Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

Авторы благодарят ProMab Biotechnologies и ACEA Biosciences за предоставление реагентов и инструментов, используемых в данном исследовании.

1. Поколение лентивирусного корытя
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как конкретные CAR Т-клеточной плазмидной конструкции завершена (CD47 и другие), лентивирные КАРР генерируются стандартной процедурой, используя 293 FT клеток, лентивирусной упаковки смеси, и трансфекционные агенты (см. Таблица материалов), как описано29. Впоследствии, используйте количественную обратную транскрипцию полимеразной цепной реакции (RT-PCR) комплект и тепловой цикл (см. таблицу материалов) для определения вируса титр путем измерения количества лентивирусной РНК в соответствии с протоколом производителя. Важно, чтобы все ленцивиральные процедуры проводились строго в соответствии с требованиями безопасности.
<ol><li>Семена 15 х 106 HEK293FT клеток в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) и инкубировать клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию в одном 150 мм блюдо внутри увлажненной 5% CO2 инкубатора.</li>
	<li>Приготовьте две трубки мощностью 15 мл с трансфекционным комплексом. Первая трубка содержит лентивирусную векторную плазмидную ДНК (5 мкг) и лентивирусную упаковочную смесь (22,5 мкг) в 2,5 мл раствора трансфективного разбавления. Вторая трубка содержит 82,5 л трансфекционного реагента в 2,5 мл раствора трансфекционного разбавления (см. Таблицу Материалов).</li>
	<li>Трубят содержимое трубки 1 в трубку 2, и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 15 минут.</li>
	<li>Перенесите содержимое трубки на блюдо из клеток HEK293FT и инкубировать образец на ночь при 37 градусах По Цельсия в увлажненных 5% CO2 инкубатора.</li>
	<li>На следующий день замените существующую среду на 19 мл свежей среды культуры DMEM и продолжайте инкубировать клетки на ночь внутри увлажненного 5% инкубатора CO2 при 37 градусах Цельсия.</li>
	<li>Перенесите средство от блюда к центрифуге 50 мл. Храните трубку с вирусосодержащей средой в холодильнике.</li>
	<li>Повторите вышеупомянутую процедуру, добавив свежий DMEM и собирая его снова после 1 дня.</li>
	<li>Объедините две коллекции носителей в одну центрифужную трубку. Центрифугна трубки при 2000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Перенесите большую часть лентивирусно-содержащего супернатанта в ультраклирную центрифугу трубку. Оставьте минимальный объем, около 1 мл, супернатанта, чтобы не беспокоить гранулы, которые могут содержать клетки и/или мусор.</li>
	<li>Ultracentrifuge выше уточнил супернатант на 110000 х г в течение 100 мин при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Удалите супернатант тщательно и аккуратно добавьте 100 зл ИК средних DMEM к вирусной гранулы на дно трубки. Оставьте трубку на льду в течение 15 мин. Смешайте раствор осторожно и aliquot раствор лентивирусного в прешилированных стерильных труб. Храните эти вирусные трубки в морозильной камере -80 градусов.</li>
	<li>Используйте количественный набор RT-PCR для определения титра лентивирусного в соответствии с протоколом производителя, который извлекает и измеряет лентивирусную РНК.</li>
</ol>2. Поколение и расширение Т-клеток CAR
<ol><li>Активировать ранее замороженные человеческие ПБМК (около 1 х 106 х 106 клеток) в 1 мл Т-клеточной среды CAR с равным количеством микробусов с покрытием CD3/CD28 (см. Таблицу материалов)и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненных 5% CO2 инкубатора для 24 ч.</li>
	<li>Оттепель aliquot лентивирусного запаса на льду.</li>
	<li>Добавить 1 л трансдукции повышения агента в колодец с клетками и перемешать.</li>
	<li>Добавить лентивирус в клетки при множественности инфекции (МВД) 5:1 и аккуратно перемешать. На следующий день повторите этот шаг (24 ч после первого трансдукции).</li>
	<li>Мониторинг роста Т-клеток каждые 2-3 дня. Добавьте больше свежей среды CAR T-клетки для поддержания клеток при плотности 1 х 106 до 2 х 106 ячеек/мл.</li>
	<li>Заморозить ячейки CAR T со стандартным протоколом с помощью решения замораживания (см. таблицу материалов).</li>
	<li>Оттепель CAR T клетки, используя стандартный метод и прекультуры их в CAR Т-клеточной среде около 2-4 ч с IL-2 (300 единиц / мл) перед применением их для ассе.</li>
</ol>3. Обнаружение экспрессии CAR по цитометрии потока
<ol><li>Передача 3 х 105 CAR Т-клеток и нетрансиндуцированных Т-клеток в две отдельные 1,5 мл микроцентрифуговых труб.</li>
	<li>Центрифуги труб на 300 х г в течение 2 мин и повторной концентрации клеток в 200 Зл флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) буфер, содержащий 1% человеческой сыворотки.</li>
	<li>Пипетка 100 л клеточного раствора в двух 5 мл полистирола FACS труб и держать трубки на льду в течение 5 минут.</li>
	<li>Добавьте 1 зл биотинилатированных коз анти-мышь F (ab')2 к одной трубке каждого типа клетки. Затем добавьте 2 ЗЛ анти-тега на этикетке PE (см. таблицу материалов)в другую трубку каждого типа клеток. Хорошо перемешать и навистить на льду в течение 30 минут.</li>
	<li>Вымойте клетки с 3 мл буфера FACS в каждой трубке и центрифуги труб на 300 х г в течение 5 минут; отбросить супернатантов и вихря очень кратко или встряхнуть трубки кратко, чтобы восстановить клетки в остаточной жидкости.</li>
	<li>Добавьте 2 ЗЛ APC anti-CD3 и 2 ЗЛ из 7-AAD антитела раствор (см. таблицу материалов) к каждой трубке. В трубку клеток, окрашенных анти-F (ab')2 Ab, добавить 1 Зл PE-маркированных стрептавидин. Кратко перемешайте трубки на льду еще 30 минут.</li>
	<li>Используйте буфер FACS, чтобы снова мыть клетки, как описано в шаге 3.5, и добавьте дополнительные 200 юаней буфера FACS к каждой трубке.</li>
	<li>Используйте цитометрию потока, чтобы проанализировать клетки, сначала gating на Т-клетки в вперед рассеяния против бокового рассеяния участка, а затем gating на живых клетках (7-AAD-отрицательный) в CD3 против 7-AAD участка. Последним шагом является анализ анти-тег, анти-ScFv или анти-F (ab')2 против CD3.</li>
</ol>4. В режиме реального времени цитолиза потенции ассси
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните rtCA асссе в соответствии с рекомендуемыми условиями производителя. Вкратце, первая плита клетки цели в уэллах E-плиты, последовано за добавлением клеток CAR T на следующий день. Активность цитолиза Т-клеток CAR против целевых клеток контролируется в режиме реального времени. Т-клетки и макет-трансиндуцированных Т-клеток (Mock CAR Т-клетки) используются в качестве отрицательного контроля эффектор клеток. Следующий протокол описывает in vitro в режиме реального времени цитолиза потенции анализа для адепта опухолевых клеток линий.
<ol><li>Добавьте 100 кЛ среды культуры целевых клеток к каждому колодцу xCELLigence E-Plate, поместите пластину внутри прибора xCELLigence и примите фоновое чтение. Затем, передача E-плиты в ткани культуры капюшон для клеточного посева.</li>
	<li>Используйте стандартный протокол для trypsinize целевых раковых клеток из устройства культуры. Затем перенесите клетки в центрифугу 15 мл и добавьте свежую культурную среду, до 15 мл. Пелле клетки центрифугации в течение 5 мин при 200 х г. Откажитесь от супернатанта, добавьте 5 мл свежей среды и используйте серологический пипетку, чтобы аккуратно переопустить клеточную гранулу. Подсчитайте плотность живых клеток с помощью гемоцитометра и микроскопа.</li>
	<li>Отрегулируйте плотность клеток соответствующим образом, а затем добавьте 100 л клеточной подвески к каждой скважине E-Plate. Целевой номер ячейки, как правило, около 10000 клеток / хорошо для приверженных клеточных линий (BxPC3, Hela-CD19, и SKOV3), или 30000 клеток / хорошо для подвесных клеток, таких как Raji (см. ниже для деталей относительно precoating скважин с антителами для того, чтобы притронет жидкие раковые клетки).</li>
	<li>Уравновешивать E-Plate при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы клетки равномерно оседают на дне колодца (это очень важно; не пропускайте этот шаг).</li>
	<li>Поместите E-Plate в инструмент xCELLigence внутри инкубатора клеточной культуры и начните измерять импеданс, отображаемый как Cell Index против времени, автоматически каждые 15 минут.</li>
	<li>На следующий день подготовьте эффектор CAR T-клетки. Убедитесь в том, чтобы подготовить соответствующие элементы управления (т.е. Mock CAR Т-клеток, нетрансиндуированных контроль Т-клеток, и / или не связанных CAR Т-клеток) заранее, чтобы убедиться, что все клетки готовы в то же время. Отрегулируйте клетки-эффекторы и контрольные элементы до надлежащей плотности и подготовьте серийные разбавления, чтобы обеспечить желаемое соотношение E:T будет достигнуто, когда 100 ЗЛ суспензии ячейки эффектора добавляется к каждому колодцу в шаге 9.</li>
	<li>Пауза xCELLigence сбора данных и довести E-Plate от инкубатора к капюшону клеточной культуры.</li>
	<li>Удалите 100 л среды из каждого колодца. Количество остаточной среды в каждой скважине в настоящее время составляет 100 л.</li>
	<li>Добавьте 100 л последовательно разбавленного эффектора CAR T-клеток или других контрольных ячеек (т.е. Mock CAR T-клеток) для достижения желаемого соотношения E:T.</li>
	<li>Выровнять E-Plate при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы позволить клеткам-эффектору поселиться, а затем поместите E-Plate обратно в инструмент xCELLigence. Возобновить сбор данных.</li>
	<li>При желании, в ключевые точки времени xCELLigence приобретение данных может быть приостановлено и пластины удалены для того, чтобы собрать небольшие образцы для анализа ортогоналовых анализов (т.е., измерения производства цитокинов ELISA или потока цитометрии).</li>
	<li>В эксперименте EGFR-GITR-CD3 CAR T-cell измерьте выход INF с комплектом ELISA (следуйте инструкциям производителя; см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ЛИКВУК КРАКС: Для тестирования непридерживающиеся гематологических раковых клеток, до добавления клеток скважины E-Plate сначала покрыты антителом, которое характерно для антигена, который выражается на поверхности раковых клеток. Для линии клеток Raji B используется привязывающий реагент на основе анти-CD40 (см. набор жидкой опухоли, убивающий асссев в таблице материалов). Ниже приведена процедура покрытия пластины:</li>
	<li>Разбавить привязавательный реагент (анти-CD40) привязывающими буфером до концентрации 4 мкг/мл.</li>
	<li>Работая внутри капюшона культуры ткани, добавьте 50 зл ели разбавленного привязного реагента к каждой скважине E-Plate. Оставьте E-Plate при комнатной температуре или в инкубаторе 37 градусов по Цельсию на 3 ч.</li>
	<li>Удалите привязывание реагента и мыть E-плиты по крайней мере 2x с мытьем буфера. На данный момент E-Plate готов к посеву целевых ячеек Раджи (30 000 клеток/колодца).</li>
	<li>Продолжить шаг 4.1 (выше), чтобы выполнить остальную часть процедуры.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+Therapy:+A+New+Era+in+Cancer+Immunotherapy.">CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>June, C. H., O&#8217;Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer.">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li><li>. FDA approval brings first gene therapy to the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm">https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm574058.htm</a> (2017)</li><li>. FDA approves CAR-T cell therapy to treat adults with certain types of large B-cell lymphoma Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm">https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm581216.htm</a> (2017)</li><li>Liu, B., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+CAR-T+cells+in+China.">Clinical trials of CAR-T cells in China.</a> Journal of Hematology &#38; Oncology. 10 (1), 166 (2017).</li><li>Fry, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD22-targeted+CAR+T+cells+induce+remission+in+B-ALL+that+is+naive+or+resistant+to+CD19-targeted+CAR+immunotherapy.">CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.</a> Nature Medicine. 24 (1), 20-28 (2018).</li><li>Yang, Y., Jacoby, E., Fry, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+of+allogeneic+donor-derived+CAR+T+cells.">Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (6), 509-515 (2015).</li><li>. Celyad Announces FDA Acceptance of IND Application for CYAD-101, a First-in-Class Non-Gene Edited Allogeneic CAR-T Candidate Available from: <a target="_blank" href="https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate">https://www.celyad.com/en/news/celyad-announces-fda-acceptance-of-ind-application-for-cyad-101-a-first-in-class-non-gene-edited-allogeneic-car-t-candidate</a> (2017)</li><li>Sheridan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogene+and+Celularity+move+CAR-T+therapy+off+the+shelf.">Allogene and Celularity move CAR-T therapy off the shelf.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 375-377 (2018).</li><li>D&#8217;Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cells:+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors.">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death &#38; Disease. 9 (3), 282 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+A+feasibility+strategy+for+CAR-T+cell+therapy+in+the+treatment+of+solid+tumors.">Combination therapy: A feasibility strategy for CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors.</a> Oncology Letters. 16 (2), 2063-2070 (2018).</li><li>Xia, A. L., Wang, X. C., Lu, Y. J., Lu, X. J., Sun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric-antigen+receptor+T+(CAR-T)+cell+therapy+for+solid+tumors:+challenges+and+opportunities.">Chimeric-antigen receptor T (CAR-T) cell therapy for solid tumors: challenges and opportunities.</a> Oncotarget. 8 (52), 90521-90531 (2017).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Newick, K., O'Brien, S., Moon, E., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+Cell+Therapy+for+Solid+Tumors.">CAR T Cell Therapy for Solid Tumors.</a> Annual Review of Medicine. 68, 139-152 (2017).</li><li>de Wolf, C., van de Bovenkamp, M., Hoefnagel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+perspective+on+in+vitro+potency+assays+for+human+mesenchymal+stromal+cells+used+in+immunotherapy.">Regulatory perspective on in vitro potency assays for human mesenchymal stromal cells used in immunotherapy.</a> Cytotherapy. 19 (7), 784-797 (2017).</li><li>Cerignoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+immunotherapy+potency+assays+using+real-time+cell+analysis.">In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis.</a> PLOS ONE. , (2018).</li><li>Holden, H. T., Oldham, R. K., Ortaldo, J. R., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+chromium-51+release,+cell-mediated+cytotoxicity+assay:+cryopreservation+of+mouse+effector+and+target+cells.">Standardization of the chromium-51 release, cell-mediated cytotoxicity assay: cryopreservation of mouse effector and target cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 58 (3), 611-622 (1977).</li><li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry.">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLOS ONE. 10 (10), e0141074 (2015).</li><li>Mukherjee, M., Mace, E. M., Carisey, A. F., Ahmed, N., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+Approaches+to+Study+the+CAR+Immunological+Synapse.">Quantitative Imaging Approaches to Study the CAR Immunological Synapse.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1757-1768 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Nelson, D. L., Kurman, C. C., Serbousek, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Unit+7:+51Cr+release+assay+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+(ADCC).">Chapter 7, Unit 7: 51Cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).</a> Current Protocols in Immunology. , 27 (2001).</li><li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays.">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li><li>Glamann, J., Hansen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+detection+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+cell+adhesion+by+electrical+impedance+measurements.">Dynamic detection of natural killer cell-mediated cytotoxicity and cell adhesion by electrical impedance measurements.</a> Assay and Drug Development Technologies. 4 (5), 555-563 (2006).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (4), 363-372 (2004).</li><li>Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+label-free+monitoring+of+natural+killer+cell+cytotoxic+activity+using+electronic+cell+sensor+arrays.">Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 309 (1-2), 25-33 (2006).</li><li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability.">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 33-43 (2011).</li><li>Lamarche, B. J., Xi, B., Cerignoli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Potency+of+Cancer+Immunotherapies:+Immune+Cell-Mediated+Killing+Kinetics+and+Efficacy+Analysis+in+Real-Time+without+the+Use+of+Labels.">Quantifying the Potency of Cancer Immunotherapies: Immune Cell-Mediated Killing Kinetics and Efficacy Analysis in Real-Time without the Use of Labels.</a> Genetic Engineering &#38; Biotechnology News (GEN). 36 (14), 18-19 (2016).</li><li>Golubovskaya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47-CAR-T+Cells+Effectively+Kill+Target+Cancer+Cells+and+Block+Pancreatic+Tumor+Growth.">CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth.</a> Cancers. 9 (10), (2017).</li><li>Golubovskaya, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GITR+domain+inside+CAR+co-stimulates+activity+of+CAR-T+cells+against+cancer.">GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer.</a> Frontiers in Bioscience. 23, 2245-2254 (2018).</li><li>Guedan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+CAR+T+cell+persistence+through+ICOS+and+4-1BB+costimulation.">Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.</a> JCI Insight. 3 (1), (2018).</li><li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+Her2neu+specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr51+release+assay+to+the+xCELLigence+system.">Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xCELLigence system.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3683 (2012).</li><li>Davenport, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+Cells+Inflict+Sequential+Killing+of+Multiple+Tumor+Target+Cells.">CAR-T Cells Inflict Sequential Killing of Multiple Tumor Target Cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (5), 483-494 (2015).</li><li>Hegde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+CAR+T+cells+targeting+HER2+and+IL13Ralpha2+mitigate+tumor+antigen+escape.">Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Ralpha2 mitigate tumor antigen escape.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3036-3052 (2016).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+clinical-scale+manufacturing+of+TCR+transduced+T-cells+using+closed+culture+system+modules.">Enhanced clinical-scale manufacturing of TCR transduced T-cells using closed culture system modules.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 13 (2018).</li><li>Weiskopf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+targeting+the+CD47/SIRPalpha+axis.">Cancer immunotherapy targeting the CD47/SIRPalpha axis.</a> European Journal of Cancer. 76, 100-109 (2017).</li><li>Huang, Y., Ma, Y., Gao, P., Yao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD47:+the+achievements+and+concerns+of+current+studies+on+cancer+immunotherapy.">Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy.</a> Journal of Thoracic Disease. 9 (2), E168-E174 (2017).</li><li>Ma, S., Thorpe, P., Vitetta, E., Meyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeting+of+exposed+phosphatidylserine,+CD47+and+CD54+on+human+pancreatic+tumor+cells+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+pancreatic+cancer+(P4455).">Combined targeting of exposed phosphatidylserine, CD47 and CD54 on human pancreatic tumor cells in a mouse xenograft model of human pancreatic cancer (P4455).</a> The Journal of Immunology. 190 (1 Supplement), (2013).</li><li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD47-+high+expression+cells+confers+enhanced+tumorigenicity+upon+KDM6B+suppression+in+pancreatic+cancer.">Emergence of CD47- high expression cells confers enhanced tumorigenicity upon KDM6B suppression in pancreatic cancer.</a> Cancer Research. 76 (2 Supplement), (2016).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+CAR+design+for+tumor+CAR-T+cell+therapy.">The development of CAR design for tumor CAR-T cell therapy.</a> Oncotarget. 9 (17), 13991-14004 (2018).</li><li>FDA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products. , (2017).</li><li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability,+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays.">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46536 (2012).</li><li>Chiu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+xCELLigence+biosensor+technology+and+conventional+cell+culture+system+for+real-time+monitoring+human+tenocytes+proliferation+and+drugs+cytotoxicity+screening.">Comparison between xCELLigence biosensor technology and conventional cell culture system for real-time monitoring human tenocytes proliferation and drugs cytotoxicity screening.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 149 (2017).</li><li>Hillger, J. M., Lieuw, W. L., Heitman, L. H., IJzerman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technology+and+patient+cells:+from+early+drug+development+to+precision+medicine.">Label-free technology and patient cells: from early drug development to precision medicine.</a> Drug Discovery Today. 22 (12), 1808-1815 (2017).</li></ol>

Авторы проводят исследования в области развития Т-клеток CAR и связанных с ними анализов потенции, которые являются бизнес-интересами ProMab Biotechnologies и ACEA Biosciences, соответственно. Однако это не меняет приверженности авторов миссии JoVE по расширению распространения научных знаний. Условия этой публикации были рассмотрены и утверждены ProMab Biotechnologies и ACEA Biosciences в соответствии с ее политикой исследований.

Химерные рецепторы антигена являются многодоменными белками, состоящими из внеклеточного одноцепного переменного фрагмента (область scFv), области шарнира, трансмембранной области и цитоплазматического домена, состоящего из доменов Сигнализации TCR и дополнительных затратных доменов от рецепторов, таких как CD28 и OX4011,40. Для разработки безопасных, селективных и эффективных CARs, крайне важно, чтобы различные перестановки в дизайне CARs тщательно протестированы с использованием in vitro потенции анализы и, в конечном итоге, животных моделей. В этом исследовании мы предоставили протокол и рабочий процесс о том, как анализ потенции in vitro может информировать дизайн эффективных ЦАРов.
При разработке любого типа потенции, особенно для производственных целей, крайне важно, чтобы асссе будет чувствительным, надежным, последовательным, и как можно ближе к механизму действия, как это возможно16,17,41. Описанная здесь потенция в реальном времени предназначена для измерения цитолитической активности Т-клетки CAR напрямую, а не с помощью суррогатного маркера, такого как высвобождение цитокинов. Важно отметить, что для проведения ассея не требуется никаких дополнительных компонентов, таких как красители или реагенты, кроме пластины для ассеа (E-Plate) и рекомендуемых носителей для поддержания клеток. Кроме того, анализ является изысканно чувствительным и обеспечивает высоко воспроизводимые данные по сравнению с другими этикетками на основе анализов42,43,44. Кроме того, анализ xCELLigence поддается использованию очень низких коэффициентов эффектора к цели, что идеально подходит для оценки конкретного цитолиза.
Для того, чтобы продемонстрировать гибкость и полезность системы xCELLigence, мы сосредоточились на двух типах опухолей, а именно на опухолях гематологического происхождения и твердых опухолях. Для того, чтобы оценить потенцию CD22-направленных Т-клеток CAR, клетки Раджи (т.е. В-клеточная лимфома клеточной линии) были привязаны к E-плиты с помощью анти-CD40 антитела. Привязка клеток Раджи к нижней части E-плит приводит к сигналу импеданса, который отражает жизнеспособность и количество клеток Раджи в колодце. После добавления Клеток CD22-CAR T, клетки Раджи выборочно убойны в time- и effector-dependent образе, кульминацией в времени-зависимом уменьшении в сигнале impedance. Падение импеданса означает цитолиза или потерю жизнеспособности клеток Раджи17. Этот селективный подход привязывая используя антитела можно распространить к другим жидкостным линиям клетки тумора. Альтернативная стратегия использования опухолевых клеток линий гематологического происхождения заключается в использовании адептов раковых клеток, которые разработаны, чтобы застойно выразить опухолевые антигены, такие как CD19, выраженные в клетках HeLa. Преимущество этого подхода заключается в том, что родительские клетки HeLa легко доступны и могут быть использованы в качестве отрицательного контроля за спецификой. Такой подход уже был подтвержден с CHO-CD22 против CHO клеток и CHO-BCMAs против CHO ячеек29. Используя такие различные подходы, CAR Т-клеток дизайн и эффективность могут быть легко протестированы. XCELLigence асссе по своей сути гибок, и условия ассеса могут быть скорректированы для того, чтобы максимально приблизить физиологические условия.
Одним из основных преимуществ анализа потенции мы описали здесь, что это простой функциональный анализ и может быть использован в сочетании с генной инженерии методы для разработки оптимальных и эффективных CARs в высокой пропускной способностью моды. Как было показано здесь для CAR Т-клеток, предназначенных для целевой EGFR-положительных раковых клеток, ассс можно использовать для оценки относительной активности различных конструкций CAR / мутантов. Например, мы показали, что, когда домен GITR расположен вверх по течению домена CD3, он показывает гораздо более надежную цитолитическую активность, чем когда он расположен ниже по течению домена CD3.
Хотя это не коррелирует идеально с активностью in vivo CAR T клеток, в vitro цитокинов релиз исторически используется в качестве меры потенции CAR Т-клеток. Хотя xCELLigence основе потенции оценки, описанные здесь могут быть использованы для оценки клеточной терапии во время производства или до освобождения для клинического применения, насколько хорошо эти результаты коррелируют с эффективностью in vivo еще не было Установлено. Эффективность In vivo зависит от множества факторов и переменных, которые не могут быть повторены в рамках анализа in vitro. К таким переменным относятся: самонаводящиеся Т-клетки CAR к месту опухоли, стимуляция и активация Т-клетки CAR и ее способность сохраняться внутри пациента, а также микроокружение опухоли. При дальнейшем уточнении анализ xCELLigence может быть способен моделировать некоторые из этих сложных процессов in vitro.
Протокол, представленный здесь, применяется к большинству адептов линий раковых клеток и некоторым линиям клеток жидкой опухоли. Клинические образцы, такие как первичные раковые клетки, однако, должны быть дополнительно протестированы и оптимизированы из-за сложности типов опухоли и фаз. Это, безусловно, стоит отметить, что in vitro потенции системы анализа, описанной здесь использует раковые клетки линий только для отражения потенциальной активности CAR Т-клеток. Реальная ситуация опухоли внутри человеческого тела является гораздо более сложным, особенно когда твердая опухоль является мишенью, из-за динамической опухолевой среды и развития. Таким образом, результат оценки потенции не может перевести очень хорошо в клинической эффективности CAR Т-клеток испытания.
Таким образом, представленная платформа xCELLigence на основе импедеданса позволяет бесименно контролировать убийство клеток в течение длительного периода времени, а именно до 10 дней. Эта способность для такой длинной временной шкалы для сбора данных отличает технологию от других анализов, которые в настоящее время используются и которые требуют создания нескольких экспериментальных репликаторов для сбора временных точек и трудоемких манипуляций образца. Кроме того, минимальный сигнальный вклад эффектора иммунных клеток упрощает анализ данных. Программное обеспечение может обрабатывать данные автоматически и генерировать полезные параметры, такие как процент цитолиза, KT50 и т.д. Технология уже продемонстрировала высокую чувствительность (с соотношениями E:T как низко как 1:20) и большой динамический диапазон (с e:T соотношения от 20:1 до 1:20), который не легко достичь с другими анализами. В целом, внедрение этой технологии должно позволить более точный анализ данных по более высокой пропускной шкале, что позволит повысить развитие Т-клеточных реагентов CAR, продвигая поле гораздо более высокими темпами.

В последние годы Т-клеточная терапия CAR стала одним из самых заметных прорывов в иммунотерапии рака для рецидивов и огнеупорных гематопоитических злокачественных новообразований. С недавним УПРАВЛЕНИЕм по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) одобрение CD19-направленных Т-клеток CAR для острого лимфобластного лейкоза, неходжкинской лимфомы, и диффузной большой В-клеточной лимфомы, и назначение прорывной терапии для B-клеточного созревания антигена (BCMA)-направленных CAR Т-клеток для множественной миеломы, эта технология вызвала большое волнение в научном сообществе и подпитывается многочисленные основные, прикладные, и клинические исследования во всем мире1,2,3, 4,5. В январе 2019 года в базе данных клинических испытаний было зарегистрировано более 700 клинических испытаний (clinicaltrials.gov); около 450 из этих испытаний либо собирались начать, либо активно набирали пациентов. Большинство клинических испытаний сосредоточены на гематологических злокачественных новообразований, и клинические испытания с использованием CAR Т-клеток ориентации CD20, CD22, и BCMAs, в дополнение к CD19, продолжаются, а также6,7. Хотя большинство испытаний используют аутологичное CAR Т-клеточная терапия, значительное число из них также изучают полезность аллогенных CAR Т-клеток8,9,10. Несмотря на многообещающие результаты с гематологическими злокачественными новообразованиями, использование Т-клеток CAR для целевой твердых опухолей оказалось гораздо сложнее в клинике по целому ряду причин, в том числе, но не ограничиваясь отсутствием хороших целей, которые исключительно выражены в опухоли, неоднородность твердых опухолей и опухоли "побег", и трудности, что CAR T клетки имеют в доступе к микросреде11,12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12,12, 15. Существует острая необходимость в развитии твердых опухоли конкретных Т-клеток, которые могут преодолеть эти барьеры на пути к эффективности и проблемы "на целевой опухоли" токсичности. В то время как множество in vitro и in vivo подходы оправданы в разработке и тестировании CAR Т-клеток, надежный и прогностический анализ потенции in vitro имеет первостепенное значение16,17.
Для того, чтобы оценить потенцию CAR Т-клеток, различные методы in vitro были разработаны. В целом, эти анализы потенции могут быть разделены на две широкие категории в зависимости от того, они (i) непосредственно измерить цитолитической активности т-клеток CAR против целевых опухолевых клеток, или (ii) измерения суррогатных маркеров, таких как цитокины, которые высвобождаются КЛЕТКи CAR Т, как они убивают клетки-мишени. Методы, которые измеряют цитолитическую активность непосредственно включают анализ выброса хрома-51 (CRA)18, визуализации на основе анализов, которые измеряют апоптоз клеток-мишеней с помощью флуоресцентных зондов19,20, и поток цитометрии анализы, которые обнаруживают апоптотические клетки-мишени21. В этих анализах, CAR Т-клетки, как правило, совместно культивируется с целевыми клетками, которые были предварительно помечены радиоактивными или флуоресцентными зондами, а затем соответствующие измерения. Хотя он уже давно считается золотым стандартом в области из-за его чувствительности, CRA имеет некоторые недостатки. Во-первых, это конечная точка ассоса и не предоставляет кинетическую информацию. Во-вторых, целевые клетки должны быть помечены хромом-51, который имеет тенденцию выщелачиваться из клеток и может значительно увеличить фоновый шум22. Наконец, это требует надлежащих мер предосторожности и удаления радиоактивных отходов. Альтернативные анализы, которые измеряют побочные продукты взаимодействия Т-клеток CAR с клетками-мишенями как признак потенции, включают количественную оценку различных цитокинов, выделяемых Т-клетками CAR, используя либо методы цитометрии, либо связанные с ферментами иммуносорбентные анализы. Опять же, это конечные анализы, которые измеряют кумулятивное высвобождение цитокинов в данный момент времени и, таким образом, не обязательно могут отражать фактическую цитолитической активности Т-клеток CAR.
При разработке потенции анализ, особенно тот, который определяет критерии выпуска для клеточной терапии, такие как CAR Т-клеток, очень важно, чтобы анализ включать минимальные манипуляции и практические время, потому что каждое взаимодействие является еще одной переменной, которая должна быть учтена и может уменьшить общую надежность и последовательность анализ. Кроме того, взаимодействие Т-клеток CAR с опухолевыми клетками является динамичным процессом, и предоставление информации об этих динамических взаимодействиях, таких как скорость цитолиза, имеет первостепенное значение для оценки потенции. С учетом этих критериев мы разработали анализ кинетической потенции без этикетки для т-клеток CAR, которая использует платформу анализа клеток xCELLigence в реальном времени (RTCA). xCELLigence использует специализированные микротитерные пластины (E-plates), которые содержат биосенсоры золота, встроенные в нижней части каждой скважины. Работая либо с приверженцами твердых опухолевых клеток, или жидких раковых клеток, которые были привязаны с помощью конкретных антител, эти биосенсоры монитор в режиме реального времени CAR T-клеток индуцированных изменений в целевом количестве клеток, размер клеток, клеточная субстрата крепления силы, и клеточной клетки взаимодействия (т.е. барьер функции)17,23,24,25,26,27,28. Рабочий процесс прост и включает в себя просто посев целевых клеток в скважины E-плиты, а затем добавление CAR Т-клеток в различных сэффектор ов с точки зрения целевых соотношений (Рисунок 1). Впоследствии, поскольку биосенсоры непрерывно контролируют жизнеспособность целевых ячеек, данные автоматически отображаются в режиме реального времени.
За последние 15 лет анализ xCELLigence был проверен для оценки потенции естественных клеток убийцы (НК), Т-клеток, Т-клеток, ингибиторов контрольных точек, биспецифических антител, онколитических вирусов и некоторых комбинированных терапий17,29,30,31,32,33,34. Недавно, xCELLigence потенции асси была оценена для производства Т-клеточных рецепторов (TCR) инженерии Т-клеток35. Здесь мы сообщаем, используя систему RTCA для оценки потенции в пробирке CAR Т-клеток, предназначенных для целевой твердых опухолей и жидких опухолей в клинических методах лечения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

Химерный рецептор антигена (CAR) Т-клеточная терапия рака достигла значительного клинического преимущества для устойчивых и огнеупорных гематологических злокачественных новообразований, таких как детский острый лимфоцитарный лейкоз. В настоящее время предпринимаются усилия по распространению этой многообещающей терапии на твердые опухоли в дополнение к другим гематологическим ракам. Здесь мы описываем развитие и производство мощных Т-клеток CAR, нацеленных на антигены с уникальным или преференциальным выражением на твердых и жидких опухолевых клетках. Потенция in vitro этих т-клеток CAR затем оценивается в режиме реального времени с помощью высокочувствительного анализа на основе импеданса xCELLigence. В частности, исследуется влияние различных дорогостоящих сигнальных доменов, таких как глюкокортикоидноидный рецептор фактора некроза опухоли (TNFR), связанный с протеином (GITR), на потенцию in vitro Т-клеток CAR. Этот отчет включает в себя протоколы для: генерации CAR Т-клеток для доклинических исследований с использованием трансдукции ллентивирного гена, расширение Т-клеток CAR, проверка экспрессии CAR, а также запуск и анализ анализ потенций xCELLigence.

CAR лентивирусной подготовки и CAR Т-клеток генерации и потенции оценки Титры препаратов CAR lentivirus определялись с помощью количественного комплекта RT-PCR (см. Таблицу материалов)в соответствии с протоколом производителя. Протокол титрования извлекли РНК вируса сначала, а затем измерили номер копии лентивирусной РНК, который указал количество инфекционных вирусных частиц. Титр вируса, генерируемого из одной 150-мм тарелки с использованием вышеуказанного протокола, обычно колеблется от 109-1010 вирусных копий/мл. На рисунке 2А показан номер цикла RT-PCR по сравнению с силой сигнала от репрезентативного количественного результата ПЦР. После того, как качество вируса было удовлетворено, когда титр был больше, чем 1 х 108 pfu/mL, он был заморожен вниз для последующего т-клеток трансдукции. После того, как Т-клетки CAR были трансумциированы с помощью лентивирусной связи, Т-клетки культивировались в течение дополнительных 12-14 дней, сохраняя их плотность около 1 х 106 х 106 клеток/мл. CAR Т-клетки были затем проверены с анти-ScFv-специфических антител с помощью цитометра потока до применения вниз по течению или заморозить вниз. Хороший репрезентативный результат партии показан на рисунке 2B. Используя анти-ScFv антитела, около 50% из клеток CAR T окрашенных положительных (No 2 50,6% против Т-клеток 1%), что свидетельствует о выражении ЦАР примерно в 50% Т-клеток. Впоследствии, RTCA потенции асссбыл был выполнен для определения цитолиза, прежде чем каждая партия CAR Т-клеток была заморожена и готова к будущему применению. Один цикл car T-клеток дизайн, генерация, и оценка процедуры занимает около 1 месяца.
Убийство клеток лимфомы Раджи В клетками CD22-CAR T Анти-CD40 жидких опухолей привязывая комплект (см. Таблица материалов) был использован в концентрации 4 мкг/мл, чтобы покрыть E-плиты для 3 ч при 37 градусов по Цельсию. После мытья скважин с привязывающим буфером, В-клеточные клетки лимфомы были добавлены в E-Plate при плотности 30000 клеток/ хорошо. После того, как клетки могли довольствоваться 30 минутами, E-Plate была помещена обратно в инструмент xCELLigence, и показания импеданса были немедленно начаты для того, чтобы захватить вложение и пролиферацию клеток. На следующий день были добавлены либо CD22-CAR T-клетки, Т-клетки Mock CAR, либо нетрансутированные Т-клетки. На рисунке 3соотношение E:T 10:1 использовалось для всех типов клеток. CD22-положительные клетки Раджи, обработанные с CD22-CAR Т-клеток отображается значительное убийство (зеленый след) по сравнению с отрицательными контроля (нетрансиндуцированных Т-клеток и Мок CAR Т-клеток).
Эффективное убийство раковых клеток поджелудочной железы клетками CD47-CAR T CD47 является трансмембранным поверхностным гликопротеином суперсемейства иммуноглобулина. Как интегрин-связанный протеин, он высоки выражен в обоих гематологических раках (лейкемия, лимфома, и множественной миеломы) и твердых рака (таких как рак яичников, мелкоклеточного рака легких, поджелудочной железы, глиобластомы) и других видов рака36,37. CD47 также известен как не-есть-я сигнал макрофагов, который сделал его потенциальной терапевтической мишенью в некоторых видов рака. CD47-CAR Т-клетки были произведены и протестированы против BxPC3 раковых клеток поджелудочной железы, которые выражают высокий уровень CD4738,39. Клетки BxPC3 были посеяны в E-Plate на 1 день при плотности 10000 клеток / хорошо. Мониторинг в реальном времени показал, что эти клетки достигли всблонь после 16 ч. В этот момент, CAR Т-клетки были добавлены в соотношении E:T 10:1 (Рисунок 4A). Также были добавлены элементы контроля, такие как нетрансиндутовые Т-клетки и Т-клетки Mock CAR. Результаты ясно показывают, что CD47-CAR T клетки выборочно убивают целевые клетки BxPC329. Кроме того, на рисунке 4B показано, что сигнал импеданса при добавлении клеток CD47-CAR T в пустой колодец значительно ниже, чем сигнал импедеданса, генерируемый целевыми ячейками BxPC3. Значение индекса ячеек от скважин только с клетками CD47-CAR T достигло максимума 0,14, что лишь немного выше сигнала только от среды (0,02). Это указывает на то, что в этом неоднородном убийственом анализе сигнал импеданса выводится почти исключительно из раковых клеток-мишеней.
Костимуляция Т-клеток CAR по домену GITR Когда выражается в EGFR-GITR-CD3 CAR, GITR costimulatory домена ранее сообщалось для повышения убийства EGFR-положительных раковых клеток SKOV3, но не EGFR-отрицательных MCF-7 раковых клеток30. Чтобы лучше прояснить роль домена GITR, были созданы и протестированы конструкции CAR, содержащие полнометражный домен GITR, или удаленные или перестроенные версии домена, и протестированы на способность коактивировать клетки CAR T(рисунок 5A). Данные xCELLigence на рисунке 5B,C показывают, что домен GITR costimulatory усиливает убийство клеток CAR EGFR-положительных целевых ячеек выше того, что наблюдается с оригинальной конструкцией CAR, в которой отсутствует домен GITR. Кроме того, удаляя 10 аминокислот из домена ГИТР (аминокислоты 184-193) упразднили эту стимулирующую деятельность. В отличие от этого, перестановка относительного позиционирования домена GITR в рамках конструкции ЦАР оказалась менее вредной для его стимулирующих возможностей. Используя данные конечной точки, производство ИФНЗ в качестве суррогата активации Т-клеток также продемонстрировало стимулирующую активность домена GITR(рисунок 5B). В отличие от конечных данных, которые являются просто "снэп выстрел", непрерывный профиль impedance прибора xCELLigence четко освещает тонкие различия в убийстве кинетики различных методов лечения (Рисунок 5C). Результаты, полученные здесь, согласуются с результатами исследования in vivo30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Рисунок 1: Система анализа клеток xCELLigence в реальном времени (RTCA) обнаруживает убийство клеток-мишеней клетками-эффекторами. Есть три основных концептуальных шага для измерения убийствельной активности клеток CAR T-эффектора против целевых раковых клеток. Шаг 1: Семя клетки-мишени (т.е. опухолевые клетки) в колодец E-плиты. Клетки прикрепляются к микроэлектродам золотого биосенсора, что препятствует потоку электрического тока между электродами. Это значение impedance измеряется и построено как безединый параметр, называемый Cell Index. Значение индекса клеток увеличивается по мере роста клеток и достигает плато по мере приближения клеток к слиянию. Шаг 2: Эффекторные клетки-непридерживаемые иммунные клетки впоследствии добавляются. Поскольку эти клетки не придерживаются золотых микроэлектродов, они напрямую не вызывают изменения в бесприступной деятельности. Шаг 3: Если клетки-эффекторы атакуют раковые клетки цели, разрушение опухолевых клеток отражается снижением индекса клеток с течением времени. Эта цитоличная активность клеток-эффекторов, или потенция клеток-эффекторов, может быть чувствительно и точно контролируется. Непрерывное получение impedance данных из системы xCELLigence позволяет в режиме реального времени убийство кинетического анализа для нескольких условий одновременно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Рисунок 2: Титер определение лентивирусной и цитометрии потока оценки CAR Т-клеток. (A) Лентивирная дичер определение. Различные цветовые линии являются репрезентативными образцами для числа циклов по сравнению с дельтой Rn. Низкие числа цикла указывают на относительно большое количество шаблона РНК вируса, присутствующем в образцах. (B) После трансдукции, CAR Т-клетки были культивированы и поддерживается при плотности менее 2 х 106 клеток / мл, а затем подвергаются анализу потока. Оси y-отражаетокрашивание для Т-клеток, с положительными значениями, отраженными в областях No1 и No2. Оба образца на 100% положительные для Т-клеток. Выражение CAR scFV определяется с помощью scFv-специфического Ab (x-оси). Результат показывает, что более 50% Т-клеток являются положительными в CD22-CAR Т-клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Рисунок 3: Убийственная динамика Т-клеток CD22-CAR против лимфомы клеток Раджи Буркитта. В то время как красная кривая является только клетками Раджи, зеленая кривая – это клетки Раджи, обработанные Т-клетками CD22-CAR. Розовые и синие кривые Mock CAR Т-клеток лечения и нетрансиндуцированной Т-клеточной обработки, соответственно. Коэффициент E:T 10:1. Бары ошибок являются стандартным отклонением. Шкала времени устанавливается с интервалом в 2 ч для легкого отображения, хотя доступно больше точек данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Рисунок 4: Эффективность Т-клеток CD47-CAR против поджелудочная железа твердых опухолевых клеток. (A) Розовый является целью BxPC3 клетки в одиночку, в то время как красный BxPC3 с CD47-CAR Т-клетки добавил. Зеленый цвет BxPC3 с добавлением nontransduced Т-клеток, и синий с Mock CAR T-клетками. Коэффициент E:T 10:1. (B) В том же месте, красный является пустым (отсутствие целевых ячеек) контроль скважин с CD47-CAR Т-клеток только и зеленый является только средой. Бары ошибок являются стандартным отклонением. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Рисунок 5: ДОмен GITR увеличивает цитотоксическую активность CAR T против EGFR-положительных опухолевых клеточных линий. (A) Различные конструкции CAR. (B) Бар участков % цитоз для различных конструкций ЦАР на 4 ч (слева) и 24 ч (средний). Продукция ИФНЗ на уровне 24 ч показана справа. (C) Непрерывная оценка убийства для всех конструкций. Черная кривая является кривой роста bxPC3 раковых клеток яичников только. Зеленая кривая является целевой клетки, обработанные только Т-клеток, синяя кривая является целевой клетки, обработанные Мок CAR Т-клеток, красная кривая является целевой клетки, обработанные EGFR-CD3-GITR-T клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Мы описываем количественную систему анализа цитолизва в реальном времени в режиме реального времени для оценки потенции химерных антигенных рецепторов Т-клеток, нацеленных на жидкие и твердые опухолевые клетки. Этот протокол может быть расширен для оценки других клеток иммунного эффектора, а также комбинированных методов лечения.

В режиме реального времени потенции Асса для химерных антигенов рецепторов T клеток ориентации твердых и гематологических раковых клеток

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

xCELLigence анализ клеток в режиме реального времени позволяет количественно контролировать убийство раковых клеток иммунными клетками в условиях, свободных от этикеток, и в течение нескольких дней. Эта система обеспечивает полный курс времени убийства раковых клеток, позволяющий одновременно скрининг большого количества конструкций, типов клеток-эффекторов, или комбинированной терапии при низком эффекторе к целевым соотношениям. Начните с посева 1,5 раза 10 до семи HEK293FT клеток в DMEM культуры среды в 150 миллилитров клеточной культуры блюдо для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью.На следующее утро смешайте 2,5 миллилитров раствора для разбавления трансфекции, дополненную пятью микрограммами плазмидной ДНК лентивирусного вектора и 22,5 микрограммами лентивирусной упаковочной смеси с 82,5 микролитров трансинфекционные реагенты в 2,5 миллилитров раствора для разбавления трансфекции. После 15-минутной инкубации при комнатной температуре, передача реакции падение мудрым в блюдо HEK293FT клеток и вернуть клетки в инкубатор на секунду ночь инкубации. На следующее утро замените супернатант на 19 миллилитров свежей среды культуры DMEM и верните клетки в инкубатор на ночь.Соберите супернатант в одну 50 миллилитровую коническую трубку для хранения четырех градусов по Цельсию в течение следующих двух дней, прежде чем осадки лентивируса центрифугации на второе утро, с тем чтобы удалить любые клетки или мусора из раствора. Перенесите все, кроме одного миллилитра лентивируса, содержащего супернатант, в сверхчистую центрифугу для ультрацентрифугации. После ультрацентрифугации, тщательно аспирировать остаточный вирус, содержащий супернатант, аккуратно добавить 100 микролитров DMEM к грануле, и поместить трубку на лед в течение 15 минут.В конце инкубации аккуратно смешайте раствор и процитировать раствор лентивируса в предварительно охлажденные стерильные трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем определите рейтер лентивируса по количественным RT-PCR в соответствии с инструкциями производителя. Для генерации и расширения клеток CAR-T активируйте от одного до двух раз от 10 до шести моноядерных клеток периферической крови в одном миллилитре среды клеток CAR-T с равным количеством микроволокна с покрытием CD3/CD28 в одном колодец 24-хорошо пластины в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов.Следующие два утра, смешать один микролитер трансдуктора усилителя трансдукции агента с клетками, а затем добавление лентивируса при множественности инфекции пять к одному. Мониторинг роста Т-клеток каждые два-три дня, добавляя свежие CAR-T клеточной среды по мере необходимости для поддержания клеток в один-два раза от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации. Для обнаружения экспрессии Т-клеток CAR по цитометрии потока, перенесите три раза 10 на пятый CAR и непереведенные Т-клетки в отдельные 1,5 миллилитровые микроцентрифуги.Соберите клетки путем центрифугации и повторного перерасхода гранул в 200 микролитров буфера FACS дополнены 1%человеческой сыворотки. Разделите каждый образец клетки на 100 микролитров алицитов в отдельных пятими миллилитровых полистирола FACS труб на льду. Через пять минут добавьте один микролитер биотинилированных фрагментов FAB2 козьего противомошашки FAB2 в одну трубку каждого типа клеток и два микролитров антитела к другой трубке каждого типа клеток с тщательным смешиванием.После 30 минут на льду, мыть клетки с тремя миллилитров свежего буфера FACS и после центрифугирования деканат супернатантов. Повторное добавление гранул в оставшийся супернатант и добавить два микролитров APC анти-CD3 и два микролитров 7-AAD для каждой трубки. Добавьте один микролитер с маркировкой PE Streptavidin с кратким смешиванием в трубку, окрашенную анти-FAB2 антителами и инкубировать все трубки на льду в течение 30 минут.В конце инкубации проанализируйте клетки по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами, загоняя Т-клетки вперед по сравнению с боковым рассеянием и CD3 против экспрессии 7-AAD. Для анализа потенции цитолитоза в режиме реального времени добавьте от 50 до 100 микролитров среды культуры целевых клеток к каждому колодец электронной пластины и измерьте фоновое неровность в инструменте анализатора клеток. Обнаружить целевые раковые клетки из пластины культуры с помощью трипсина.Вымойте клетки в 15 миллилитров свежей среды культуры и центрифуги. Переусейте гранулы раковых клеток в пяти миллилитров свежей среды для подсчета и настроить плотность клеток к соответствующей концентрации целевых клеток. Добавьте клетки в соответствующее количество колодцев и оставьте электронную пластину на 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки равномерно оседают на дне колодцев.В конце периода эквилибрации поместите пластину в анализатор клеток в режиме реального времени и автоматически инициируйте измерение имплеанса каждые 15 минут на ночь. Адгезия и распространение целевых ячеек можно отслеживать в режиме реального времени. На следующее утро разбавить эффектор CAR и контролировать Т-клетки до соответствующей концентрации в отдельных трубках и удалить от 50 до 100 микролитров из каждой колодец электронной пластины, так что окончательный объем в каждой хорошо составляет 100 микролитров.Далее семенной эффектор и контроль Т-клеток в соответствующих скважинах при соответствующем эффекторе к целевым соотношениям в 100 микролитров среднего на скважину. Затем эквилибрируйте электронную пластину в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем вернуть пластину в систему анализатора клеток. Для измерения эффективности Т-клеток опосредовано убийство целевых раковых клеток, контролировать CAR-T опосредованное убийство в течение 96 часов.Около 50% клеток CAR-T, окрашенных положительно для анти-одной цепи переменных фрагментов антител, указывающих на экспрессию ЦАР примерно в 50% Т-клеток. В этом репрезентативном эксперименте для всех групп использовалось соотношение 10 к одному и целевому показателю. Раджи клетки только и CD22-CAR Т-клеток лечение Raji клетки отображаются значительные убийства по сравнению с контролем Т-клеток только и Mock CAR-T клеточных групп.В этом эксперименте, только CD47-CAR-T клетки были эффективны в убийстве раковых клеток поджелудочной железы. Кроме того, сигнал о неуступности только от клеток CD47-CAR-T был лишь немного выше сигнала индекса клетки, измеренного только в средних колодцах, указывающих на то, что сигнал о неуступности в результате подвесных клеток, таких как клетки CAR-T, минимален и не способствует общему сигналу о неприступности, когда клетки CAR-T добавляются в раковые клетки цели. Примечательно, что GITR состимуляторного домена было отмечено, чтобы быть более эффективным в повышении CAR-T клеточного убийства против эпителиального фактора роста рецепторов положительных целевых клеток по сравнению с оригинальными конструкций ЦАР без домена GITR.Среда из скважин электронной пластины может быть собрана для анализа профиля цитокинов в точках времени во время или после анализа в соответствии с потребностями эксперимента. В целом, xCELLigence повысил эффективность оценки потенции различных иммунотерапии, начиная от двухспецифических Т-клеток и онколитических вирусов до ингибиторов иммунной точки проверки в комбинированной терапии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Клиническое применение<em&gt; Спящая красавица</em&gt; И искусственный антиген-представляющие клетки генетически модифицировать T клеток из периферической и пуповинной крови

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Подготовка опухолевый антиген нагруженных Зрелые дендритные клетки иммунотерапии

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Одновременное количественное определение Т-клеточного рецептора иссечение Круги (TRECs) и K-Удаление рекомбинация Вырезание кругов (KRECs) по ПЦР в реальном времени

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...