Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

Les auteurs remercient ProMab Biotechnologies et ACEA Biosciences d'avoir fourni les réactifs et les instruments utilisés dans cette étude.

1. Génération de lentivirus codant en RCA
REMARQUE : Une fois la construction spécifique du plasmide à cellules T de la RCA terminée (CD47 et autres), les RAC lentiviraux sont générés par la procédure standard, à l'aide de 293 cellules FT, d'un mélange d'emballage lentiviral et d'agents de transfection (voir le Tableau des matériaux)tel que décrit29. Par la suite, utilisez un kit quantitatif de réaction en chaîne de polymérase de transcription inversée (RT-PCR) et un cycleur thermique (voir le tableau des matériaux)pour déterminer le taquet de virus en mesurant la quantité d'ARN lentiviral selon le protocole du fabricant. Il est important que toutes les procédures lentivirales soient effectuées strictement conformément aux exigences de sécurité.
<ol><li>Seed 15 x 106 cellules HEK293FT dans le milieu modifié de l'aigle (DMEM) de Dulbecco et incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC dans un plat de 150 mm à l'intérieur d'un incubateur humidifié de 5 % de CO2.</li>
	<li>Préparer deux tubes de 15 ml avec un complexe de transfection. Le premier tube contient de l'ADN plasmide vectoriviral lentiviral (5 g) et un mélange d'emballage lentiviral (22,5 g) dans 2,5 mL de solution de dilution de transfection. Le deuxième tube contient 82,5 L de réactif de transfection dans 2,5 mL de solution de dilution de transfection (voir le Tableau des matériaux).</li>
	<li>Pipet le contenu du tube 1 dans le tube 2, et couver le mélange à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Transférer le contenu du tube dans le sens goutte à goutte sur le plat des cellules HEK293FT et incuber l'échantillon pendant la nuit à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5 % de CO2.</li>
	<li>Le lendemain, remplacez le milieu existant par 19 ml de milieu de culture DMEM frais et continuez à incuber les cellules pendant la nuit à l'intérieur de l'incubateur humidifié de 5 % de CO2 à 37 oC.</li>
	<li>Transférer le milieu du plat dans un tube centrifugeuse de 50 ml. Gardez le tube avec le milieu contenant le virus dans le réfrigérateur.</li>
	<li>Répétez la procédure ci-dessus, en ajoutant d'autres DMEM frais et en la recueillant à nouveau après 1 jour.</li>
	<li>Combiner deux collections de supports dans un tube de centrifugeuse. Centrifuguer le tube à 2 000 x g pendant 30 min à 4 oC.</li>
	<li>Transférer la majeure partie du supernatant contenant du lentivirus dans un tube de centrifugeuse ultraclair. Laisser un volume minimum, environ 1 ml, du supernatant pour éviter de déranger la pastille qui peut contenir des cellules et/ou des débris.</li>
	<li>Ultracentrifuge le supernatant clarifié ci-dessus à 110 000 x g pendant 100 min à 4 oC.</li>
	<li>Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez délicatement 100 l de milieu DMEM au granule de virus au fond du tube. Laisser le tube sur la glace pendant 15 min. Mélanger la solution doucement et aliquot la solution de lentivirus dans des tubes stériles préréfrigérés. Conservez ces tubes de bouillon de virus dans un congélateur de -80 oC.</li>
	<li>Utilisez un kit quantitatif RT-PCR pour déterminer le dispositif du lentivirus selon le protocole du fabricant, qui extrait et mesure l'ARN lentiviral.</li>
</ol>2. Génération et expansion des lymphocytes T CAR
<ol><li>Activer les PBMC humains précédemment congelés (environ 1 x 106 à 2 x 106 cellules) dans 1 ml de milieu à cellules T CAR avec un nombre égal de microbilles enduites de CD3/CD28 (voir le Tableau des matériaux)et incuber les cellules à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Décongeler un aliquot du stock de lentivirus sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 1 l de transduction améliorer l'agent dans le puits avec les cellules et mélanger.</li>
	<li>Ajouter le lentivirus aux cellules à une multiplicité d'infection (MOI) de 5:1 et mélanger doucement. Le lendemain, répétez cette étape (24 h après la première transduction).</li>
	<li>Surveillez la croissance des lymphocytes T tous les 2-3 jours. Ajouter plus de nouveau milieu à cellules T CAR pour maintenir les cellules à une densité de 1 x 106 à 2 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Congelez les lymphocytes T CAR à l'aide d'un protocole standard utilisant une solution de congélation (voir le Tableau des matériaux).</li>
	<li>Décongeler les lymphocytes T CAR à l'aide d'une méthode standard et les préculture dans le milieu à cellules T de carrelère de carrelages pendant environ 2 à 4 h avec il-2 (300 unités/mL) avant de les appliquer à l'arrêt.</li>
</ol>3. Détection de l'expression carRAC par cytométrie de flux
<ol><li>Transférer 3 x 105 lymphocytes T CAR et lymphocytes T non transducées dans deux tubes de microcentrifuge distincts de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 2 min et resuspendre les cellules dans 200 L de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) contenant 1% de sérum humain.</li>
	<li>Pipet 100 'L de solution cellulaire dans deux tubes FACS en polystyrène de 5 ml et garder les tubes sur la glace pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 1 l de chèvre biotinylated anti-souris F(ab')2 à un tube de chaque type de cellule. Ensuite, ajoutez 2 l d'anticorps anti-étiquettes étiquetés PE (voir le Tableau des matériaux)à l'autre tube de chaque type de cellule. Bien mélanger et les incuber sur la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les cellules avec 3 ml de tampon FACS dans chaque tube et centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min; jeter les supernatants et le vortex très brièvement ou secouer les tubes brièvement pour resuspendre les cellules dans le liquide résiduel.</li>
	<li>Ajouter 2 ll d'APC anti-CD3 et 2 'L de solution d'anticorps 7-AAD (voir le tableau des matériaux)à chaque tube. Dans le tube des cellules tachées d'anti-F(ab')2 Ab, ajouter 1 'L de streptavidin étiqueté PE. Mélanger brièvement et incuber les tubes sur la glace pendant 30 min de plus.</li>
	<li>Utilisez le tampon FACS pour laver les cellules à nouveau comme décrit à l'étape 3.5 et ajoutez 200 l supplémentaires de tampon FACS à chaque tube.</li>
	<li>Utilisez la cytométrie du débit pour analyser les cellules en gatingd d'abord sur les lymphocytes T dans une parcelle de diffusion vers l'avant vs côté, puis gating sur les cellules vivantes (7-AAD-négatif) dans une parcelle CD3 vs 7-AAD. La dernière étape consiste à analyser l'anti-tag, anti-ScFv ou anti-F(ab')2 vs CD3.</li>
</ol>4. L'astolyse de puissance de temps réel
REMARQUE : Effectuez l'assoutandeRTCselon les conditions recommandées par le fabricant. En bref, première plaque des cellules cibles dans les puits de l'E-Plate, suivie par l'ajout de cellules T CAR le lendemain. L'activité cytolyse des lymphocytes T CAR contre les cellules cibles est surveillée en temps réel. Les lymphocytes T et les lymphocytes T simulés (mock CAR T cells) sont utilisés comme témoins de cellules effectrices négatives. Le protocole suivant décrit un résultat de puissance de cytolyse in vitro en temps réel pour les lignées cellulaires tumorales adhérentes.
<ol><li>Ajouter 100 L de milieu de culture cellulaire cible à chaque puits de la xCELLigence E-Plate, placer la plaque à l'intérieur de l'instrument xCELLigence, et prendre une lecture de fond. Ensuite, transférer l'E-Plate à un capuchon de culture tissulaire pour l'ensemencement cellulaire.</li>
	<li>Utilisez un protocole standard pour trypsiniser les cellules cancéreuses cibles du dispositif de culture. Ensuite, transférer les cellules dans un tube centrifugeuse de 15 ml et ajouter un milieu de culture frais, jusqu'à 15 ml. Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 200 x g. Jeter le supernatant, ajouter 5 ml de milieu frais et utiliser une pipette sérologique pour resuspendre doucement le granule cellulaire. Comptez la densité des cellules vivantes à l'aide d'un hémocytomètre et d'un microscope.</li>
	<li>Ajustez la densité cellulaire de façon appropriée, puis ajoutez 100 L de la suspension cellulaire à chaque puits de l'E-Plate. Le nombre de cellules cibles est généralement d'environ 10 000 cellules/puits pour les lignées cellulaires adhérentes (BxPC3, Hela-CD19 et SKOV3), ou 30 000 cellules/puits pour les cellules de suspension comme Raji (voir ci-dessous pour plus de détails concernant les puits de prérevêtement avec des anticorps afin d'attacher les cellules cancéreuses liquides).</li>
	<li>Équilibrez l'E-Plate à température ambiante pendant 30 min pour permettre aux cellules de se déposer uniformément sur le fond du puits (ce qui est critique; ne sautez pas cette étape).</li>
	<li>Placez l'E-Plate dans l'instrument xCELLigence à l'intérieur de l'incubateur de culture cellulaire et commencez à mesurer l'impédance, affichée sous forme d'indice cellulaire par rapport au temps, automatiquement toutes les 15 min.</li>
	<li>Le lendemain, préparez les cellules T carRAC. Assurez-vous de préparer à l'avance les contrôles appropriés (c.-à-d. les cellules T de la CAR, les lymphocytes T témoins non transducs et/ou les lymphocytes T CAR non apparentés) pour vous assurer que toutes les cellules sont prêtes en même temps. Ajustez les cellules effectrices et les cellules témoins à la densité appropriée, et préparez des dilutions en série pour s'assurer que les ratios E:T souhaités seront atteints lorsque 100 l de suspension de cellules effectrices seront ajoutés à chaque puits à l'étape 9.</li>
	<li>Pause xCELLigence acquisition de données et apporter l'E-Plate de l'incubateur à une hotte de culture cellulaire.</li>
	<li>Retirer 100 l'l de milieu de chaque puits. La quantité de milieu résiduel dans chaque puits est maintenant de 100 l.</li>
	<li>Ajoutez 100 L de cellules T CAR d'effectrice diluées en série ou d'autres cellules témoins (c.-à-d. les cellules T de la CAR simulée) pour atteindre les ratios E:T souhaités.</li>
	<li>Équilibrez l'E-Plate à température ambiante pendant 30 min pour permettre aux cellules effectrices de se déposer, puis placez l'E-Plate dans l'instrument xCELLigence. Reprendre l'acquisition de données.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, à des moments clés, l'acquisition de données xCELLigence peut être interrompue et la plaque enlevée afin de recueillir de petits échantillons à analyser par des analyses orthogonales (c.-à-d. mesurer la production de cytokine par ELISA ou cytométrie de flux).</li>
	<li>Dans le cas de l'expérience EGFR-GITR-CD3 CAR T-cell, mesurez le rendement d'INFD avec un kit ELISA (suivez les instructions du fabricant ; voir le Tableau des matériaux). NOTE REGARDING THE USE OF LIQUID CANCERS: Pour tester les cellules cancéreuses hématologiques non adhérentes, avant d'ajouter des cellules, les puits de l'E-Plate sont d'abord recouverts d'un anticorps spécifique à un antigène qui s'exprime à la surface des cellules cancéreuses. Pour la ligne de cellules Raji B un réactif d'attache basé sur anti-CD40 est utilisé (voir kit d'analyse de tuerie de tumeur liquide dans le tableau des matériaux). Voici la procédure pour enrober la plaque:</li>
	<li>Diluer le réactif d'attache (anti-CD40) avec un tampon d'attache à une concentration de 4 g/mL.</li>
	<li>En travaillant à l'intérieur d'une hotte de culture tissulaire, ajouter 50 l de réactif dilué à chaque puits de l'E-Plate. Laisser l'E-Plate à température ambiante ou dans un incubateur de 37 oC pendant 3 h.</li>
	<li>Retirez le réactif d'attache et lavez l'E-Plate au moins 2x avec un tampon de lavage. À ce stade, l'E-Plate est prêt pour l'ensemencement des cellules cibles Raji (30 000 cellules/puits).</li>
	<li>Continuer avec l'étape 4.1 (ci-dessus) pour effectuer le reste de la procédure.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs effectuent des recherches sur le développement des lymphocytes T CAR et les essais de puissance associés qui sont des intérêts commerciaux de ProMab Biotechnologies et ACEA Biosciences, respectivement. Toutefois, cela ne modifie pas l'adhésion des auteurs à la mission de JoVE d'accroître la diffusion des connaissances scientifiques. Les termes de cette publication ont été examinés et approuvés par ProMab Biotechnologies et ACEA Biosciences conformément à sa politique de recherche.

Les récepteurs d'antigènes chimériques sont des protéines multidomaines composées d'un fragment variable extracellulaire à une seule chaîne (région de scFv), d'une région charnière, d'une région transmembranaire et d'un domaine cytoplasmique composé de domaines de signalisation TCR et de domaines costimulatory supplémentaires provenant de récepteurs tels que CD28 et OX4011,40. Pour concevoir des RAC sûrs, sélectifs et efficaces, il est impératif que les diverses permutations dans la conception des RAC soient soigneusement testées à l'aide d'essais de puissance in vitro et, éventuellement, de modèles animaux. Dans cette étude, nous avons fourni un protocole et un flux de travail sur la façon dont un test de puissance in vitro en temps réel peut éclairer la conception de RAC efficaces.
En concevant n'importe quel type d'essai de puissance, particulièrement aux fins de fabrication, il est impératif que l'essai soit sensible, robuste, cohérent, et aussi proche du mécanisme d'action que possible16,17,41. L'exemple de puissance en temps réel décrit ici est conçu pour mesurer l'activité cytolytique de la cellule T DE RCA directement plutôt que d'utiliser un marqueur de substitution comme la libération de cytokine. Fait important, l'assay ne nécessite pas de composants supplémentaires tels que les colorants ou les réactifs autres que la plaque d'assay (E-Plate) et les supports recommandés pour maintenir les cellules. En outre, l'analyse est extrêmement sensible et fournit des données hautement reproductibles par rapport à d'autres essais basés sur l'étiquette42,43,44. En outre, l'évaluation xCELLigence est prête à utiliser des rapports effector--cibles très faibles qui est idéal pour l'évaluation de la cytolyse spécifique.
Afin de démontrer la flexibilité et l'utilité du système xCELLigence, nous nous sommes concentrés sur deux types de tumeur, à savoir les tumeurs d'origine hématologiques et les tumeurs solides. Afin d'évaluer la puissance des lymphocytes T CAR dirigés par CD22, les cellules Raji (c.-à-d. une lignée cellulaire de lymphome à cellules B) ont été attachées aux E-Plates à l'aide d'un anticorps anti-CD40. L'attache des cellules Raji au fond des E-Plates donne un signal d'impédance qui reflète la viabilité et le nombre de cellules Raji dans le puits. Après l'ajout des cellules T CD22-CAR, les cellules Raji sont sélectivement tuées d'une manière dépendante du temps et de l'effet, aboutissant à une diminution dépendante du temps dans le signal d'impédance. La baisse de l'impédance signifie cytolyse ou perte de viabilité des cellules Raji17. Cette approche sélective d'attache utilisant des anticorps peut être étendue à d'autres lignées cellulaires de tumeur liquide. Une stratégie alternative à l'utilisation des lignes de cellules tumorales d'origine hématologique est d'utiliser des cellules cancéreuses adhérentes qui sont conçues pour exprimer de façon stable les antigènes tumoraux, tels que CD19 exprimé s'exprimer dans les cellules HeLa. L'avantage de cette approche est que les cellules HeLa parentales sont facilement disponibles et peuvent être utilisées comme un contrôle négatif pour la spécificité. Une telle approche a déjà été validée avec les cellules CHO-CD22 vs CHO et CHO-BCMAs vs cho29. En utilisant ces différentes approches, la conception et l'efficacité des lymphocytes T CAR peuvent être facilement testées. L'analyse xCELLigence est intrinsèquement flexible, et les conditions d'analyse peuvent être ajustées afin d'approximer au maximum les conditions physiologiques.
Un avantage majeur de l'analyse de puissance que nous avons décrite ici est qu'il s'agit d'un simple test fonctionnel et peut être utilisé en conjonction avec des techniques de génie génétique pour concevoir des RAC optimaux et efficaces d'une manière à haut débit. Comme cela a été montré ici pour les cellules T CAR conçues pour cibler les cellules cancéreuses EGFR-positives, l'analyse peut être utilisée pour évaluer l'activité relative de différentes constructions/mutants de RCA. Par exemple, nous avons montré que lorsque le domaine GITR est situé en amont du domaine CD3, il montre une activité cytolytique beaucoup plus robuste que lorsqu'il est situé en aval du domaine CD3.
Bien qu'il ne soit pas parfaitement corrélé avec l'activité in vivo des lymphocytes T CAR, la libération in vitro de cytokine a toujours été utilisée comme mesure de la puissance des lymphocytes T carRAC. Bien que l'essai de puissance xCELLigence décrit ici puisse être utilisé pour évaluer les thérapies à base de cellules pendant la fabrication ou avant d'être libéré pour l'application clinique, la façon dont ces résultats sont corrélés avec l'efficacité in vivo n'a pas encore été Établi. L'efficacité in vivo dépend d'une foule de facteurs et de variables qui peuvent ne pas être récapitulés dans un test in vitro. Ces variables incluent : le homing des cellules T de CAR au site de la tumeur, la stimulation et l'activation de la cellule T de CAR et sa capacité à persister dans le patient, et le microenvironnement de tumeur. Avec plus de raffinement, l'analyse xCELLigence peut être capable de modéliser certains de ces processus complexes in vitro.
Le protocole fourni ici s'applique à la plupart des lignées de cellules cancéreuses adhérentes et certaines des lignées cellulaires tumorales liquides. Les échantillons cliniques tels que les cellules cancéreuses primaires, cependant, doivent être davantage examinés et optimisés en raison de la complexité des types et des phases de tumeur. Il est certainement intéressant de noter que le système d'in vitro d'astodonte de puissance décrit ici utilise des lignées de cellules cancéreuses seulement pour refléter l'activité potentielle des cellules T de CAR. La situation réelle de tumeur à l'intérieur du corps humain est beaucoup plus complexe, particulièrement quand une tumeur pleine est visée, due à l'environnement dynamique de tumeur et au développement. Par conséquent, le résultat d'évaluation de puissance peut ne pas traduire très bien dans l'efficacité clinique des cellules T de CAR examinées.
En résumé, la plate-forme xCELLigence basée sur l'impédance présentée permet une surveillance sans étiquette de l'abattage cellulaire pendant une période prolongée, à savoir jusqu'à 10 jours. Cette capacité pour une si longue échelle temporelle pour la collecte de données différencie la technologie des autres essais qui sont actuellement utilisés et qui nécessitent la mise en place de multiples répliques expérimentales pour la collecte de points de temps et la manipulation laborieuse de l'échantillon. En outre, la contribution minimale du signal des cellules immunitaires effectrices simplifie l'analyse des données. Le logiciel peut traiter les données automatiquement et générer des paramètres utiles tels que le pourcentage de cytolyse, KT50, etc. La technologie a déjà fait preuve d'une sensibilité élevée (avec des ratios E:T aussi bas que 1:20) et d'une large plage dynamique (avec des rapports E:T de 20:1 à 1:20), ce qui n'est pas facile à réaliser avec d'autres essais. Dans l'ensemble, la mise en œuvre de cette technologie devrait permettre une analyse plus précise des données à une échelle de débit plus élevée qui améliorera le développement des réactifs à cellules T carRAC, faisant progresser le domaine à un rythme beaucoup plus élevé.

Ces dernières années, la thérapie à cellule T de CAR a été l'une des percées les plus importantes dans l'immunothérapie de cancer pour les malignités hématopoïétiques récidivantes et réfractaires. Avec l'approbation récente de la Food and Drug Administration (FDA) des cellules T DE dirigées par CD19 pour la leucémie lymphoblastique aigue, le lymphome non hodgkinien, et le lymphome diffus de grande cellule B, et la désignation de la thérapie de percée pour l'antigène de maturation de B-cellule (BCMA)-dirigé des cellules de CAR pour le myélome multiple, cette technologie a généré une grande excitation dans la communauté scientifique et a alimenté de nombreuses études fondamentales, appliquées, et cliniques dans le monde entier2,3, 3, 4,5. En janvier 2019, plus de 700 essais cliniques ont été enregistrés dans la base de données des essais cliniques (clinicaltrials.gov); environ 450 de ces essais étaient sur le point de commencer ou recrutaient activement des patients. La plupart des essais cliniques sont axés sur les malignités hématologiques, et les essais cliniques utilisant des cellules T CAR ciblant CD20, CD22, et BCMAs, en plus de CD19, sont en cours ainsi6,7. Alors que la plupart des essais utilisent autologue CAR T-cell thérapie, un nombre significatif d'entre eux explorent également l'utilité des cellules allogéniques CAR T8,9,10. Malgré des résultats prometteurs avec des malignités hématologiques, l'utilisation de cellules T CAR pour cibler les tumeurs solides s'est avérée beaucoup plus difficile dans la clinique pour une variété de raisons, y compris, mais pas limité à l'absence de bonnes cibles qui sont exclusivement exprimées dans la tumeur, l'hétérogénéité des tumeurs solides et la tumeur "évasion", et la difficulté que les cellules CAR T ont dans l'accès au microenvironnement tumoral11,12,13,14, 15. Il y a un besoin critique pour le développement des cellules T pleines tumeur-spécifiques de CAR qui peuvent surmonter ces barrières à l'efficacité et le problème de la toxicité de « tumeur de cible-off ». Bien qu'une multitude d'approches in vitro et in vivo soient justifiées dans la conception et l'essai des lymphocytes T CAR, un essai de puissance in vitro robuste et prédictif est d'une importance primordiale16,17.
Afin d'évaluer la puissance des lymphocytes T CAR, diverses méthodes in vitro ont été développées. En général, ces essais de puissance peuvent être divisés en deux grandes catégories selon qu'ils (i) mesurent directement l'activité cytolytique des cellules T de CAR contre les cellules tumorales cibles, ou (ii) mesurent des marqueurs de substitution tels que des cytokines qui sont libérés par les cellules T de CAR pendant qu'elles tuent les cellules cibles. Les techniques qui mesurent l'activité cytolytique comprennent directement l'essai de libération de chrome-51 (CRA)18, les essais basés sur l'imagerie qui mesurent l'apoptose des cellules cibles à l'aide de sondes fluorescentes19,20, et les essais de cytométrie de flux qui détectent les cellules cibles apoptotiques21. Dans ces essais, les lymphocytes T CAR sont généralement co-cultivés avec des cellules cibles qui ont été pré-étiquetées avec des sondes radioactives ou fluorescentes, suivies d'une mesure appropriée. Bien qu'elle ait longtemps été considérée comme l'étalon-or dans le domaine en raison de sa sensibilité, l'ARC présente certains inconvénients. Tout d'abord, il s'agit d'un point de terminaison et ne fournit pas d'informations cinétiques. Deuxièmement, les cellules cibles doivent être étiquetées avec du chrome-51 qui tend à lessituer hors des cellules et peut augmenter de manière significative le bruit de fond22. Enfin, il faut prendre les précautions et l'élimination des déchets radioactifs. Les essais alternatifs, qui mesurent les sous-produits de l'interaction de CELLULES T de CAR avec des cellules cibles comme indication de puissance, incluent la quantitation de diverses cytokines libérées par des cellules T de CAR utilisant des méthodes basées sur la cytométrie de flux ou des essais immunosorbent enzymatiques. Encore une fois, il s'agit d'essais de point de terminaison qui mesurent la libération cumulative des cytokines à un moment donné et, par conséquent, ne reflètent pas nécessairement l'activité cytolytique réelle des lymphocytes T CAR.
Lors de l'élaboration d'un analyse de puissance, en particulier celui qui définit les critères de libération pour une thérapie cellulaire comme une cellule T CAR, il est essentiel que l'analyse implique des manipulations minimales et le temps pratique parce que chaque interaction est une autre variable qui doit être pris en compte et peut diminuer la robustesse globale et la cohérence de l'analyse. En outre, l'interaction des cellules T de CAR avec les cellules de tumeur est un processus dynamique, et fournir l'information au sujet de ces interactions dynamiques, telles que le taux de cytolyse, est d'importance primaire pour l'évaluation de puissance. Avec ces critères à l'esprit, nous avons développé un analyse de puissance cinétique sans étiquette pour les cellules T CAR qui utilise la plate-forme d'analyse cellulaire en temps réel xCELLigence (RTCA). xCELLigence utilise des plaques de microtiter spécialisées (E-Plates) qui contiennent des biocapteurs d'or intégrés dans le fond de chaque puits. Travaillant avec des cellules tumorales solides adhérentes, ou des cellules cancéreuses liquides qui ont été attachées à l'aide d'anticorps spécifiques, ces biocapteurs surveillent en temps réel les changements induits par les cellules T de CAR dans le nombre de cellules cibles, la taille des cellules, la force d'attachement de cellules-substrat, et les interactions de cellule-cellule (c.-à-d. fonction de barrière)17,23,24,25,26,27,28. Le flux de travail est simple et consiste simplement à ensemencer les cellules cibles dans les puits des E-Plates, suivie de l'ajout des lymphocytes T CAR à différents rapports effector-cible (figure 1). Par la suite, comme les biocapteurs surveillent en permanence la viabilité des cellules cibles, les données sont automatiquement affichées en temps réel.
Au cours des 15 dernières années, l'évaluation xCELLigence a été validée pour évaluer la puissance des cellules tueuses naturelles (NK), des lymphocytes T, des lymphocytes T CAR, des inhibiteurs de point de contrôle, des anticorps bispécifiques, des virus oncolytiques, et certaines thérapies combinées17,29,30,31,32,33,34. Récemment, l'assay de puissance de xCELLigence a été évalué pour la fabrication des lymphocytes T (TCR) des lymphocytes T35. Ici nous rapportons employer le système de RTCA pour évaluer la puissance in vitro des cellules t de CAR conçues pour cibler les tumeurs pleines et les tumeurs liquides dans les thérapies cliniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

La thérapie à cellule T du récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour le cancer a réalisé l'avantage clinique significatif pour les malignités hématologiques résistantes et réfractaires telles que la leucémie lymphocytique aigue d'enfance. Des efforts sont actuellement en cours pour étendre cette thérapie prometteuse aux tumeurs solides en plus d'autres cancers hématologiques. Ici, nous décrivons le développement et la production des cellules T puissantes de CAR ciblant des antigènes avec l'expression unique ou préférentielle sur les cellules de tumeur pleines et liquides. La puissance in vitro de ces lymphocytes T CAR est ensuite évaluée en temps réel à l'aide de l'inédit xCELLigence très sensible à base d'impédance. Plus précisément, l'impact de différents domaines de signalisation costimulatory, tels que le récepteur de facteur de nécrose tumorale induit par les glucocorticoïdes (TNFR) (GITR), sur la puissance in vitro des cellules T de CAR est examiné. Ce rapport comprend des protocoles pour : générer des lymphocytes T CAR pour des études précliniques utilisant la transduction de gènes lentiviraux, l'expansion des cellules T de carRAC, la validation de l'expression de la RCA et l'exécution et l'analyse des essais de puissance xCELLigence.

Préparation du lentivirus carare et évaluation de la génération et de la puissance des lymphocytes T cararie Les titers des préparations de lentivirus de CAR ont été déterminés à l'aide d'un kit quantitatif RT-PCR (voir le Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant. Le protocole de titration a d'abord extrait l'ARN du virus, puis mesuré le numéro de copie de l'ARN lentiviral, qui indiquait la quantité de particules virales infectieuses. Le taquet de virus généré à partir d'un plat de 150 mm utilisant le protocole ci-dessus varie habituellement entre 109-1010 copies virales/mL. La figure 2A montre le numéro de cycle RT-PCR par rapport à la force du signal à partir d'un résultat pcR quantitatif représentatif. Une fois que la qualité du virus a été satisfaite, lorsque le teteur était plus grand que 1 x 108 pfu/mL, il a été gelé vers le bas pour la transduction ultérieure de cellules T. Après que les cellules T de CAR aient été transducées avec le lentivirus, les cellules de T ont été cultivées pendant 12-14 jours additionnels, maintenant leur densité autour de 1 x 106 à 2 x 106 cellules/mL. Les lymphocytes T CAR ont ensuite été vérifiés à l'aide d'anticorps spécifiques à l'anti-ScFv à l'aide d'un cytomètre d'écoulement avant une application en aval ou un gel. Un bon résultat de lot représentatif est indiqué à la figure 2B. À l'aide d'un anticorps anti-ScFv, environ 50 % des lymphocytes T carracinés (Q2 50,6 % vs lymphocytes T 1 %), ce qui indique l'expression de la RCA dans environ 50 % des lymphocytes T. Par la suite, l'assougage de puissance de RTCA a été effectué pour la détermination de cytolyse avant que chaque lot de cellules T de CAR ait été congelé vers le bas et prêt pour l'application future. Un cycle de la conception, de la génération et de l'évaluation des lymphocytes T de la RCA a duré environ 1 mois.
Mise à mort des cellules B du lymphome Raji par les lymphocytes T CD22-CAR Le kit d'attache de tumeur liquide anti-CD40 (voir le tableau des matériaux)a été utilisé à une concentration de 4 g/mL pour enrober un E-Plate pendant 3 h à 37 oC. Après avoir lavé les puits avec un tampon d'attache, des cellules lymphomes à cellules B ont été ajoutées à l'E-Plate à une densité de 30 000 cellules/puits. Après avoir permis aux cellules de se contenter de 30 min, l'E-Plate a été remis à l'intérieur de l'instrument xCELLigence, et des lectures d'impédance ont été immédiatement lancées afin de capturer l'attachement et la prolifération cellulaires. Le jour suivant, des lymphocytes T CD22-CAR, des cellules T de la CAR simulée ou des lymphocytes T non transductés ont été ajoutés. Dans la figure 3, un rapport E:T de 10:1 a été utilisé pour tous les types de cellules. Les cellules Raji CD22-positives, traitées avec des cellules T CD22-CAR ont montré l'abattage significatif (trace verte) comparé aux contrôles négatifs (cellules T non transducées et cellules T de MAD de maquereau).
Mise à mort efficace des cellules cancéreuses pancréatiques par les lymphocytes T CD47-CAR CD47 est une glycoprotéine de surface transmembranaire de la superfamille d'immunoglobuline. En tant que protéine intégrine-associée, elle est fortement exprimée dans les cancers hématologiques (leucémie, lymphome, et myélome multiple) et les cancers pleins (tels que l'ovaire, le cancer du poumon à petites cellules, pancréatique, glioblastome) et d'autres types de cancers36,37. CD47 est également connu comme un signal de ne pas manger-moi aux macrophages, ce qui en a fait une cible thérapeutique potentielle dans certains cancers. Les lymphocytes T CD47-CAR ont été produits et testés contre les cellules cancéreuses pancréatiques BxPC3 qui expriment des niveaux élevés de CD4738,39. Les cellules BxPC3 ont été ensemiées dans l'E-Plate le jour 1 à une densité de 10 000 cellules/puits. La surveillance en temps réel a montré que ces cellules ont atteint la confluence après 16 h. À ce moment-là, les lymphocytes T CAR ont été ajoutés au rapport E:T de 10:1(figure 4A). Des cellules effectrices de contrôle comme les lymphocytes T non transduced et les cellules T de MaRC de maquette ont été également ajoutées. Les résultats montrent clairement que les lymphocytes T CD47-CAR tuent sélectivement les cellules cibles BxPC329. De plus, la figure 4B montre que le signal d'impédance lorsque des lymphocytes T CD47-CAR sont ajoutés à un puits vide est considérablement inférieur au signal d'impédance généré par les cellules Cibles BxPC3. La valeur de l'indice cellulaire des puits avec les lymphocytes T CD47-CAR à elle seule a atteint un maximum de 0,14, ce qui n'est que légèrement supérieur au signal du milieu seul (0,02). Ceci indique que dans cet test de mise à mort hétérogène, le signal d'impédance est dérivé presque exclusivement des cellules cancéreuses cibles.
Costimulation des lymphocytes T CAR par le domaine GITR Lorsqu'il est exprimé dans un QF-GITR-CD3 CAR, le domaine costimulatoire GITR a été précédemment signalé pour améliorer le meurtre des cellules cancéreuses SKOV3 EGFR-positives, mais pas EGFR-négatif MCF-7 cellules cancéreuses30. Pour mieux clarifier le rôle du domaine GITR, des constructions CAR contenant le domaine GITR intégral, ou des versions supprimées ou réarrangées du domaine, ont été générées et testées pour la possibilité de coactiver les lymphocytes T CAR (Figure 5A). Les données xCELLigence de la figure 5B,C montrent que le domaine costimulatory GITR améliore l'abattage des cellules t CAR des cellules cibles EGFR-positives au-dessus de ce qui est observé avec la construction originale de CAR qui n'a pas le domaine GITR. En outre, la suppression de 10 acides aminés du domaine GITR (acides aminés 184-193) a aboli cette activité stimulante. En revanche, la réorganisation du positionnement relatif du domaine GITR au sein de la construction cararie s'est avérée moins préjudiciable à ses capacités de stimulation. À l'aide de données de point final, la production d'IFNMD en tant que substitut de l'activation des lymphocytes T a également démontré l'activité stimulante du domaine GITR (Figure 5B). Contrairement aux données de point final qui est un simple "snap shot", le profil d'impédance continue de l'instrument xCELLigence éclaire clairement les différences subtiles dans la cinétique tueur des différents traitements (Figure 5C). Les résultats obtenus ici sont compatibles avec ceux d'une étude in vivo30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Figure 1 : Le système d'analyse cellulaire en temps réel xCELLigence (RTCA) détecte la mise à mort des cellules cibles par les cellules effectrices. Il y a trois étapes conceptuelles principales pour mesurer l'activité de mise à mort des cellules effectrices de T de CAR contre les cellules cancéreuses cibles. Étape 1 : Ensemencez les cellules cibles (c.-à-d. les cellules tumorales) dans le puits d'une plaque Électronique. Les cellules se fixent aux microélectrodes de biocapteurs d'or, ce qui entrave le flux de courant électrique entre les électrodes. Cette valeur d'impédance est mesurée et tracée comme un paramètre sans unité appelé Cell Index. La valeur de l'indice cellulaire augmente à mesure que les cellules grandissent et atteignent un plateau à mesure que les cellules approchent de la confluence. Étape 2 : Les cellules effectrices- cellules immunitaires non adhérentes- sont ajoutées par la suite. Étant donné que ces cellules n'adhèrent pas aux microélectrodes dorées, elles ne provoquent pas directement un changement d'impédance. Étape 3 : Si les cellules effectrices attaquent les cellules cancéreuses cibles, la destruction des cellules tumorales se reflète par une diminution de l'indice cellulaire au fil du temps. Cette activité cytolytique des cellules effectrices, ou la puissance des cellules effectrices, peut être surveillée avec sensibilité et précision. L'acquisition continue de données d'impédance à partir du système xCELLigence permet une analyse cinétique tueur en temps réel pour de multiples conditions simultanément. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Figure 2 : Détermination de la titer de l'évaluation de la cytométrie du lentivirus et du débit des lymphocytes T CAR. (A) Détermination des étiquettes lentivirales. Les différentes lignes de couleur sont des échantillons représentatifs pour le numéro de cycle vs delta Rn. Nombres de cycle faible indiquent une quantité relativement élevée de modèle d'ARN de virus présent dans les échantillons. (B) Après la transduction, les lymphocytes T CAR ont été cultivés et maintenus à une densité inférieure à 2 x 106 cellules/mL, puis soumis à l'analyse du débit. L'axe yreflète la coloration des lymphocytes T, avec des valeurs positives reflétées dans les zones Q1 et Q2. Les deux échantillons sont 100% positifs pour les lymphocytes T. L'expression de CAR scFV est déterminée à l'aide d'un Ab spécifique au scFv(x-axe). Le résultat montre que plus de 50% des lymphocytes T sont scFv positifs dans les lymphocytes T CD22-CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Figure 3 : La dynamique de mise à mort des lymphocytes T CD22-CAR contre les cellules du lymphome de Raji Burkitt. Tandis que la courbe rouge est les cellules de Raji seules, la courbe verte est les cellules de Raji traitées avec des cellules DeT CD22-CAR. Les courbes roses et bleues sont le traitement à cellule T mock CAR et le traitement à cellule T non transduced, respectivement. Le ratio E:T est de 10:1. Les barres d'erreur sont une déviation standard. L'échelle de temps est mise en place à intervalles de 2 h pour un affichage facile, bien que plus de points de données soient disponibles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Figure 4 : Efficacité des lymphocytes T CD47-CAR contre les cellules tumorales solides pancréatiques. (A) Le rose est la cible BxPC3 cellules seules, tandis que le rouge est BxPC3 avec CD47-CAR lymphocytes T ajoutés. Le vert est BxPC3 avec l'ajout de lymphocytes T non transducées, et le bleu est avec les cellules T Mock CAR. Le ratio E:T est de 10:1. (B) Dans le même cadre, le rouge est vide (manquant de cellules cibles) des puits de contrôle avec des lymphocytes T CD47-CAR seulement et le vert est le milieu seulement. Les barres d'erreur sont une déviation standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Figure 5 : Le domaine GITR augmente l'activité cytotoxique des cellules CAR T contre les lignées de cellules tumorales EGFR-positives. (A) Différentes constructions carracinées. (B) Bar parcelles de % cytolyse pour différentes constructions CAR à 4 h (gauche) et 24 h (milieu). La production d'IFN à 24 h est affichée sur la droite. (C) Évaluation continue des mises à mort pour toutes les constructions. La courbe noire est la courbe de croissance des cellules cancéreuses ovariennes BxPC3 seulement. La courbe verte est les cellules cibles traitées uniquement avec des lymphocytes T, la courbe bleue est les cellules cibles traitées avec des lymphocytes T Mock CAR, la courbe rouge est les cellules cibles traitées avec des cellules T EGFR-GITR-CD3-CAR, la courbe rose est les cellules cibles traitées avec des cellules T EGFR-GITR-CD3-CAR, et la courbe brune est les cellules cibles traitées avec des cellules EGFR-CD3-GITR-CAR T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence analyse cellulaire en temps réel vous permet de surveiller quantitativement l’abattage des cellules cancéreuses par des cellules immunitaires dans des conditions sans étiquette et au cours de plusieurs jours. Ce système fournit un cours complet de temps de tuer des cellules cancéreuses cibles permettant le criblage simultané d’un grand nombre de constructions, types de cellules effectrices, ou thérapies combinées à de faibles ratios effecteur/cible. Commencez par ensemencement 1,5 fois 10 aux sept cellules HEK293FT dans le milieu de culture DMEM dans un plat de culture cellulaire de 150 millilitres pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec humidité.Le lendemain matin, mélanger 2,5 millilitres de solution de dilution transfection complétée par cinq microgrammes d’ADN plasmide vecteur lentiviral et 22,5 microgrammes de mélange d’emballage lentiviral avec 82,5 microlitres de réaccente transfection dans 2,5 millilitres de solution de dilution transfection. Après une incubation de 15 minutes à température ambiante, transférer la chute de réaction sage dans le plat des cellules HEK293FT et retourner les cellules à l’incubateur pour une deuxième incubation d’une nuit. Le lendemain matin, remplacez le supernatant par 19 millilitres de milieu de culture DMEM frais et retournez les cellules à l’incubateur pendant la nuit.Recueillir le supernatant dans un seul tube conique de 50 millilitres pour un stockage de quatre degrés Celsius pendant les deux prochains jours avant de sédimenter le lentivirus par centrifugation le deuxième matin afin d’éliminer les cellules ou les débris de la solution. Transférer tout sauf environ un millilitre du lentivirus contenant du supernatant dans un tube de centrifugeuse ultra clair pour une ultracentrifugation. Après l’ultracentrifugation, aspirez soigneusement le virus résiduel contenant du supernatant, ajoutez doucement 100 microlitres de DMEM à la pastille et placez le tube sur la glace pendant 15 minutes.À la fin de l’incubation, mélanger délicatement la solution et aliquot la solution de lentivirus en tubes stériles pré-réfrigérés pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Déterminez ensuite le titer du lentivirus par RT-PCR quantitatif selon les instructions du fabricant. Pour la génération et l’expansion des cellules CAR-T, activez une à deux fois 10 des six cellules mononucléaires périphériques du sang dans un millilitre de milieu cellulaire CAR-T avec un nombre égal de microbilles enduites de CD3/CD28 dans un puits d’une plaque de 24 puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Les deux matins suivants, mélanger un microlitre d’agent exhausteur de transduction avec les cellules suivie de l’ajout de lentivirus à une multiplicité d’infection de cinq à un. Surveillez la croissance des cellules T tous les deux à trois jours en ajoutant un milieu de cellule CAR-T frais au besoin pour maintenir les cellules à une à deux fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre. Pour détecter l’expression de la RCA à cellule T par cytométrie d’écoulement, transférez trois fois 10 à la cinquième CAR et les lymphocytes T non transduced dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 1,5 millilitre.Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés dans 200 microlitres de tampon FACS complété par 1% sérum humain. Divisez chaque échantillon cellulaire en aliquots de 100 microlitres dans des tubes facs en polystyrène de cinq millilitres individuels sur la glace. Après cinq minutes, ajouter un microlitre de fragments fab2 biotinylés d’anti-souris de chèvre FAB2 à un tube de chaque type de cellule et deux microlitres d’anticorps anti-étiquettes étiquetés PE à l’autre tube de chaque type de cellule avec un mélange complet.Après 30 minutes sur la glace, laver les cellules avec trois millilitres de tampon FACS frais et après centrifugage décanter les supernatants. Resuspendez les granulés dans le supernatant restant et ajoutez deux microlitres d’anti-CD3 APC et deux microlitres de 7-AAD à chaque tube. Ajouter un microlitre de Streptavidin étiqueté PE avec un bref mélange au tube taché d’anticorps anti-FAB2 et incuber tous les tubes sur la glace pendant 30 minutes.À la fin de l’incubation, analyser les cellules par cytométrie d’écoulement selon les protocoles standard s’entillonnant les lymphocytes T par dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale et l’expression CD3 contre 7-AAD. Pour un essai de puissance de cytolyse en temps réel, ajoutez 50 à 100 microlitres de milieu de culture cellulaire cible à chaque puits d’une plaque électronique et mesurez l’impedance de fond dans un instrument d’analyseur cellulaire. Détecter les cellules cancéreuses cibles à partir de la plaque de culture à l’aide de trypsine.Laver les cellules en 15 millilitres de culture fraîche moyenne et centrifugeuse. Resuspendez la pastille de cellules cancéreuses en cinq millilitres de milieu frais pour compter et ajuster la densité cellulaire à la concentration appropriée de cellules cibles. Ajouter les cellules au nombre approprié de puits et laisser la plaque électronique pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément sur le fond des puits.À la fin de la période d’équilibrage, placez la plaque dans l’analyseur cellulaire en temps réel et lancez automatiquement la mesure de l’impédance toutes les 15 minutes pendant la nuit. L’adhérence et la prolifération des cellules cibles peuvent être suivies en temps réel. Le lendemain matin, diluer l’effecteur CAR et contrôler les cellules T à la concentration appropriée dans les tubes individuels et enlever 50 à 100 microlitres de chaque puits de la plaque électronique de sorte que le volume final dans chaque puits est de 100 microlitres.Ensuite, ensemencer l’effecteur et contrôler les cellules T dans les puits appropriés à l’effecteur approprié par rapport aux ratios cible dans 100 microlitres de milieu par puits. Ensuite, équilibrer la plaque électronique pendant 30 minutes à température ambiante avant de retourner la plaque au système d’analyseur cellulaire. Pour mesurer l’efficacité du meurtre par la cellule T des cellules cancéreuses cibles, surveillez la mise à mort médiatisée du CAR-T pendant 96 heures.Environ 50 % des cellules CAR-T ont été tachées de positif pour l’anticorps à fragment variable à chaîne unique indiquant l’expression de la RCA dans environ 50 % des cellules T. Dans cette expérience représentative, un rapport effecteur/cible de 10 pour un a été utilisé pour tous les groupes. Les cellules Raji seulement et les cellules T CD22-CAR traitées par cellule Raji présentaient des pertes significatives par rapport à la cellule T de contrôle seulement et aux groupes de cellules MOCK CAR-T.Dans cette expérience, seules les cellules CD47-CAR-T étaient efficaces pour tuer les cellules cancéreuses pancréatiques. En outre, le signal d’impédance des cellules CD47-CAR-T seules n’était que légèrement supérieur au signal de l’indice cellulaire mesuré dans les puits moyens seuls, ce qui indique que le signal d’impédance résultant des cellules de suspension telles que les cellules CAR-T est minime et ne contribue pas au signal d’impédance global lorsque les cellules CAR-T sont ajoutées aux cellules cancéreuses cibles. Il est à noter que le domaine de la costimulation gitr a été observé pour être plus efficace dans l’amélioration de la mise à mort des cellules CAR-T contre les cellules cibles positives du récepteur du facteur de croissance épithéliale par rapport aux constructions car originales sans le domaine GITR.Le milieu des puits de plaques électroniques peut être collecté pour analyser le profil de cytokine à des moments où il y a lieu pendant ou après l’analyse en fonction des besoins de l’expérience. Dans l’ensemble, xCELLigence a amélioré l’efficacité de l’évaluation de la puissance de diverses immunothérapies allant des engageurs de cellules T bi-spécifiques et des virus oncolytiques aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans les thérapies combinées.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

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Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imagerie haute résolution et ultra-résolution des cellules T à l&#39;aide de madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...