Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

המחברים מודים ProMab Biotechnologies ו ביוטכנולוגיה ביולוגית עבור מתן ריאגנטים וכלים מנוצל במחקר זה.

1. הדור של הרכב קידוד מווירוסים
הערה: לאחר הבנייה הספציפית של מכונית T-cell בנייה הושלמה (CD47 ואחרים), מכוניות לעדשה מופקים על ידי ההליך הסטנדרטי, באמצעות 293 FT, שילוב אריזות ויראלי, ו החוצה סוכנים (לראות את הטבלה של חומרים) כמתואר29. לאחר מכן, השתמש בתגובת שרשרת הפוכה כמותית (RT-PCR) ערכת ו ציקלנר תרמי (לראות את הטבלה של חומרים) כדי לקבוע את סיכוייו וירוס על ידי מדידת כמות RNA ויראלי על פי פרוטוקול היצרן. חשוב כי כל ההליכים הנגיפיים יבוצע בקפדנות בהתאם לדרישות הבטיחות.
<ol><li>זרעים 15 x 106 HEK293FT תאים בינונית שונה של הנשר של העיט (dmem) ו-מודחת התאים לילה ב 37 ° c בצלחת 1 150 מ"מ בתוך מחולל לחות 5% CO2 חממה.</li>
	<li>הכן 2 15 מ ל צינורות עם מכלול הזיהום. הצינור הראשון מכיל את ה-DNA וקטור וקטורי באמצע (5 μg) ו לערבב אריזות ויראליות (22.5 μg) ב 2.5 mL של פתרון דילול החצייה. הצינור השני מכיל 82.5 μL של העברה מגיב בשנת 2.5 mL של תמיסת דילול החצייה (עיין בטבלת החומרים).</li>
	<li>ללטף את התוכן של צינור 1 לתוך צינור 2, ו מודאת התערובת בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.</li>
	<li>להעביר את התוכן של הצינורית הצינור אל המנה של תאים HEK293FT ו מודחת את המדגם לילה ב 37 ° c בתוך מחולל לחות 5% CO2 חממה.</li>
	<li>למחרת, להחליף את המדיום הקיים עם 19 מ ל של בינוני התרבות DMEM טרי ולהמשיך לעבור את התאים לילה בתוך מחולל לחות 5% CO2 חממה ב 37 ° c.</li>
	<li>להעביר את המדיום ממנה לצינור צנטריפוגה 50 mL. שמור את הצינור עם המדיום המכיל את הווירוס במקרר.</li>
	<li>חזור על ההליך הנ ל, הוספת DMEM טרי ואיסוף שוב לאחר יום אחד.</li>
	<li>לשלב שני אוספים של התקשורת לתוך שפופרת צנטריפוגה אחת. Centrifugate הצינור ב-2,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>להעביר את רוב הנגיף המכיל את הסופר-וירוס לצינור הצנטריפוגה. השאר אמצעי אחסון מינימלי, בערך 1 מ ל, של סופרנטאנט כדי למנוע הפרעה לגלולה העשויה להכיל תאים ו/או פסולת.</li>
	<li>Ultracentrifuge למעלה מובהר על-ידי supernatant ב 110,000 x g עבור 100 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות להוסיף בעדינות 100 μL של מדיום Dמאמ לגלולה וירוס בתחתית הצינורית. להשאיר את השפופרת על הקרח 15 דקות. לערבב את הפתרון בעדינות ולאחר הפתרון הווירוס לתוך צינורות סטרילי מקורר. אחסן אלה צינורות מלאי וירוס במקפיא-80 ° c.</li>
	<li>השתמש בערכת RT-PCR כמותי כדי לקבוע את סיכוייו של הנגיף על פי פרוטוקול של היצרן, אשר מחלץ ומודד רנ א ויראלי.</li>
</ol>2. הדור והתרחבות של תאי T רכב
<ol><li>הפעלה בעבר קפוא האדם PBMCs (על 1 x 106 כדי 2 x 106 תאים) ב 1 מ ל של מכונית T-cell בינונית עם מספר שווה של CD3/CD28 מצופה מיקרוחרוזים (לראות את הטבלה של חומרים) ו-מודטה את התאים ב 37 ° c בתוך מחולל שכונתיות 5% CO2</li>
	<li>להפשיר את המניה של מלאי הנגיף על הקרח.</li>
	<li>הוסף 1 μL של התמרה שיפור הסוכן לתוך הבאר עם התאים ולערבב.</li>
	<li>הוסף וירוס לתאים בריבוי של זיהום (מוי) של 5:1 ולערבב בעדינות. ביום שלמחרת, חזרו על שלב זה (24 שעות לאחר התמרה הראשונה).</li>
	<li>לעקוב אחר צמיחת התא T כל 2-3 ימים. הוסף יותר בינוני מכונית חדשה T-cell כדי לשמור על התאים בצפיפות של 1 x 106 כדי 2 x 106 תאים/mL.</li>
	<li>להקפיא את התאים T רכב עם פרוטוקול סטנדרטי באמצעות הקפאת פתרון (לראות את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>הפשרת מכונית T תאים באמצעות שיטה סטנדרטית ולקדם את פניהם במדיום רכב T-cell עבור כ ~ 2-4 h עם IL-2 (300 יחידות/mL) לפני החלת אותם על הצורך.</li>
</ol>3. זיהוי של ביטוי רכב על ידי הציטוצינסי זרם
<ol><li>העברה 3 x 105 מכונית T תאים ולא התמרה תאים מעבר לשני שפופרות נפרדות 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 2 דקות ולהשעות מחדש את התאים ב 200 μl של מיון תא המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (facs) מאגר המכיל 1% סרום אנושי.</li>
	<li>Pipet 100 μL של פתרון התאים לשני 5 מ ל פוליסטירן מצינורות FACS ולשמור על הצינורות על הקרח עבור 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 1 μL של עז biotinylated נגד עכבר F (ab)2 לצינור אחד של כל סוג תא. לאחר מכן, הוסף 2 μL של נוגדן נגד תגים של PE (ראה את טבלת החומרים) לצינור השני של כל סוג תא. מערבבים היטב ומשלבים אותם על הקרח 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 3 מ ל של מאגר FACS בכל צינור, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 5 דקות; להיפטר הסופרנטנים ומערבולת בקצרה מאוד או לנער את הצינורות לזמן קצר להשעות את התאים שיורית נוזל.</li>
	<li>הוסף 2 μL של APC anti-CD3 ו 2 μL של פתרון נוגדן 7-עמ (לראות את הטבלה של חומרים) על כל צינור. בתוך הצינור של תאים מוכתם נגד F (ab)2 ab, להוסיף 1 μl של streptavidin התווית PE. מערבבים בקצרה את הצינורות על הקרח עבור 30 דקות יותר.</li>
	<li>השתמש במאגר FACS כדי לשטוף את התאים שוב כמתואר בשלב 3.5 ולהוסיף תוספת 200 μL של מאגר FACS לכל צינור.</li>
	<li>השתמש בזרימה cy, try כדי לנתח את התאים על-ידי בפעם הראשונה על התאים T בתוך מגרש פיזור של פיזור לעומת צד ולאחר מכן על התאים החיים (7-עמ מ-שלילי) בעלילה CD3 vs. 7-עמ מ. השלב האחרון הוא לנתח אנטי-תג, anti-ScFv או anti-F (ab ')2 VS. CD3.</li>
</ol>4. שיטת העוצמה בזמן אמת של cytolysis
הערה: בצע את הסדר RTCA בהתאם לתנאים המומלצים של היצרן. בקצרה, צלחת ראשונה את תאי היעד בבארות של E-פלייט, ואחריו תוספת של תאי T רכב ביום למחרת. הפעילות cytolysis של תאים T רכב נגד תאי היעד מנוטרים בזמן אמת. תאים t ו-ללעוג התמרה תאים (המכונית מדגם T) משמשות כפקדי תא שליליים שלילי. הפרוטוקול הבא מתאר מחוץ גופית בזמן אמת העוצמה cytolysis העוצמת עבור שורות תאים הגידול חסיד.
<ol><li>הוסף 100 μL של מדיום תרבות תא היעד לכל טוב של xCELLigence E-פלייט, למקם את הצלחת בתוך המכשיר xCELLigence, ולקחת ברקע קריאה. ואז, להעביר את הלוח האלקטרוני לשכונה של תרבות הרקמה לזריעת תאים.</li>
	<li>השתמש בפרוטוקול סטנדרטי כדי טריסינזציה של תאים סרטניים במטרה מהתקן התרבות. ואז להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולהוסיף מדיום תרבות טרייה, עד 15 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g. להשליך את הסופרנטאנט, להוסיף 5 מ ל של בינוני טרי, ולהשתמש בצנרת סרוולוגית כדי להשהות בעדינות את הגלולה התא. לספור את צפיפות תאים חיים באמצעות הומוציטוטומטר ומיקרוסקופ.</li>
	<li>כוונן את צפיפות התא כראוי ולאחר מכן להוסיף 100 L של הבולם התא לכל באר של E-פלייט. מספר תא היעד הוא בדרך כלל סביב 10,000 תאים/גם עבור קווי תאים חסיד (BxPC3, הלה-CD19, ו SKOV3), או 30,000 תאים/גם עבור תאים ההשעיה כגון ראג'י (ראה להלן פרטים על בארות ציפוי מראש עם נוגדנים על מנת לקשור תאים סרטניים נוזלי).</li>
	<li>הצלחת הלוח האלקטרוני בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה בתחתית הבאר (זה קריטי; אין לדלג על שלב זה).</li>
	<li>מניחים את הלוח האלקטרוני לתוך המכשיר xCELLigence בתוך החממה תרבות התא ולהתחיל למדוד עכבה, מוצג כמו מדד התא לעומת זמן, אוטומטית כל 15 דקות.</li>
	<li>למחרת, הכינו את. המצברים של מכונית טי הקפד להכין את הפקדים המתאימים (כלומר, ללעוג רכב T תאים, לא התמרה תאים T בקרה, ו/או תאי מכונית T קשור) לפני הזמן כדי להבטיח את כל התאים מוכנים באותו זמן. התאם את התאים האפקטור ואת תאי הבקרה לצפיפות המתאימה, והכינו מדלל טורי כדי להבטיח את היחס הרצוי של E:T יהיה כאשר 100 μL של השעיית תא הבולם מתווסף לכל טוב בשלב 9.</li>
	<li>השהה xCELLigence רכישת נתונים והבא את הלוח האלקטרוני מהאינקובטור למכסה של תרבות התא.</li>
	<li>הסר 100 μL של בינוני מכל באר. כמות שיורית בינונית בכל באר היא עכשיו 100 μL.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מדולל בתאי מכונית T או תאי בקרה אחרים (כלומר, ללעוג רכב T תאים) כדי להשיג את היחס הרצוי E:T.</li>
	<li>הצלחת הלוח האלקטרוני בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות כדי לאפשר לתאי אפקטור להתיישב, ולאחר מכן למקם את הלוח האלקטרוני בחזרה לתוך כלי xCELLigence. . לחדש את רכישת הנתונים</li>
	<li>אם כל כך רצוי, בנקודות זמן מפתח xCELLigence רכישת נתונים ניתן להשהות את הצלחת הוסרו כדי לאסוף דגימות קטנות כדי להיות מנותח על ידי אורתוגלוונאליות בחני (כלומר, מדידת הייצור ציטוקינים על ידי אליסה או הזרימה cy, try).</li>
	<li>ב-EGFR-גיאר-CD3 רכב T-cell ניסוי, למדוד תשואה INFγ עם ערכת אליסה (בצע את ההוראות של היצרן; לראות את הטבלה של חומרים). הערה לגבי השימוש בסרטן נוזלי: עבור בדיקות תאים סרטניים המטאולוגיים, לפני הוספת תאים הבארות של E-פלייט מצופים תחילה עם נוגדן כי הוא ספציפי אנטיגן כי הוא ביטא על פני השטח של התאים הסרטניים. עבור קו הטלפון של ראג'י B מגיב בהתאם anti-CD40 משמש (ראה ערכת הריגת הגידול נוזלי בטבלה של חומרים). להלן ההליך לציפוי הצלחת:</li>
	<li>דלל את המאלף (anti-CD40) עם מאגר הקשירה לריכוז של 4 μg/mL.</li>
	<li>עבודה בתוך המכסה של תרבות הרקמה, להוסיף 50 μL של מגיב מדולל המממנת כל טוב של E-פלייט. השאירו את הלוחית האלקטרונית בטמפרטורת החדר או בחממה של 37 ° c במשך 3 שעות.</li>
	<li>הסר את המנה הכימית ושטוף את הלוח האלקטרוני לפחות 2x עם מאגר הכביסה. בשלב זה, E-פלייט מוכן לזריעה את תאי היעד של ראג'י (30,000 תאים/טוב).</li>
	<li>המשך בשלב 4.1 (לעיל) כדי לבצע את שאר הפרוצדורה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+Therapy:+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy.">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>June, C. H., O&#8217;Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>. FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017)</li><li>. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017)</li><li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China.">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology &#38; Oncology. 10 (1), 166 (2017).</li><li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy.">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li><li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells.">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li><li>. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017)</li><li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf.">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li><li>D&#8217;Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &#38; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors.">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li><li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric-antigen+receptor+T+(CAR-T)+cell+therapy+for+solid+tumors:+challenges+and+opportunities.">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors.">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li><li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy.">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li><li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis.">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li><li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+chromium-51+release,+cell-mediated+cytotoxicity+assay:+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells.">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li><li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry.">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).</li><li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse.">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Unit+7:+51Cr+release+assay+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+(ADCC).">Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).</a> Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements.">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li><li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays.">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li><li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability.">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li><li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies:+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels.">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering &#38; Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li><li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth.">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li><li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer.">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation.">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li><li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system.">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).</li><li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells.">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li><li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape.">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules.">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).</li><li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47/SIRPalpha+axis.">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li><li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD47:+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy.">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li><li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine,+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+(P4455).">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer.">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy.">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening.">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).</li><li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technology+and+patient+cells:+from+early+drug+development+to+precision+medicine.">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li></ol>

המחברים מבצעים מחקר בפיתוח מכונית T-cell ואת העוצמה המשויכת מוסר אשר הם האינטרסים העסקיים של ProMab Biotechnologies ו-מדעי הביולוגיה, בהתאמה. עם זאת, אין בכך כדי לשנות את דבקות המחברים למשימתו של יופיטר להגברת הפצת הידע המדעי. התנאים של פרסום זה נבדקו ואושרו על ידי ProMab Biotechnologies ו-מדעי הביולוגיה תרופת פלא בהתאם למדיניות המחקר שלה.

קולטני אנטיגן כימריים הם חלבונים עלת מורכב משבר בודד שרשרת יחיד משתנה (scfv אזור), אזור ציר, אזור טרנסרפידת, ותחום cytoplasmic המורכב של tcr איתות דומיינים ותחומים נוספים מגירוי מפני קולטנים כגון CD28 ו OX4011,40. כדי לעצב מכוניות בטוחות, סלקטיבית, ו תכליתי, זה הכרחי כי התמורות השונות בעיצוב של המכוניות נבדקו ביסודיות באמצעות העוצמה מחוץ למבחנה ובסופו של דבר, מודלים בעלי חיים. במחקר זה, סיפקנו פרוטוקול וזרימת עבודה לגבי האופן בו בזמן אמת בעזרת שיטת החוץ הגופית יכולים ליידע את העיצוב של מכוניות מסוימות.
בעיצוב כל סוג של שיטת העוצמה, במיוחד למטרות ייצור, הכרחי שהייחודיות תהיה רגישה, איתנה, עקבית וקרובה למנגנון הפעולה ככל האפשר16,17,41. שיטת העוצמה בזמן אמת שתוארה כאן נועדה למדוד את הפעילות cytolytic של תא T רכב ישירות ולא באמצעות סמן פונדקאית כגון שחרור cyטוקין. מעבר לכך, השיטה אינה דורשת כל מרכיב נוסף, כגון צבעים או ריאגנטים, מלבד צלחת הקיום (E-פלייט) והמדיה המומלצת לשמירת התאים. בנוסף, הגישה רגישה להפליא ומספקת נתונים מאוד מושווים בהשוואה ל-בחני42,43,44. יתרה מזאת, הxCELLigence הינה קלה לשימוש ביחס נמוך מאוד של אפקטור למטרה, המהווה יעד אידיאלי להערכת cytolysis ספציפי.
כדי להדגים את הגמישות ואת השירות של מערכת xCELLigence, יש לנו התמקדו שני סוגי הגידול, כלומר גידולים של המקור המטולוגי וגידולים מוצק. על מנת להעריך את העוצמה של תאים בבימויו של רכב T CD22, התאים ראג'י (כלומר, תא B-cell לימפומה קו) היו קשור E-צלחות באמצעות נוגדן anti-CD40. הקשירה של תאים של ראג'י לתחתית הלוחות האלקטרוניים גורמת לאות עכבה המשקפת את הכדאיות ואת מספר התאים של ראג'י בבאר. בעקבות התוספת של תאי T CD22-CAR, התאים ראג'י הם נהרגו באופן סלקטיבי בזמן, ו-והוא תלוי בצורה, ששיאה בירידה תלוי זמן באות העכבה. הירידה בעכבה מרמזת על cytolysis או אובדן הכדאיות של התאים ראג'י17. הגישה הסלקטיבית הזאת באמצעות נוגדנים ניתן להרחיב את קווי הגידול הנוזלי אחרים תאים. אסטרטגיה חלופית לשימוש קווי הגידול התאים של המקור המטולוגי היא להשתמש בתאי סרטן חסיד אשר מתוכננים באופן בלתי נשכח אנטיגנים הגידול, כגון CD19 מבוטא בתאי הלה. היתרון של גישה זו הוא כי תאי הלה הורית זמינים והוא יכול לשמש כפקד שלילי עבור הספציפיות. גישה כזו כבר אומת עם תאים cho-CD22 לעומת צ'ו ו-CHO-BCMAs vs. צ'ו תאים29. באמצעות גישות שונות כאלה, מכונית T-cell עיצוב ויעילות ניתן לבדוק בקלות. הxCELLigence הוא גמיש באופן מיסודו, וניתן לכוונן תנאי שינוי כדי להגיע לתנאים פיזיולוגיים משוערים.
אחד היתרונות העיקריים של שיטת העוצמה שתיארנו כאן הוא שזהו מינון פונקציונלי פשוט וניתן להשתמש בו בשילוב עם טכניקות הנדסיות גנטיות לתכנון מכוניות אופטימליות ומיטביות בצורה של תפוקה גבוהה. כפי שמוצג כאן עבור תאים T רכב שנועד למקד את התאים הסרטניים EGFR-חיובית, הבקשה ניתן להשתמש כדי להעריך את הפעילות היחסית של בנייה רכב שונים/מוטציות. לדוגמה, הצגנו כי כאשר מתחם ה-, ממוקם במעלה הזרם של התחום CD3, הוא מראה פעילות cytolytic חזקה הרבה יותר מאשר כאשר הוא נמצא במורד הזרם של התחום CD3.
למרות שזה לא מתאם באופן מושלם עם פעילות תא T vivo CAR, בשחרור מחוץ לבית השימוש מבחינה גופית יש היסטורית משמש כמדד של מכונית T לעוצמת תא. למרות שהיעילות המבוססת על xCELLigence מתוארת כאן יכולה לשמש להערכת טיפולים מבוססי תא במהלך הייצור או לפני שפורסמו עבור יישום קליני, כמה טוב התוצאות הללו לתאם עם vivo יעילותם עדיין לא וקמה. בvivo היעילות תלויה במגוון גורמים ומשתנים שאינם מובנים מראש בתוך שיטת חוץ גופית. משתנים כאלה כוללים: הביות של תאי T רכב לאתר של הגידול, גירוי והפעלה של תא T רכב ויכולתה להתמיד בתוך המטופל, ואת מיקרוסביבה הגידול. עם עידון נוסף הxCELLigence מסוגל לדגמן חלק מתהליכים מורכבים אלה בתוך מבחנה.
הפרוטוקול המסופק כאן חל על מרבית התאים של סרטן מחסיד וחלק קווי הגידול נוזלי. דגימות קליניות כגון תאים סרטניים ראשוני, עם זאת, צריך להיות נבדק ואופטימיזציה יותר בשל המורכבות של סוגי הגידול והשלבים. זה בהחלט שווה לציין כי מערכת שיטת האנרגיה מחוץ למערכת תיאר כאן משתמשת שורות תאים סרטניים רק כדי לשקף את הפעילות הפוטנציאלית של תאי T רכב. המצב הגידול האמיתי בתוך הגוף האנושי הוא הרבה יותר מורכב, במיוחד כאשר גידול מוצק מכוון, בשל סביבת הגידול הדינמי ופיתוח. לכן, תוצאת הערכת העוצמה לא יכול לתרגם היטב את היעילות הקלינית של תאי T רכב נבדק.
לסיכום, המוצג מבוסס עכבה פלטפורמת xCELLigence מאפשר ניטור ללא תווית של הריגת תאים לתקופה ממושכת של זמן, כלומר עד 10 ימים. קיבולת זו עבור קנה מידה ארוך כל כך של איסוף נתונים מבדיל את הטכנולוגיה מתנאי אחר הנמצאים כעת בשימוש והדורשים הגדרת משכפל ניסיוני מרובים עבור אוסף נקודות זמן ותפעול לדוגמה מפרך. יתר על כן, התרומה אות מינימלית של התאים החיסוניים של האפקטור מפשט את ניתוח הנתונים. התוכנה יכולה לעבד נתונים באופן אוטומטי וליצור פרמטרים שימושיים כגון אחוז cytolysis, KT50, וכו '. הטכנולוגיה כבר הוכיחה רגישות גבוהה (עם יחסי E:T נמוך כמו 1:20) וטווח דינמי גדול (עם יחס E:T מ 20:1 ל 1:20), אשר לא ניתן להשיג בקלות עם assays אחרים. בסך הכל, היישום של טכנולוגיה זו צריך לאפשר ניתוח נתונים מדויק יותר בקנה מידה גבוה יותר שישפר את ההתפתחות של ריאגנטים T-cell מכונית, לקדם את השדה בקצב גבוה הרבה יותר.

בשנים האחרונות, לטיפול ברכב T-cell היה אחד פריצות דרך הבולטים ביותר בטיפול חיסוני סרטן עבור ממאירות הישנות ועקשן המטפאות. עם מינהל המזון והתרופות האחרון בארה ב (FDA) אישור של תאים CD19 בבימויו של מכונית T עבור לוקמיה לימפובלסטית חריפה, שאינם הודג לימפומה, ו לפזר לימפומה גדולים תא b, ואת הייעוד של טיפול פריצת דרך עבור B-cell התבגרות אנטיגן (bcma)-בבימויו של מכונית T תאים מיאלומה נפוצה, טכנולוגיה זו יצרה התרגשות גדולה בקהילה המדעית והוא מתודלקרבים בסיסיים, מיושם, וקליני מחקרים ברחבי העולם1,2, 4,5. בינואר של 2019, יותר מ 700 ניסויים קליניים נרשמו במאגר הניסוי הקליני (clinicaltrials.gov); כ 450 של מבחנים אלה היו או להתחיל או היו באופן פעיל גיוס חולים. רוב הניסויים הקליניים מתמקדים ממאירות המטולוגית, וניסויים קליניים ניצול תאי T מכונית מיקוד CD20, CD22, ו bcmas, בנוסף CD19, הם שוטפים כמו גם6,7. בעוד רוב הניסויים משתמשים בטיפול אוטוולוגי מכונית t-cell, מספר משמעותי של אותם הם גם לחקור את השירות של המכונית allogenic T תאים8,9,10. למרות התוצאות המבטיחות עם ממאירות המטולוגית, השימוש בתאי t מכונית ליעד גידולים מוצקים הוכיחה להיות הרבה יותר קשה בקליניקה עבור מגוון סיבות, כולל אך לא מוגבל להעדר מטרות טובות אשר מבוטא באופן בלעדי בגידול, טרוגניות של גידולים מוצקים והגידול "לברוח", ואת הקושי כי מכונית לתאי T יש גישה מיקרוסביבה הגידול11,12 15. יש צורך חיוני לפיתוח של מוצק הגידול בתאי T רכב אשר יכול להתגבר על המחסומים האלה יעילות ואת הבעיה של "על המטרה-off גידול" רעילות. בעוד שפע של מבחנה בגישות vivo מוצדקת בעיצוב ובדיקה של תאי T מכונית, חזקה וניבוי ברמת העוצמה מחוץ לגופית הוא בחשיבות העיקרית16,17.
כדי להעריך את העוצמה של תאי T רכב, שונים בשיטות מבחנה התפתחו. באופן כללי, העוצמה האלה ניתן לחלק לשתי קטגוריות רחבות, תלוי אם הם (i) ישירות למדוד את הפעילות cytolytic של מכונית T תאים נגד תאים סרטניים היעד, או (ii) למדוד סמנים פונדקאית כגון ציטוקינים שפורסמו על ידי תאי T רכב כפי שהם להרוג את תאי היעד. טכניקות המודדים פעילות cytolytic ישירות כוללים את הבחינה כרום-51 שחרור (מדבר)18, הדמיה מבוסס בחני אשר למדוד ואפופטוזיס של תאי היעד באמצעות הפלורסנט בדיקה19,20, וזרימה cy, לנסות בחני לזהות תאים היעד האפוטוטיים21. באלה assays התאים המכונית T הם בדרך כלל שיתוף תרבותי עם תאים היעד אשר כבר מראש עם בדיקה רדיואקטיבית או פלורסנט, ואחריו מדידה המתאימה. למרות שכבר מזמן נחשב לסטנדרט הזהב בתחום בשל רגישותו, למעברה יש כמה חסרונות. ראשית, זהו שיטת נקודות קצה ואינה מספקת מידע קינטי. שנית, את התאים היעד צריך להיות מתויג עם כרום-51 אשר נוטה לליץ מתוך התאים והוא יכול להגדיל באופן משמעותי את רעש הרקע22. לבסוף, זה דורש אמצעי זהירות נאותים וסילוק הפסולת הרדיואקטיבית. חלופה חלופית, אשר למדוד תוצרי לוואי של מכונית T-cell אינטראקציה עם תאי היעד כאינדיקציה של העוצמה, לכלול את הקוונט של ציטוקינים שונים שפורסמו על ידי מכונית T התאים באמצעות שיטות מבוססות הזרימה cy, או האנזים מקושר האנזימים assays. שוב, אלה נקודות הקצה אומר מה למדוד את המהדורה המצטברת של ציטוקינים בנקודת זמן נתונה, ולכן, לא ייתכן בהכרח לשקף את הפעילות cytolytic בפועל של תאים T רכב.
בעת פיתוח שיטת העוצמה, במיוחד אחד המגדיר את קריטריוני השחרור עבור טיפול מבוסס תא כגון מכונית T-cell, זה קריטי כי הדרישות כרוכות מניפולציות מינימליות והידיים על הזמן, כי כל אינטראקציה היא משתנה אחר שצריך להיות שנספרו והוא יכול להפחית את החוסן הכולל ועקביות של הטיפול. יתר על כן, האינטראקציה של תאי T רכב עם תאים סרטניים הוא תהליך דינמי, ומספק מידע על אינטראקציות דינמיות אלה, כגון שיעור cytolysis, הוא בחשיבות העיקרית להערכת העוצמה. עם הקריטריונים האלה בראש, פיתחנו ללא תווית שיטת העוצמה קינטי עבור תאי T מכונית מנצל את xCELLigence בזמן אמת ניתוח התא (RTCA) פלטפורמת. xCELLigence משתמשת לוחות microtiter מיוחדים (E-צלחות) המכילים ביוחיישנים זהב מוטבע בתחתית של כל באר. עבודה עם תאים הגידול מוצק חסיד, או תאים סרטניים נוזלי כי כבר קשור באמצעות נוגדנים ספציפיים, אלה ביולוגי לפקח בזמן אמת מכונית T שינויים המושרה בתא היעד מספר תא, גודל התא, תא-מצע הקובץ המצורף, ואינטראקציות תא תא (כלומר פונקציית המכשול)17,23,24,25,26,27,28. זרימת העבודה היא פשוטה וכרוכה פשוט לזריעה את התאים היעד לתוך הבארות של E-צלחות, ואחריו תוספת של תאי T רכב ביחס שונה שונים ליעד (איור 1). לאחר מכן, כשהחיישנים הביואקטיביים מנטרים ברציפות את הכדאיות של תאי היעד, הנתונים מוצגים באופן אוטומטי בזמן אמת.
במהלך 15 השנים האחרונות הxCELLigence מאומת על הערכת העוצמה של הרוצח הטבעי (NK) תאים, t תאים, מכונית t תאים, מעכבי במחסום, נוגדנים מסוימים, וירוסים oncolytic, וכמה טיפולים שילוב17,29,30,31,32,33,34. לאחרונה, שיטת העוצמה xCELLigence הוערכו לייצור קולטן תא T (TCR)-הנדסה T-תאים35. כאן אנו מדווחים על העסקת מערכת RTCA להערכת העוצמה מחוץ לגוף של תאי T מכונית נועד למקד גידולים מוצקים וגידולים נוזליים בטיפולים קליניים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T-cell טיפול בסרטן השיגה תועלת קלינית משמעותית עבור ממאירות המטולוגית עמידים ועקשן כגון ילדות לוקמיה לימפוציטית חריפה. המאמצים מתבצעת כעת כדי להאריך את הטיפול המבטיח גידולים מוצקים בנוסף סרטן המטולוגי אחרים. כאן, אנו מתארים את הפיתוח והייצור של תאים מכונית T חזק מיקוד אנטיגנים עם ביטוי ייחודי או מועדף על תאים סרטניים מוצק ונוזלי. העוצמה מחוץ לגופית של תאים אלה מכונית T הוא העריך מכן בזמן אמת באמצעות הxCELLigence הרגיש מאוד עכבה מבוססי-עכבת. באופן ספציפי, ההשפעה של תחומים שונים של מגירוי מחדש, כגון glucocorticoid המושרה נמק הגידול מקדם קולטן (TNFR)-חלבון הקשורים (מחקר), על האון מחוץ לתחום של תאי T מכונית נבדק. דו ח זה כולל פרוטוקולים עבור: יצירת תאים T רכב עבור מחקרים קדם-קליניים באמצעות התמרה גנטית העדשה, הרחבת תאי T רכב, אימות רכב ביטוי, ריצה וניתוח של xCELLigence העוצמה assays.

הכנה לרכב הכנת וירוס הרכב T-cell הערכה העוצמה התכשירים של הרכב ההכנות למכוניות נקבעו באמצעות ערכת RT-PCR כמותית (עיין בטבלת החומרים) לפי פרוטוקול היצרן. פרוטוקול טיטור שחולצו וירוס rna הראשון ולאחר מכן נמדד את מספר העתק ה-rna ויראלי, אשר הצביע על כמות של חלקיקים ויראלי זיהומיות. סיכוייו של וירוס שנוצר ממנה 1 150 mm באמצעות פרוטוקול לעיל נע בדרך כלל בין 109-1010 עותקים ויראלי/mL. איור 2A מראה את מספר המחזור RT-PCR לעומת עוצמת האות מתוצאת ה-pcr הכמותית הייצוגית. לאחר איכות הווירוס היה מרוצה, כאשר סיכוייו היה גדול יותר מ-1 x 108 pfu/mL, זה היה קפוא למטה לאחר התמרה תא T העוקבים. לאחר בתאי T רכב היו התמרה עם וירוס, התאים T היו מתורבתים עבור 12-14 ימים נוספים, שמירה על הצפיפות שלהם סביב 1 x 106 כדי 2 x 106 תאים/mL. תאי T רכב נבדקו אז עם אנטי-ScFv מסוים נוגדן באמצעות cytometer זרם לפני יישום הזרם או להקפיא למטה. תוצאת אצווה טובה של נציג מוצגת באיור 2ב. באמצעות נוגדן anti-ScFv, כ 50% מתאי T רכב מוכתם חיובי (Q2 50.6% vs. T תאים 1%), המציין את הביטוי של מכונית ב כ 50% של תאי T. לאחר מכן, שיטת העוצמה RTCA בוצעה עבור הנחישות cytolysis לפני כל קבוצה של תאי T מכונית היה קפוא למטה מוכן יישום עתידי. אחד המחזור של הרכב T-cell עיצוב, דור, והערכת הליך לקח בערך 1 חודש.
הריגת של ראג'י לימפומה B תאים על ידי CD22-CAR T תאים הגידול הנוזלי anti-CD40 החומר (לראות את הטבלה של חומרים) שימש בריכוז של 4 μg/mL לעיל E-צלחת 3 h ב 37 ° c. לאחר שטיפת הבארות עם מאגר הקשירה, תאים לימפומה B-cell נוספו הלוח האלקטרוני בצפיפות של 30,000 תאים/טוב. לאחר שאפשר לתאים להתיישב 30 דקות E-פלייט הוצב בתוך המכשיר xCELLigence, ו קריאות עכבה יזמו מיד כדי ללכוד את התא המצורף והתפשטות. ביום שלמחרת, גם תאי T CD22-CAR, תאים מדגם T לרכב, או תאי T שעברו התמרה נוספת. באיור 3, יחס E:T של 10:1 שימש עבור כל סוגי התאים. CD22-חיוביים התאים ראג'י, טיפל בתאי T CD22-CAR הציגו הריגה משמעותית (מעקב ירוק) בהשוואה לפקדים שליליים (לא התמרה תאים T ותאי ללעוג רכב T).
הריגה אפקטיבית של תאים סרטניים בלבלב על ידי תאי T CD47-CAR CD47 היא משטח טרנסממברני, גליקופרוטאין של משפחת הקרבולין החיסוני. כמו חלבון אינטגרin משויך, הוא מתבטא במידה רבה בסרטן המטולוגי (לוקמיה, לימפומה, מיאלומה נפוצה) וסרטן מוצק (כגון השחלות, סרטן ריאות קטן תאים, הלבלב, glioblastoma) וסוגים אחרים של סרטן36,37. CD47 מכונה גם לעשות-לא לאכול-me-האות מקרופאגים, אשר עשה את זה מטרה טיפולית פוטנציאלית בסוגי סרטן מסוימים. CD47-מכונית T תאים יוצרו נבדק נגד BxPC3 תאים סרטניים הלבלב אשר מביעים רמות גבוהות של CD4738,39. BxPC3 תאים הופרה בלוח האלקטרוני ביום 1 בצפיפות של 10,000 תאים/ובכן. ניטור בזמן אמת הראה כי תאים אלה הגיעו שליטה לאחר 16 h. בשלב זה, המכונית T תאים נוספו ביחס E:T של 10:1 (איור 4א). שליטה בתאים שאינם מתתמרים כמו תאי T ותאי T מדגם מכונית הוספו אף הם. התוצאות מראות בבירור כי בתאי T CD47-CAR באופן סלקטיבי להרוג את היעד BxPC3 תאים29. כמו כן, איור 4B מראה כי האות העכבה כאשר CD47-מכונית T התאים נוספים לבאר ריקה הוא נמוך באופן משמעותי מאשר אות העכבה שנוצר על ידי היעד BxPC3 תאים. הערך של מדד התא מבארות עם תאי T CD47-CAR לבדו הגיע למקסימום של 0.14, שהוא גבוה במקצת מהאות בינונית לבדה (0.02). זה מצביע על כך בתוך שיטת ההריגה הטרוגנית, אות העכבה נגזרת כמעט באופן בלעדי מתאים סרטניים היעד.
גירוי בתאי מכונית T על ידי הדומיין של גיטה כאשר מתבטאת במכונית EGFR-גיטה-CD3, התחום הקוגירוי של גיאר היה דיווח בעבר כדי לשפר את הריגת התאים הסרטניים SKOV3 של EGFR-חיובית, אך לא EGFR-שלילי MCF-7 סרטן תאים30. כדי להבהיר בצורה טובה יותר את התפקיד של הדומיין, בונה רכב המכיל את התחום המלא של "גיאר", או למחוק גרסאות של התחום, נוצרו ונבדקו עבור היכולת להפעיל תאי T רכב (איור 5א). הנתונים xCELLigence באיור 5ב, ג מראה כי התחום הקוגירוי cor משפר את מכונית T הריגת תאים של היעד egfr-חיוביים מעל מה הוא נצפתה עם בניית המכונית המקורית שחסרה את התחום של גיאר. יתרה מזו, מחיקת 10 חומצות אמינו מתחום ה-גיטה (חומצות אמינו 184-193) ביטלה את פעילות הגירוי. לעומת זאת, ארגון מקרוב של המיקום היחסי של מתחם ה-גיטה בתוך מבנה הרכב הוכיח כי הוא מזיק פחות ליכולות הגירוי שלה. באמצעות נתוני נקודת קצה, הפקת IFNγ כפונדקאית של הפעלת T-cell הוכיחה גם את פעילות הגירוי של קבוצת המחשבים (איור 5ב). בניגוד לנתוני נקודת הקצה שהוא רק "פקיעה shot", פרופיל עכבה רציפה של המכשיר xCELLigence בבירור מאירה הבדלים עדינים בקינטיקה הורגת של הטיפולים השונים (איור 5ג). התוצאות המתקבלות כאן הן עקביות עם אלה של vivo לימוד30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> איור 1: ניתוח התא בזמן אמת xCELLigence (RTCA) מזהה את הריגת תאי היעד על-ידי התאים האחרים. ישנם שלושה שלבים conceptional עיקריים כדי למדוד את פעילות ההריגה של מכונית T אפקטור תאים נגד תאים סרטניים היעד. שלב 1: הזרע את תאי היעד (כלומר, תאים סרטניים) לתוך הבאר של E-צלחת. התאים לצרף את מיקרואלקטרודות זהב ביוסנסור וזה מעכבת את זרימת הזרם החשמלי בין אלקטרודות. ערך העכבה נמדד ומותווים כפרמטר unitless בשם ' אינדקס תאים '. הערך ' אינדקס תאים ' מגדיל את הגודל של התאים ומגיע לרמה כאשר התאים מתקרבים לזרימה. שלב 2: התאים החיסוניים-התאים החיסונית שאינם חסיד-מתווספים לאחר מכן. כי תאים אלה אינם דבקים מיקרואלקטרודות זהב, הם לא ישירות לגרום שינוי עכבה. שלב 3: אם התאים אפקטור לתקוף את התאים הסרטניים היעד, ההרס של התאים הסרטניים משתקף על ידי ירידה במדד התא לאורך זמן. זו פעילות cytolytic של התאים האפקטור, או את העוצמה של התאים האפקטור, יכול להיות ברגישות ומבוקרת בדיוק. הרכישה הרציפה של נתוני עכבה ממערכת xCELLigence מאפשרת ניתוח קינטי בזמן אמת לתנאים מרובים בו זמנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> איור 2: קביעת תינטר של הערכת הנגיף והזרימה של תאי הרכב T. (א) נחישות ויראלית סיכוייו. קווי הצבע השונים הם דוגמאות מייצגות למספר מחזור לעומת דלתא Rn. מספרי מחזור נמוכים מצביעים על כמות גבוהה יחסית של תבנית RNA וירוס הקיימת בדגימות. (ב) לאחר התמרה, תאי T מכונית היו מתורבתים ומתוחזקים בצפיפות של פחות מ 2 x 106 תאים/mL ולאחר מכן נתון לניתוח זרימה. ציר yמשקף כתמים עבור תאי T, עם ערכים חיוביים הישתקפו באזורים Q1 ו-Q2. שני הדגימות הן 100% חיובי עבור תאי T. הביטוי של רכב scFV נקבע באמצעות Ab ספציפי של scFv (x-ציר). התוצאה מראה כי יותר מ 50% של התאים T הם scFv חיובי בתאי T CD22-CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> איור 3: הריגת דינמיקה של תאי T CD22-CAR נגד תאים לימפומה של ראג'י בורקיט. בעוד עקומת אדום הוא התאים ראג'י לבד, העקומה הירוקה היא התאים ראג'י שטופלו עם CD22-CAR T תאים. העקומות הוורוד והכחול הן טיפול בתאי T-cell והטיפול בתאים שאינם מהתמרה, בהתאמה. יחס ה-E:T הוא 10:1. קווי שגיאה הם סטיית תקן. קנה המידה מוגדר ב-2 מרווחי זמן לתצוגה קלה, למרות שקיימות נקודות נתונים נוספות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> איור 4: היעילות של CD47-המכונית תאי T נגד תאים סרטניים מוצק הלבלב. (A) ורוד הוא BxPC3 היעד תאים בלבד, בעוד אדום הוא BXPC3 עם CD47-רכב T תאים הוסיף. ירוק הוא BxPC3 עם תוספת של תאי T שאינם מתתמרים, וכחול הוא עם תאים לרכב T מדגם. יחס ה-E:T הוא 10:1. (ב) באותה הגדרה, אדום הוא ריק (חסר תאי יעד) שליטה בארות עם CD47-CAR T תאים רק ירוק הוא בינוני בלבד. קווי שגיאה הם סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> איור 5: התחום של גיטה מגביר את הרכב תא T הפעילות ציטוטוקסיט נגד התאים EGFR-חיובית הגידול קווי. (א) מבנים שונים לרכב. (ב) מגרשי בר של% cytolysis עבור מבנים שונים ברכב ב 4 h (משמאל) ו 24 h (באמצע). הפקה IFNγ ב 24 h מוצג מימין. (ג) הערכת הריגה רציפה עבור כל המבנים. עקומת שחור הוא עקומת הצמיחה של BxPC3 תאים סרטניים בשחלות בלבד. העקומה הירוקה היא תאי היעד המטופלת בתאי T בלבד, העקומה הכחולה היא התאים היעד שטופלו בתאי T מכונית מבוים, העקומה האדומה היא התאים היעד שטופלו על ידי EGFR-גיטה-CD3-CAR T, העקומה הוורודה היא תאי היעד התייחסו עם EGFR-ΔGITR-CD3-רכב T, ואת עקומת חום הוא תאי היעד שטופלו EGFR-CD3-מכונית T <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

ניתוח תאים בזמן אמת של xCELLigence מאפשר לך לפקח באופן כמותי על הרג תאים סרטניים על ידי תאים חיסוניים בתנאים ללא תווית ובמהלך מספר ימים. מערכת זו מספקת קורס זמן מלא של הרג תאים סרטניים היעד המאפשר הקרנה בו זמנית של מספר רב של מבנים, סוגי תאים משפיעים, או טיפולים משולבים על יחסי השפעה נמוכים ליעד. התחל על ידי זריעת 1.5 פעמים 10 לשבעה תאי HEK293FT במדיום תרבות DMEM בצלחת תרבות תאים 150 מיליליטר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות.למחרת בבוקר, לערבב 2.5 מיליליטר של פתרון דילול transfection בתוספת חמישה מיקרוגרם של דנ"א פלסמיד וקטור lentiviral ו 22.5 מיקרוגרם של תערובת אריזה lentiviral עם 82.5 microliters של reagent transfection ב 2.5 מיליליטר של פתרון דילול חילוף. לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, להעביר את התגובה טיפה חכם לתוך המנה של תאי HEK293FT ולהחזיר את התאים לאנקובטור עבור דגירה לילה שני. למחרת בבוקר, להחליף את supernatant עם 19 מיליליטר של מדיום תרבות DMEM טרי ולהחזיר את התאים לחממה לילה.לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוט יחיד 50 מיליליטר עבור ארבעה מעלות צלזיוס אחסון במשך הימים הבאים לפני מעים את lentivirus על ידי צנטריפוגה בבוקר השני על מנת להסיר את כל התאים או פסולת מהפתרון. העבר את כל אבל על מיליליטר אחד של lentivirus המכיל על טבעי לצינור צנטריפוגה ברור במיוחד עבור אולטרהצנטריפוגה. לאחר ultracentrifugation, בזהירות לשאוף את הנגיף שיורית המכיל על טבעי, בעדינות להוסיף 100 microliters של DMEM לכדור, ולמקם את הצינור על קרח במשך 15 דקות.בסוף הדגירה, מערבבים את הפתרון בעדינות ומערבבים את פתרון lentivirus לצינורות סטריליים מצוננים מראש לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לקבוע את טיטר של lentivirus על ידי RT-PCR כמותי על פי הוראות היצרן. עבור ייצור והתרחבות תאי CAR-T, הפעל אחד עד פעמיים 10 לש ששת תאי הדם המונונוקלריים ההיקפיים במיליליטר אחד של מדיום תא CAR-T עם מספר שווה של חיידקים מצופים CD3/CD28 באר אחת של צלחת 24 בארות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.בשני הבקרים הבאים, מערבבים מיקרוליטר אחד של סוכן משפר תפירה עם התאים ואחריו תוספת של lentivirus בריבוי של זיהום של חמישה לאחד. לפקח על צמיחת תא T כל יומיים עד שלושה ימים הוספת טרי CAR-T תא בינוני לפי הצורך כדי לשמור על התאים ב 1-2 פעמים 10 לשישה תאים לריכוז מיליליטר. כדי לזהות ביטוי T cell CAR על ידי ציטומטריית זרימה, העבר שלוש פעמים 10 למכונית החמישית ותאי T שאינם מתומרים לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 200 microliters של מאגר FACS בתוספת 1% סרום אנושי. לפצל כל דגימת תא לתוך 100 aliquots microliter בודדים חמישה צינורות FACS פוליסטירן מיליליטר על קרח. לאחר חמש דקות, להוסיף microliter אחד של שברי FAB2 biotinylated של עז נגד עכבר FAB2 לצינור אחד של כל סוג תא ושני microliters של נוגדן נגד תג PE שכותרתו לצינור השני של כל סוג תא עם ערבוב יסודי.לאחר 30 דקות על קרח, לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של חיץ FACS טרי ולאחר צנטריפוגה decant את supernatants. תוסיפו את הכדורים לשארית העל-טבעית ותוסיפו שני מיקרוליטרים של APC נגד CD3 ושני מיקרוליטרים של 7-AAD לכל צינור. הוסיפו מיקרוליטר אחד של סטרפטבידין עם תווית PE עם ערבוב קצר לצינור המוכתם בנוגדן אנטי FAB2 ודגירה של כל הצינורות על הקרח במשך 30 דקות.בסוף הדגירה, לנתח את התאים על ידי cytometry זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים gating את התאים T על ידי פיזור קדימה לעומת פיזור בצד ו- CD3 לעומת ביטוי 7-AAD. למבחן עוצמת ציטוליזה בזמן אמת, הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות תאי היעד לכל באר של לוח אלקטרוני ולמדוד את פסיעת הרקע במכשיר מנתח תאים. לזהות את התאים הסרטניים היעד מצלחת התרבות באמצעות טריפסין.לשטוף את התאים ב 15 מיליליטר של תרבות טרייה בינוני צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולת התא הסרטני בחמישה מיליליטר של מדיום טרי לספירה ולהתאים את צפיפות התא לריכוז תא היעד המתאים. מוסיפים את התאים למספר בארות המתאים ומשאירים את הלוח האלקטרוני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה בתחתית בארות.בסוף תקופת שיווי המשקל, מניחים את הלוחית במנתח התאים בזמן אמת ויוזם מדידה של ההיכל באופן אוטומטי כל 15 דקות במהלך הלילה. ההיתוך וההתפשטות של תאי היעד ניתן לעקוב בזמן אמת. למחרת בבוקר, לדלל את המכונית אפקט ולשלוט בתאי T לריכוז המתאים צינורות בודדים ולהסיר 50 עד 100 microliters מכל באר של הלוח האלקטרוני, כך הנפח הסופי בכל באר הוא 100 microliters.לאחר מכן, זרעו את תאי ה-T של המחולל והבקרה בארות המתאימות ביחסי המטרה המתאימים ב-100 מיקרוליטרים של מדיום ל הבאר. לאחר מכן לצייד את הצלחת האלקטרונית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני החזרת הצלחת למערכת מנתח התא. כדי למדוד את היעילות של תא T מתווך הרג של תאים סרטניים היעד, לפקח על הרג מתווך CAR-T במשך 96 שעות.כ-50% מתאים CAR-T מוכתמים חיוביים לנוגדן שבר משתנה אנטי-שרשרת יחיד המציין את הביטוי של CAR בכ-50% מתאים T. בניסוי מייצג זה נעשה שימוש ביחס של 10 ל-1 משפיע אחד ליעד עבור כל הקבוצות. תאי ראג'י בלבד ותא CD22-CAR T שטופלו בתאי ראג'י הציגו הרג משמעותי בהשוואה לתא T הבקרה בלבד ולקבוצות תאים של Mock CAR-T.בניסוי זה, רק תאי CD47-CAR-T היו יעילים בהריגת תאי סרטן הלבלב. יתר על כן, אות ההימנעות מתאי CD47-CAR-T בלבד היה רק מעט מעל אות מדד התא שנמדד בארות בינוניות בלבד המציין כי אות ההימנעות הנובע מתאי השעיה כגון תאי CAR-T הוא מינימלי ואינו תורם לאות ההימנעות הכולל כאשר תאי CAR-T מתווספים לתאי סרטן היעד. יש לציין, תחום GITR שיתוף גירוי נצפתה להיות יעיל יותר בשיפור הרג תאי CAR-T נגד תאי יעד חיוביים קולטן גורם גדילה אפיתל בהשוואה לבניית רכב המקורי ללא תחום GITR.המדיום מ בארות e-plate ניתן לאסוף כדי לנתח את פרופיל ציטוקין בנקודות זמן או במהלך או אחרי ההתמדה על פי הצרכים של הניסוי. בסך הכל, xCELLigence שיפרה את היעילות של הערכת העוצמה של immunotherapies מגוונים החל מעורבים תאי T דו ספציפיים וירוסים oncolytic כדי מעכבי נקודת בדיקה חיסונית בטיפולים משולבים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...