gevoelig en nauwkeurig worden bewaakt. De continue overname van impedantie gegevens van het xCELLigence systeem maakt het mogelijk om in real-time de bewegingsanalyse te doden voor meerdere condities tegelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Figuur 2: titerbepaling van de lentivirus en flow cytometrie evaluatie van de auto T-cellen. A) bepaling van lentivirale titer. De verschillende kleur lijnen zijn representatieve voorbeelden voor het cyclusnummer versus Delta RN. lage cyclus cijfers duiden op een relatief hoge hoeveelheid virus RNA sjabloon aanwezig in de monsters. B) na transductie werden auto T-cellen gekweekt en onderhouden met een dichtheid van minder dan 2 x 106 cellen/ml en vervolgens onderworpen aan stromings analyse. De y-as weerspiegelt de kleuring voor T-cellen, met positieve waarden die worden weergegeven in de gebieden Q1 en Q2. Beide voorbeelden zijn 100% positief voor T-cellen. De uitdrukking van de auto scFV wordt bepaald met behulp van een scFv-specifieke AB (x-as). Het resultaat toont aan dat meer dan 50% van de T-cellen scFv-positief is in CD22-CAR T-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Figuur 3: het doden van de dynamiek van CD22-Car T cellen tegen Raji Burkitt's lymfoom cellen. Terwijl de rode curve de Raji-cellen alleen is, is de groene curve de Raji-cellen die worden behandeld met CD22-CAR T-cellen. De roze en blauwe curven zijn mock CAR T-Cell behandeling en nontransduced T-Cell behandeling, respectievelijk. De E:T-verhouding is 10:1. Foutbalken zijn standaarddeviatie. De tijdschaal is ingesteld op intervallen van 2 uur voor eenvoudige weergave, hoewel er meer gegevenspunten beschikbaar zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Figuur 4: werkzaamheid van CD47-Car T cellen tegen alvleesklier Solid tumorcellen. (A) roze is de doel BxPC3 cellen alleen, terwijl rood is BXPC3 met CD47-Car T-cellen toegevoegd. Groen is BxPC3 met de toevoeging van nontransduced T-cellen, en blauw is met mock CAR T-cellen. De E:T-verhouding is 10:1. (B) in dezelfde setting is rood leeg (ontbrekende doelcellen) controle putten met CD47-auto T cellen alleen en groen is alleen het medium. Foutbalken zijn standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Figuur 5: GITR domein verhoogt auto T cel cytotoxische activiteit tegen EGFR-positieve tumor cellijnen. A) verschillende auto constructies. B) staaf plots van% cytolyse voor verschillende auto constructies op 4 uur (links) en 24 uur (midden). De IFNγ-productie bij 24 uur wordt rechts weergegeven. C) voortdurende moord evaluatie voor alle constructies. De zwarte curve is de groeicurve van alleen BxPC3 ovariële kankercellen. De groene curve is de doelcellen die alleen met T-cellen worden behandeld, de blauwe curve is de doelcellen die worden behandeld met mock CAR T-cellen, de rode curve is de doelcellen die worden behandeld met EGFR-GITR-CD3-CAR T-cellen, de roze curve is de doelcellen die worden behandeld met EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T-cellen, en de bruine curve is de doelcellen die worden behandeld met EGFR-CD3-GITR-CAR T-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence real-time celanalyse stelt u in staat om het doden van kankercellen kwantitatief te controleren door immuuncellen onder labelvrije omstandigheden en in de loop van meerdere dagen. Dit systeem biedt een volledige tijd cursus van doel kanker cel doden waardoor de gelijktijdige screening van een groot aantal constructies, effector celtypes, of combinatie therapieën bij lage effector-doelratio's. Begin met het zaaien van 1,5 keer 10 tot de zeven HEK293FT cellen in DMEM cultuurmedium in een 150 milliliter celkweekschotel voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide met vochtigheid.Meng de volgende ochtend 2,5 milliliter transfectieverdunningsoplossing aangevuld met vijf microgram lentivirale vectorplasmide DNA en 22,5 microgram lentivirale verpakkingsmix met 82,5 microliter transfection reagens in 2,5 milliliter transfectieverdunningsoplossing. Na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur breng je de reactiedruppel verstandig over in de schotel van HEK293FT-cellen en breng je de cellen terug naar de couveuse voor een tweede nachtelijke incubatie. De volgende ochtend, vervang de supernatant met 19 milliliter verse DMEM cultuur medium en de cellen terug te keren naar de incubator 's nachts.Verzamel de supernatant in een enkele 50 milliliter conische buis voor vier graden Celsius opslag voor de komende twee dagen voor het sedimenteren van het lentivirus door centrifugatie op de tweede ochtend om alle cellen of puin te verwijderen uit de oplossing. Breng alles behalve ongeveer een milliliter van het lentivirus met supernatant over naar een ultraheldere centrifugebuis voor ultracentrifugatie. Na ultracentrifugatie, voorzichtig aanzuigen van het resterende virus met supernatant, voorzichtig voeg 100 microliters van DMEM aan de pellet, en plaats de buis op ijs gedurende 15 minuten.Meng aan het einde van de incubatie de oplossing voorzichtig en lijd de lentivirusoplossing in voorgekoelde steriele buizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Bepaal vervolgens de titer van het lentivirus door middel van kwantitatieve RT-PCR volgens de instructies van de fabrikant. Voor car-t cel generatie en uitbreiding, activeer een tot twee keer 10 tot de zes perifere bloed mononucleaire cellen in een milliliter van CAR-T cel medium met een gelijk aantal CD3/CD28 gecoate microbeads in een put van een 24-well plaat in de celcultuur incubator voor 24 uur.De volgende twee ochtenden, meng een microliter van transductie versterker agent met de cellen, gevolgd door de toevoeging van lentivirus bij een veelheid van infectie van vijf tot een. Monitor de T-cel groei om de twee tot drie dagen toe te voegen verse CAR-T cel medium als nodig is om de cellen te handhaven op een een tot twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter concentratie. Om T-cel CAR-expressie door stroomcytometrie te detecteren, breng je drie keer 10 over naar de vijfde CAR- en niet-doorgezette T-cellen in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellets in 200 microliters van FACS buffer aangevuld met 1% menselijk serum. Splits elk celmonster in 100 microliter aliquots in individuele vijf milliliter polystyreen FACS buizen op ijs. Voeg na vijf minuten één microliter biotinylated FAB2-fragmenten van geitantimuis FAB2 toe aan één buis van elk celtype en twee microliters met PE-gelabelde anti-tag antilichaam aan de andere buis van elk celtype met grondig mengen.Na 30 minuten op ijs, was de cellen met drie milliliter verse FACS buffer en na centrifugeren decanteren de supernatants. Resuspend de pellets in de resterende supernatant en voeg twee microliters van APC anti-CD3 en twee microliters van 7-AAD aan elke buis. Voeg een microliter van PE-gelabelde Streptavidin met korte menging aan de buis gekleurd met anti-FAB2 antilichaam en incubeer alle buizen op ijs gedurende 30 minuten.Analyseer aan het einde van de incubatie de cellen door flow cytometrie volgens standaardprotocollen die de T-cellen vernevelen door voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing en CD3 versus 7-AAD-expressie. Voor een real-time cytolyse potentie test, voeg 50 tot 100 microliter van doelcel cultuur medium aan elke put van een e-plaat en meet de achtergrond impedantie in een cel analyzer instrument. Detecteer het doel kankercellen van de cultuur plaat met behulp van trypsine.Was de cellen in 15 milliliter vers kweekmedium en centrifuge. Resuspend de kankercelpellet in vijf milliliter vers medium voor het tellen en pas de celdichtheid aan de juiste concentratie van de doelcel aan. Voeg de cellen toe aan het juiste aantal putten en laat de e-plaat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur zodat de cellen zich gelijkmatig op de bodem van de putten kunnen vestigen.Plaats de plaat aan het einde van de evenwichtsperiode in de real-time celanalyzer en start de impedantie automatisch om de 15 minuten 's nachts. De hechting en proliferatie van de doelcellen kunnen in realtime worden gevolgd. De volgende ochtend verdun de effector CAR en controleer T-cellen tot de juiste concentratie in afzonderlijke buizen en verwijder 50 tot 100 microliter uit elke put van de e-plaat, zodat het uiteindelijke volume in elke put 100 microliter is.Vervolgens, zaad de effector en controle T-cellen in de juiste putten op de juiste effector tot doel verhoudingen in 100 microliter van medium per put. Vervolgens de e-plaat 30 minuten op kamertemperatuur in evenwicht brengen voordat u de plaat terugbreedt naar het celanalyzersysteem. Om de werkzaamheid van de T-cel bemiddelde doden van de doelgroep kankercellen te meten, controleer de CAR-T gemedieerde doden gedurende 96 uur.Ongeveer 50% van de CAR-T cellen gekleurd positief voor anti-single chain variabele fragment antilichaam wat de expressie van CAR in ongeveer 50% van de T-cellen. In dit representatieve experiment werd voor alle groepen een effector-één effector-doelratio gebruikt. Raji cellen alleen en CD22-CAR T cel behandeld Raji cellen weergegeven significante doden in vergelijking met de controle T-cel alleen en Mock CAR-T cel groepen.In dit experiment waren alleen de CD47-CAR-T cellen effectief in het doden van de alvleesklierkankercellen. Verder was het impedantiesignaal van de CD47-CAR-T cellen alleen al slechts iets boven het signaal van de celindex gemeten in de medium alleen putten die aangeven dat het impedantiesignaal als gevolg van suspensiecellen zoals CAR-T-cellen minimaal is en niet bijdraagt aan het algehele impedantiesignaal wanneer CAR-T-cellen worden toegevoegd aan de doelkankercellen. Met name, de GITR co-stimulatie domein werd waargenomen effectiever in het verbeteren van CAR-T cel doden tegen epitheliale groeifactor receptor positieve doelcellen in vergelijking met de oorspronkelijke CAR constructen zonder de GITR domein.Het medium uit e-plate putten kan worden verzameld om het cytokineprofiel op tijdstippen te analyseren tijdens of na de test volgens de behoeften van het experiment. Over het algemeen heeft xCELLigence de efficiëntie verbeterd van het evalueren van de potentie van diverse immunotherapieën, variërend van bispecifieke T-celin engagers en oncolytische virussen tot immuuncontrolepuntremmers in combinatietherapieën.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...