Name: a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells
Uploaded: 2019-11-12T10:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells at JoVE.com

Los autores agradecen a ProMab Biotechnologies y ACEA Biosciences por proporcionar los reactivos e instrumentos utilizados en este estudio.

1. Generación de lentivirus codificante CAR
NOTA: Una vez finalizada la construcción específica del plásmido de células T CAR (CD47 y otros), los CAR lentivirales son generados por el procedimiento estándar, utilizando 293 células FT, una mezcla de envases lentivirales y agentes de transfección (véase la Tabla de Materiales)como se describe29. Posteriormente, utilice un kit cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) y un ciclor térmico (ver la Tabla de Materiales)para determinar el tetador de virus midiendo la cantidad de ARN lentiviral de acuerdo con el protocolo del fabricante. Es importante que todos los procedimientos lentivirales se lleven a cabo estrictamente siguiendo los requisitos de seguridad.
<ol><li>Seha 15 x 106 HEK293FT células en el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) e incubar las células durante la noche a 37 oC en una placa de 150 mm dentro de una incubadora de CO2 humidificada.</li>
	<li>Preparar dos tubos de 15 ml con complejo de transfección. El primer tubo contiene ADN de plásmido vectorial lentiviral (5 g) y mezcla de envases lentivirales (22,5 g) en 2,5 ml de solución de dilución de transfección. El segundo tubo contiene 82,5 l de reactivo de transfección en 2,5 ml de solución de dilución de transfección (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Pipeta el contenido del tubo 1 en el tubo 2, e incuba rinde la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Transfiera el contenido del tubo en gota al plato de las células HEK293FT e incubar la muestra durante la noche a 37 oC en una incubadora humidificada de CO2 al 5%.</li>
	<li>Al día siguiente, sustituya el medio existente por 19 ml de medio de cultivo DMEM fresco y continúe incubando las células durante el interior de la incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37oC.</li>
	<li>Transfiera el medio del plato a un tubo centrífugo de 50 ml. Mantenga el tubo con el medio que contiene virus en el refrigerador.</li>
	<li>Repita el procedimiento anterior, agregando DMEM fresco y recogiendo de nuevo después de 1 día.</li>
	<li>Combine dos colecciones de medios en un tubo de centrífuga. Centrifugar el tubo a 2.000 x g durante 30 min a 4oC.</li>
	<li>Transfiera la mayor parte del sobrenadante que contiene lentivirus a un tubo de centrífuga ultraclaro. Deje un volumen mínimo, aproximadamente 1 ml, del sobrenadante para evitar perturbar el pellet que puede contener células y/o escombros.</li>
	<li>Ultracentrifure el sobrenadante aclarado anteriormente a 110.000 x g durante 100 min a 4 oC.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado y agregue suavemente 100 ml de medio DMEM al pellet del virus en la parte inferior del tubo. Deje el tubo sobre hielo durante 15 minutos. Mezclar la solución suavemente y alícuota la solución de lentivirus en tubos estériles preenfriados. Almacene estos tubos de material de virus en un congelador de -80 oC.</li>
	<li>Utilice un kit cuantitativo RT-PCR para determinar el titer del lentivirus de acuerdo con el protocolo del fabricante, que extrae y mide el ARN lentiviral.</li>
</ol>2. Generación y expansión de células T CAR
<ol><li>Activar PBMCs humanos previamente congelados (alrededor de 1 x 106 a 2 x 106 células) en 1 ml de medio de células T CAR con un número igual de microperlas recubiertas de CD3/CD28 (ver la Tabla de Materiales)e incubar las células a 37 oC en una incubadora humidificada de 5% de CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Descongelar una alícuota del caldo de lentivirus en hielo.</li>
	<li>Añadir 1 l de transducción mejorar el agente en el pozo con las células y mezclar.</li>
	<li>Agregue lentivirus a las células a una multiplicidad de infección (MOI) de 5:1 y mezcle suavemente. Al día siguiente, repita este paso (24 h después de la primera transducción).</li>
	<li>Supervise el crecimiento de la célula T cada 2-3 días. Agregue más medio de célulata T CAR fresco para mantener las células a una densidad de 1 x 106 a 2 x 106 celdas/ml.</li>
	<li>Congele las células T CAR con un protocolo estándar utilizando la solución de congelación (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Descongelar las células T CAR utilizando un método estándar y precultivarlas en el medio de células T CAR durante aproximadamente 2-4 h con IL-2 (300 unidades/ml) antes de aplicarlas al ensayo.</li>
</ol>3. Detección de la expresión CAR por citometría de flujo
<ol><li>Transfiera 3 x 105 células T CAR y células T no transducidas a dos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 2 min y resuspender las células en 200 ml de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) que contiene 1% de suero humano.</li>
	<li>Pipet 100 l de solución celular en dos tubos FACS de poliestireno de 5 ml y mantener los tubos en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir 1 l de cabra biotinicada anti-ratón F(ab')2 a un tubo de cada tipo de célula. A continuación, agregue 2 l de anticuerpo antietiqueta con etiqueta PE (consulte la Tabla de materiales)al otro tubo de cada tipo de celda. Mezclar bien e incubarlos en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Lavar las células con 3 ml de tampón FACS en cada tubo y centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min; desechar los sobrenatantes y el vórtice muy brevemente o agitar los tubos brevemente para resuspender las células en el líquido residual.</li>
	<li>Añadir 2 l de APC anti-CD3 y 2 l de solución de anticuerpos 7-AAD (ver la Tabla de Materiales)a cada tubo. En el tubo de las células teñidas con anti-F(ab')2 Ab, agregue 1 l de estreptavidina etiquetada con PE. Mezclar brevemente e incubar los tubos sobre hielo durante 30 minutos más.</li>
	<li>Utilice el tampón FACS para lavar las células de nuevo como se describe en el paso 3.5 y agregue 200 l adicionales de tampón FACS a cada tubo.</li>
	<li>Utilice la citometría de flujo para analizar las celdas primero en las celdas T en una gráfica de dispersión hacia delante frente a dispersión lateral y, a continuación, en las celdas vivas (7-AAD-negativas) en una gráfica CD3 frente a 7-AAD. El último paso es analizar anti-etiqueta, anti-ScFv o anti-F(ab')2 contra CD3.</li>
</ol>4. Ensayo de potencia de citolisis en tiempo real
NOTA: Realice el ensayo RTCA de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante. En resumen, primero placa las células diana en los pozos de la placa E, seguido por la adición de células T CAR en el día siguiente. La actividad de citolisis de las células T CAR contra las células diana se monitorea en tiempo real. Las células T y las células T transducidas por simulacros (células T CAR falsas) se utilizan como controles de células efectoras negativas. El siguiente protocolo describe un ensayo de potencia de citolisis en tiempo real in vitro para líneas celulares tumorales adherentes.
<ol><li>Agregue 100 l de medio de cultivo de celda objetivo a cada pocal de la placa E xCELLigence, coloque la placa dentro del instrumento xCELLigence y realice una lectura de fondo. Luego, transfiera la Placa E a una campana de cultivo de tejido para la sembración celular.</li>
	<li>Utilice un protocolo estándar para probar las células cancerosas objetivo desde el dispositivo de cultivo. A continuación, transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue un medio de cultivo fresco, de hasta 15 ml. Pellet las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g. Deseche el sobrenadante, agregue 5 ml de medio fresco y utilice una pipeta serológica para resuspender suavemente el pellet celular. Cuente la densidad de las células vivas utilizando un hemocitómetro y un microscopio.</li>
	<li>Ajuste la densidad celular adecuadamente y luego agregue 100 L de la suspensión celular a cada pocal de la placa E. El número de célula objetivo es típicamente alrededor de 10,000 células/bien para líneas celulares adherentes (BxPC3, Hela-CD19 y SKOV3), o 30.000 células/bien para células de suspensión como Raji (ver más abajo para obtener detalles sobre la precapa de pozos con anticuerpos con el fin de amarre células cancerosas líquidas).</li>
	<li>Equilibrar la placa E a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se asienten uniformemente en la parte inferior del pozo (esto es crítico; no se salte este paso).</li>
	<li>Coloque la placa E en el instrumento xCELLigence dentro de la incubadora de cultivo celular y comience a medir la impedancia, que se muestra como índice de celda frente a tiempo, automáticamente cada 15 minutos.</li>
	<li>Al día siguiente, prepare las células T del efector CAR. Asegúrese de preparar los controles apropiados (es decir, células T CAR simuladas, células T de control no transducidos y/o células T CAR no relacionadas) con anticipación para asegurarse de que todas las células estén listas al mismo tiempo. Ajuste las células efectoras y las células de control a la densidad adecuada, y prepare diluciones en serie para asegurarse de que se lograrán las relaciones E:T deseadas cuando se agreguen 100 s de suspensión de células efectoras a cada pocal en el paso 9.</li>
	<li>Detenga la adquisición de datos xCELLigence y lleve la Placa E de la incubadora a una campana de cultivo celular.</li>
	<li>Retire 100 ml de medio de cada poca. La cantidad de medio residual en cada pozo es ahora de 100 l.</li>
	<li>Añadir 100 l de células T CAR del efector diluido en serie u otras células de control (es decir, células T CAR falsas) para lograr las relaciones E:T deseadas.</li>
	<li>Equilibrar la placa E a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células efectoras se asienten, y luego vuelva a colocar la placa E en el instrumento xCELLigence. Reanudar la adquisición de datos.</li>
	<li>Si así se desea, en momentos clave xCELLigence adquisición de datos se puede pausar y la placa de sacia con el fin de recoger pequeñas muestras para ser analizadas por ensayos ortogonales (es decir, la medición de la producción de citoquinas por ELISA o citometría de flujo).</li>
	<li>En el experimento de células T EGFR-GITR-CD3 CAR, mida el rendimiento de INF con un kit ELISA (siga las instrucciones del fabricante; véase la Tabla de materiales). NOTA SOBRE EL USO DE CáncerES LIQUIDOS: Para la prueba de células cancerosas hematológicas no adherentes, antes de agregar células los pocillos de la Placa E se recubren primero con un anticuerpo que es específico para un antígeno que se expresa en la superficie de las células cancerosas. Para la línea de células Raji B se utiliza un reactivo de anclaje basado en anti-CD40 (ver kit de ensayo de matanza de tumores líquidos en la Tabla de Materiales). A continuación se muestra el procedimiento para el recubrimiento de la placa:</li>
	<li>Diluir el reactivo de anclaje (anti-CD40) con tampón de anclaje a una concentración de 4 g/ml.</li>
	<li>Trabajando dentro de una capucha de cultivo de tejido, agregue 50 s de la reactivo de anclaje diluido a cada pocal de la placa E. Deje la placa E a temperatura ambiente o en una incubadora de 37oC durante 3 h.</li>
	<li>Retire el reactivo de anclaje y lave la placa E al menos 2 veces con tampón de lavado. En este punto, la placa E está lista para sembrar las células diana de Raji (30.000 células/pozo).</li>
	<li>Continúe con el paso 4.1 (arriba) para realizar el resto del procedimiento.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores llevan a cabo investigaciones en el desarrollo de células T CAR y ensayos de potencia asociados que son intereses comerciales de ProMab Biotechnologies y ACEA Biosciences, respectivamente. Sin embargo, esto no altera la adhesión de los autores a la misión de JoVE de aumentar la difusión del conocimiento científico. Los términos de esta publicación han sido revisados y aprobados por ProMab Biotechnologies y ACEA Biosciences de acuerdo con su política de investigación.

Los receptores de antígeno quimérico son proteínas multidominio compuestas por un fragmento variable extracelular de cadena única (región scFv), una región de bisagra, una región transmembrana y un dominio citoplasmático compuesto por dominios de señalización TCR y dominios coestimulantes adicionales de receptores como CD28 y OX4011,40. Para diseñar CARs seguros, selectivos y eficaces, es imperativo que las diversas permutaciones en el diseño de los CAR se prueben a fondo utilizando ensayos de potencia in vitro y, eventualmente, modelos animales. En este estudio, hemos proporcionado un protocolo y un flujo de trabajo para cómo un ensayo de potencia in vitro en tiempo real puede informar el diseño de CARs eficaces.
Al diseñar cualquier tipo de ensayo de potencia, especialmente con fines de fabricación, es imperativo que el ensayo sea sensible, robusto, consistente y lo más cercano al mecanismo de acción posible16,17,41. El ensayo de potencia en tiempo real descrito aquí está diseñado para medir la actividad citolítica de la célula T CAR directamente en lugar de usar un marcador suplente como la liberación de citoquinas. Es importante destacar que el ensayo no requiere ningún componente adicional, como dedos o reactivos que no sean la placa de ensayo (E-Plate) y los medios recomendados para el mantenimiento de las células. Además, el ensayo es exquisitamente sensible y proporciona datos altamente reproducibles en comparación con otros ensayos basados en etiquetas42,43,44. Además, el ensayo xCELLigence es susceptible de utilizar relaciones de efecto-objetivo muy bajas, lo que es ideal para la evaluación de citolisis específica.
Con el fin de demostrar la flexibilidad y utilidad del sistema xCELLigence, nos hemos centrado en dos tipos de tumores, a saber, tumores de origen hematológico y tumores sólidos. Para evaluar la potencia de los linfocitos CAR T dirigidos por CD22, las células Raji (es decir, una línea de células del linfoma de células B) se ataron a las Placas E utilizando un anticuerpo anti-CD40. El amarre de las células Raji en la parte inferior de las placas electrónicas da como resultado una señal de impedancia que refleja la viabilidad y el número de células Raji en el pozo. Después de la adición de células T CD22-CAR, las células Raji se matan selectivamente de una manera dependiente del tiempo y del efector, culminando en una disminución dependiente del tiempo en la señal de impedancia. La caída en la impedancia significa citolisis o pérdida de viabilidad de las células Raji17. Este enfoque selectivo de anclaje mediante anticuerpos se puede extender a otras líneas celulares tumorales líquidas. Una estrategia alternativa al uso de líneas celulares tumorales de origen hematológico es utilizar células cancerosas adherentes que están diseñadas para expresar establemente los antígenos tumorales, como el CD19 expresado en las células de HeLa. La ventaja de este enfoque es que las células Parentales HeLa están fácilmente disponibles y se pueden utilizar como un control negativo para la especificidad. Este enfoque ya ha sido validado con células CHO-CD22 frente a CHO y CHO-CMCa frente a células CHO29. Usando tales enfoques diferentes, el diseño y la eficacia de la célula T CAR se pueden probar fácilmente. El ensayo xCELLigence es intrínsecamente flexible, y las condiciones del ensayo se pueden ajustar para aproximar al máximo las condiciones fisiológicas.
Una ventaja importante del ensayo de potencia que describimos aquí es que es un ensayo funcional simple y se puede utilizar junto con técnicas de ingeniería genética para diseñar CARs óptimos y eficaces de una manera de alto rendimiento. Como se muestra aquí para las células T CAR diseñadas para apuntar a células cancerosas positivas egFR, el ensayo se puede utilizar para evaluar la actividad relativa de diferentes construcciones/mutantes CAR. Por ejemplo, mostramos que cuando el dominio GITR se encuentra en sentido ascendente del dominio CD3 muestra una actividad citolítica mucho más robusta que cuando se encuentra aguas abajo del dominio CD3.
Aunque no se correlaciona perfectamente con la actividad de la célula T de la CAR in vivo, la liberación de citoquinas in vitro se ha utilizado históricamente como una medida de la potencia de la célula T de la CAR. Aunque el ensayo de potencia basado en xCELLigence descrito aquí se puede utilizar para evaluar terapias basadas en células durante la fabricación o antes de ser liberado según lo publicado para su aplicación clínica, ¿qué tan bien se correlacionan estos resultados con la eficacia in vivo aún no se ha Establecido. La eficacia in vivo depende de una serie de factores y variables que pueden no ser recapituladas dentro de un ensayo in vitro. Tales variables incluyen: la localización de las células T CAR al sitio del tumor, la estimulación y activación de la célula T CAR y su capacidad para persistir dentro del paciente, y el microambiente tumoral. Con un mayor refinamiento, el ensayo xCELLigence puede ser capaz de modelar algunos de estos procesos complejos in vitro.
El protocolo proporcionado aquí se aplica a la mayoría de las líneas celulares de cáncer adherentes y algunas de las líneas celulares de tumor líquido. Sin embargo, las muestras clínicas, como las células cancerosas primarias, deben analizarse y optimizarse aún más debido a la complejidad de los tipos y fases del tumor. Ciertamente vale la pena señalar que el sistema de ensayo de potencia in vitro descrito aquí utiliza líneas celulares de cáncer sólo para reflejar la actividad potencial de las células T CAR. La situación tumoral real dentro del cuerpo humano es mucho más compleja, especialmente cuando se dirige un tumor sólido, debido al entorno y desarrollo dinámico del tumor. Por lo tanto, el resultado de la evaluación de potencia puede no traducirse muy bien en la eficacia clínica de las células T CAR analizadas.
En resumen, la plataforma xCELLigence basada en impedancia presentada permite la supervisión sin etiquetas de la matanza de células durante un período prolongado de tiempo, a saber, hasta 10 días. Esta capacidad para una escala temporal tan larga para la recopilación de datos diferencia la tecnología de otros ensayos que están actualmente en uso y que requieren la creación de múltiples réplicas experimentales para la recopilación de puntos de tiempo y la laboriosa manipulación de muestras. Además, la contribución mínima de la señal de las células inmunitarias del efector simplifica el análisis de datos. El software puede procesar datos automáticamente y generar parámetros útiles como el porcentaje de citolisis, KT50, etc. La tecnología ya ha demostrado alta sensibilidad (con relaciones E:T tan bajas como 1:20) y un amplio rango dinámico (con relaciones E:T de 20:1 a 1:20), que no se logra fácilmente con otros ensayos. En general, la implementación de esta tecnología debería permitir un análisis de datos más preciso en una escala de mayor rendimiento que mejorará el desarrollo de reactivos de células T CAR, avanzando en el campo a un ritmo mucho mayor.

En los últimos años, la terapia de células T de la CAR ha sido uno de los avances más destacados en la inmunoterapia contra el cáncer para las neoplasias hematopoyéticas recidivantes y refractarias. Con el reciente EE.UU. Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aprobación de células T CAR dirigidas por CD19 para leucemia linfoblástica aguda, linfoma no Hodgkin y linfoma difuso de células B grandes, y la designación de terapia innovadora para antígeno de maduración de células B (BCMA) -dirigido CAR T células para el mieloma múltiple, esta tecnología ha generado gran en la comunidad científica y ha alimentado numerosos estudios básicos, aplicados y clínicosentodo el mundo 4,5. En enero de 2019, se registraron más de 700 ensayos clínicos en la base de datos de ensayos clínicos (clinicaltrials.gov); alrededor de 450 de estos ensayos estaban a punto de comenzar o estaban reclutando activamente pacientes. La mayoría de los ensayos clínicos se centran en neoplasias malignas hematológicas, y los ensayos clínicos que utilizan células T CAR dirigidas a CD20, CD22 y BCMAs, además de CD19, también están en curso6,7. Mientras que la mayoría de los ensayos están utilizando la terapia autóloga DE células T CAR, un número significativo de ellos también están explorando la utilidad de las células Alogénicas CAR T8,9,10. A pesar de los resultados prometedores con neoplasias malignas hematológicas, el uso de células T CAR para atacar tumores sólidos ha demostrado ser mucho más difícil en la clínica por una variedad de razones, incluyendo pero no limitado a la falta de buenos objetivos que se expresan exclusivamente en el tumor, la heterogeneidad de tumores sólidos y tumor "escapar", y la dificultad que tienen las células T CAR para acceder al microambiente tumoral11,12,13,14, 15. Existe una necesidad crítica para el desarrollo de células CAR T específicas de tumores sólidos que puedan superar estas barreras a la eficacia y el problema de la toxicidad "en el tumor objetivo fuera". Mientras que una multitud de enfoques in vitro e in vivo están justificados en el diseño y pruebas de células T CAR, un ensayo de potencia in vitro robusto y predictivo es de importancia primaria16,17.
Con el fin de evaluar la potencia de las células T CAR, se han desarrollado varios métodos in vitro. En general, estos ensayos de potencia se pueden dividir en dos amplias categorías dependiendo de si (i) miden directamente la actividad citolítica de las células T CAR contra las células tumorales diana, o (ii) miden los marcadores sustitutas como las citoquinas que son liberadas por las células T CAR a medida que matan a las células diana. Las técnicas que miden la actividad citolítica incluyen directamente el ensayo de liberación de cromo-51 (CRA)18,ensayos basados en imágenes que miden la apoptosis de las células diana utilizando sondas fluorescentes19,20y ensayos de citometría de flujo que detectan células diana apoptoticas21. En estos ensayos, las células T CAR se co-cultivan típicamente con células diana que han sido preetiquetadas con sondas radiactivas o fluorescentes, seguidas de una medición adecuada. Aunque durante mucho tiempo ha sido considerado el estándar de oro en el campo debido a su sensibilidad, la CRA tiene algunos inconvenientes. En primer lugar, es un ensayo de punto final y no proporciona información cinética. En segundo lugar, las células diana necesitan ser etiquetadas con cromo-51 que tiende a lixiviar fuera de las células y puede aumentar significativamente el ruido de fondo22. Por último, requiere las precauciones adecuadas y la eliminación de los residuos radiactivos. Los ensayos alternativos, que miden los subproductos de la interacción de las células T CAR con las células diana como una indicación de potencia, incluyen la cuantificación de varias citoquinas liberadas por células T CAR utilizando métodos basados en citometría de flujo o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas. Una vez más, estos son ensayos finales que miden la liberación acumulativa de las citoquinas en un momento dado y, por lo tanto, pueden no reflejar necesariamente la actividad citolítica real de las células T CAR.
Al desarrollar un ensayo de potencia, particularmente uno que define los criterios de liberación para una terapia basada en células como una célula T CAR, es fundamental que el ensayo implique manipulaciones mínimas y tiempo práctico porque cada interacción es otra variable que debe tenerse en cuenta y puede disminuir la robustez general y la consistencia del ensayo. Además, la interacción de las células T CAR con las células tumorales es un proceso dinámico, y proporcionar información sobre estas interacciones dinámicas, como la tasa de citolisis, es de importancia primaria para la evaluación de potencia. Con estos criterios en mente, desarrollamos un ensayo de potencia cinética sin etiquetas para células CAR T que utiliza la plataforma de análisis celular en tiempo real (RTCA) xCELLigence. xCELLigence utiliza placas de microtíter especializadas (E-Plates) que contienen biosensores de oro incrustados en la parte inferior de cada pocal. Trabajando con células tumorales sólidas adherentes, o células cancerosas líquidas que han sido atadas usando anticuerpos específicos, estos biosensores monitorean en tiempo real cambios inducidos por células T CAR en el número de células diana, el tamaño de la célula, la fuerza de unión de sustrato celular y las interacciones célula-células (es decir, la función de barrera)17,23,24,25,26,27,28. El flujo de trabajo es simple e implica simplemente sembrar las celdas de destino en los pozos de E-Plates, seguido de la adición de las células T CAR en diferentes relaciones efector-objetivo(Figura 1). Posteriormente, a medida que los biosensores monitorean continuamente la viabilidad de las celdas de destino, los datos se muestran automáticamente en tiempo real.
En los últimos 15 años el ensayo xCELLigence ha sido validado para evaluar la potencia de las células asesinas naturales (NK), células T, células T CAR, inhibidores de punto de control, anticuerpos biespecíficos, virus oncolíticos, y algunas terapias combinadas17,29,30,31,32,33,34. Recientemente, el ensayo de potencia xCELLigence fue evaluado para la fabricación de células T de ingeniería de receptores de células T (TCR)35. Aquí informamos que emplea el sistema RTCA para evaluar la potencia in vitro de las células T CAR diseñadas para atacar tumores sólidos y tumores líquidos en terapias clínicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td>8100005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human F(ab&#39;)2</td>
			<td>Jackson Immunoresearch laboratories.</td>
			<td>109-116-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay medium RPMI1640</td>
			<td>life technologies.Corp</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell frozen solution CryostorCS10</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR-T cell medium from ProMab</td>
			<td>AIM-V+300IFU/ml IL-2</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GElifesciences.com</td>
			<td>SH30243.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Promab made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Lonza.com</td>
			<td>14-503F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293FT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFg ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging Mix</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>VP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promab medium for target cells</td>
			<td>Varied with cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real time Cellular Analyer</td>
			<td>ACEA Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem)</td>
			<td>Transplus, Alstem</td>
			<td>V020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection dilution solution, Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent, NanoFect reagent</td>
			<td>Alstem</td>
			<td>NF100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a real-time potency assay for chimeric antigen receptor t cells targeting solid and hematological cancer cells

La terapia de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para el cáncer ha logrado un beneficio clínico significativo para neoplasias malignas hematológicas resistentes y refractarias, como la leucemia linfocítica aguda infantil. Actualmente se están realizando esfuerzos para extender esta prometedora terapia a tumores sólidos, además de otros cánceres hematológicos. Aquí, describimos el desarrollo y la producción de células T CAR potentes dirigidas a antígenos con expresión única o preferencial en células tumorales sólidas y líquidas. La potencia in vitro de estas células T CAR se evalúa en tiempo real utilizando el ensayo xCELLigence basado en impedancia altamente sensible. Específicamente, se examina el impacto de diferentes dominios de señalización coestimulante, como la proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (TNFR) (GITR), en la potencia in vitro de las células T de la CAR. Este informe incluye protocolos para: generar células T CAR para estudios preclínicos utilizando la transducción de genes lentivirales, expandir las células T CAR, validar la expresión CAR y ejecutar y analizar ensayos de potencia xCELLigence.

Preparación de lentivirus CAR y generación de células T CAR y evaluación de potencia Los lanzadores de las preparaciones de lentivirus CAR se determinaron utilizando un kit cuantitativo RT-PCR (ver la Tabla de Materiales)de acuerdo con el protocolo del fabricante. El protocolo de valoración extrajo primero el ARN del virus y luego midió el número de copia de ARN lentiviral, que indicaba la cantidad de partículas virales infecciosas. El titer de virus generado a partir de una placa de 150 mm utilizando el protocolo anterior generalmente oscila entre 109-1010 copias virales / ml. El cuadro 2A muestra el número de ciclo RT-PCR frente a la intensidad de la señal de un resultado cuantitativo representativo del PCR. Una vez satisfecha la calidad del virus, cuando el mareado era mayor que 1 x 108 pfu/ml, se congelaba para su posterior transducción de células T. Después de que las células T CAR fueron transducidas con lentivirus, las células T fueron cultivadas durante 12-14 días adicionales, manteniendo su densidad alrededor de 1 x 106 a 2 x 106 células/ml. Las células T CAR fueron entonces revisadas con anticuerpos específicos anti-ScFv usando un catómetro de flujo antes de una aplicación aguas abajo o se congelan hacia abajo. En la Figura 2Bse muestra un buen resultado de lote representativo. Usando un anticuerpo anti-ScFv, alrededor del 50% de las células T CAR teñidas positivas (Q2 50.6% vs. células T 1%), indicando la expresión de CAR en aproximadamente el 50% de las células T. Posteriormente, el ensayo de potencia RTCA se realizó para la determinación de la citolisis antes de que cada lote de células T CAR se congelara y estuviera listo para su aplicación futura. Un ciclo del procedimiento de diseño, generación y evaluación de la célula T CAR tardó aproximadamente 1 mes.
Asesinato de células B del linfoma Raji por células T CD22-CAR El kit de anclaje de tumores líquidos anti-CD40 (ver la Tabla de Materiales)se utilizó a una concentración de 4 g/ml para recubrir una placa E durante 3 h a 37 oC. Después de lavar los pozos con tampón de anclaje, se añadieron células de linfoma de células B a la placa E a una densidad de 30.000 células/pozo. Después de permitir que las células se asentaran durante 30 minutos, la placa E se colocó de nuevo dentro del instrumento xCELLigence, y las lecturas de impedancia se iniciaron inmediatamente con el fin de capturar el apego celular y la proliferación. Al día siguiente, se agregaron células T CD22-CAR, células T CAR poda o células T no transducidas. En la Figura 3, se utilizó una relación E:T de 10:1 para todos los tipos de celda. Las células Raji CD22 positivas, tratadas con células T CD22-CAR, mostraron una matanza significativa (traza verde) en comparación con los controles negativos (células T no transducidas y células T Car ficticias).
Asesinato eficaz de células de cáncer de páncreas por células T CD47-CAR CD47 es una glicoproteína superficial transmembrana de la superfamilia de inmunoglobulina. Como proteína asociada a la integrina, está muy expresada tanto en cánceres hematológicos (leucemia, linfoma y mieloma múltiple) como en cánceres sólidos (como cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células pequeñas, páncreas, glioblastoma) y otros tipos de cánceres36,37. CD47 también se conoce como una señal de no comer-me a los macrófagos, lo que lo ha convertido en una posible diana terapéutica en algunos tipos de cáncer. Se produjeron y probaron células T CD47-CAR contra células de cáncer de páncreas BxPC3 que expresan altos niveles de CD4738,39. Las células BxPC3 fueron sembradas en la placa E el día 1 a una densidad de 10.000 células/pozo. El monitoreo en tiempo real mostró que estas células alcanzaron la confluencia después de las 16 h. En este momento, las células T CAR fueron agregadas en la relación E:T de 10:1(Figura 4A). También se añadieron células efector de control como células T no transducidas y células T CAR simuladas. Los resultados muestran claramente que las células T CD47-CAR matan selectivamente las células29de BxPC3 objetivo. También, el cuadro 4B muestra que la señal de impedancia cuando las células T CD47-CAR se agregan a un pozo vacío es sustancialmente más baja que la señal de impedancia generada por las células BxPC3 de destino. El valor del índice de celda de los pozos con las células T CD47-CAR solo alcanzó un máximo de 0.14, que es sólo ligeramente más alto que la señal del medio solamente (0.02). Esto indica que en este ensayo de matanza heterogéneo, la señal de impedancia se deriva casi exclusivamente de las células cancerosas objetivo.
Coestimulación de células T CAR por el dominio GITR Cuando se expresa en un EGFR-GITR-CD3 CAR, el dominio coestimulante GITR fue reportado previamente para mejorar la matanza de células cancerosas SKOV3 positivas de EGFR, pero no células cancerosas MCF-7 negativas de EGFR30. Para aclarar mejor el papel del dominio GITR, las construcciones CAR que contienen el dominio GITR de longitud completa, o las versiones eliminadas o reorganizadas del dominio, se generaron y probaron para la capacidad de coactivar las células CAR T(Figura 5A). Los datos xCELLigence en la Figura 5B, C muestran que el dominio coestimulador GITR mejora la matanza de células T CAR de células de destino positivas EGFR por encima de lo que se observa con la construcción CAR original que carece del dominio GITR. Además, la eliminación de 10 aminoácidos del dominio GITR (aminoácidos 184-193) abolió esta actividad estimulante. Por el contrario, reorganizar el posicionamiento relativo del dominio GITR dentro de la construcción CAR resultó ser menos perjudicial para sus capacidades estimulantes. Utilizando datos de punto final, la producción de IFN como sustituto de la activación de células T también demostró la actividad estimulante del dominio GITR(Figura 5B). A diferencia de los datos de punto final, que es un simple "disparo rápido", el perfil de impedancia continua del instrumento xCELLigence ilumina claramente las diferencias sutiles en la cinética asesina de los diferentes tratamientos(Figura 5C). Los resultados obtenidos aquí son consistentes con los de un estudio in vivo30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig1.jpg"> Figura 1: El sistema de análisis de células en tiempo real (RTCA) xCELLigence detecta la matanza de células objetivo por células efectoras. Hay tres pasos principales de concepción para medir la actividad de matanza de las células efectorades CAR T contra las células cancerosas diana. Paso 1: Sembrar las células diana (es decir, células tumorales) en el pozo de una placa E. Las células se unen a los microelectrodos biosensores de oro y esto impide el flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. Este valor de impedancia se mide y traza como un parámetro sin unidad denominado índice de celda. El valor del índice de células aumenta a medida que las células crecen y alcanza una meseta a medida que las células se acercan a la confluencia. Paso 2: Las células efectoras-células inmunitarias no adherentes- se agregan posteriormente. Debido a que estas células no se adhieren a los microelectrodos de oro, no causan directamente un cambio de impedancia. Paso 3: Si las células efectoras atacan las células cancerosas objetivo, la destrucción de las células tumorales se refleja en una disminución en el índice celular con el tiempo. Esta actividad citolítica de las células efectora, o la potencia de las células efectora, se puede monitorear con sensibilidad y precisión. La adquisición continua de datos de impedancia del sistema xCELLigence permite el análisis cinético de matanza en tiempo real para múltiples condiciones simultáneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig2.jpg"> Figura 2: Determinación de la evaluación del lentivirus y la citometría de flujo de las células T CAR. (A) Determinación lentiviral del titer. Las diferentes líneas de color son muestras representativas para el número de ciclo frente al delta Rn. Los números de ciclo bajo indican una cantidad relativamente alta de plantilla de ARN de virus presente en las muestras. (B) Después de la transducción, las células T CAR se cultivaron y mantuvieron a una densidad de menos de 2 x 106 células/ml y luego se sometieron a análisis de flujo. El eje yrefleja la tinción de las células T, con valores positivos reflejados en las áreas Q1 y Q2. Ambas muestras son 100% positivas para las células T. La expresión de CAR scFV se determina utilizando un Ab específico de scFv(eje x). El resultado muestra que más del 50% de las células T son scFv positivas en las células T CD22-CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig3.jpg"> Figura 3: Dinámica de muerte de células T CD22-CAR contra células de linfoma de Raji Burkitt. Mientras que la curva roja son las células Raji solas, la curva verde son las células Raji tratadas con células T CD22-CAR. Las curvas rosa y azul son el tratamiento de células T Mock CAR y el tratamiento no transducido de células T, respectivamente. La relación E:T es 10:1. Las barras de error son desviación estándar. La escala de tiempo se configura a intervalos de 2 h para facilitar la visualización, aunque hay más puntos de datos disponibles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig4.jpg"> Figura 4: Eficacia de las células T CD47-CAR contra células tumorales sólidas pancreáticas. (A) Rosa es la blanco de las células BxPC3 sola, mientras que el rojo es BxPC3 con las células T CD47-CAR agregadas. El verde es BxPC3 con la adición de células T no transducidas, y el azul es con las células T CAR ficticias. La relación E:T es 10:1. (B) En el mismo ajuste, el rojo está vacío (falta de celdas de destino) pozos de control con células T CD47-CAR solamente y verde es el medio solamente. Las barras de error son desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59033/59033fig5.jpg"> Figura 5: El dominio GITR aumenta la actividad citotóxica de células T CAR contra las líneas celulares tumorales positivas por EGFR. (A) Diferentes construcciones CAR. (B) Parcelas de barras de % citolisis para diferentes construcciones CAR a 4 h (izquierda) y 24 h (medio). La producción de IFN a 24 h se muestra a la derecha. (C) Evaluación continua de matanzas para todas las construcciones. La curva negra es la curva de crecimiento de las células cancerosas ováricas BxPC3 solamente. La curva verde es las células de destino tratadas con células T solamente, la curva azul es las células diana tratadas con células T CAR falsas, la curva roja es las células de destino tratadas con células EgFR-GITR-CD3-CAR T, la curva rosa es las células diana tratadas con células T EGFR--GITR-CD3-CAR, y la curva marrón es las células diana tratadas con células EGFR-CD3-GITR-CAR T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59033/59033fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

El análisis celular en tiempo real de xCELLigence le permite monitorear cuantitativamente la muerte de células cancerosas por células inmunitarias en condiciones libres de etiquetas y en el transcurso de varios días. Este sistema proporciona un curso de tiempo completo de la muerte de células cancerosas objetivo que permite el cribado simultáneo de un gran número de construcciones, tipos de células efectora o terapias combinadas con un efector bajo a relaciones objetivo. Comience por sembrar 1,5 veces 10 a las siete células HEK293FT en el medio de cultivo DMEM en un plato de cultivo celular de 150 mililitros para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono con humedad.A la mañana siguiente, mezcle 2,5 mililitros de solución de dilución de transfección complementados con cinco microgramos de ADN plásmido vectorial lentiviral y 22,5 microgramos de mezcla de envasado lentiviral con 82,5 microlitros de reactivo de transfección en 2,5 mililitros de solución de dilución de transfección. Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, transfiera la gota de reacción sabia en el plato de las células HEK293FT y devuelva las células a la incubadora para una segunda incubación durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el sobrenadante con 19 mililitros de medio de cultivo DMEM fresco y devuelva las células a la incubadora durante la noche.Recoger el sobrenadante en un solo tubo cónico de 50 mililitros para un almacenamiento de cuatro grados Centígrados durante los próximos dos días antes de sedimentar el lentivirus por centrifugación en la segunda mañana con el fin de eliminar las células o desechos de la solución. Transfiera todo menos un mililitro del lentivirus que contiene sobrenadante a un tubo de centrífuga ultra claro para la ultracentrifugación. Después de la ultracentrifugación, aspirar cuidadosamente el virus residual que contiene sobrenadante, añadir suavemente 100 microlitros de DMEM al pellet, y colocar el tubo sobre hielo durante 15 minutos.Al final de la incubación, mezcle la solución suavemente y aliquot la solución de lentivirus en tubos estériles pre-refrigerados para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. A continuación, determine el título del lentivirus por RT-PCR cuantitativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la generación y expansión de células CAR-T, active de una a dos veces 10 a las seis células mononucleares de sangre periférica en un mililitro de medio celular CAR-T con un número igual de microperlas recubiertas CD3/CD28 en un pozo de una placa de 24 pozos en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.Las siguientes dos mañanas, mezclar un microlitro de agente potenciador de transducción con las células seguido de la adición de lentivirus en una multiplicidad de infección de cinco a uno. Monitorear el crecimiento de la célula T cada dos o tres días agregando medio de células CAR-T frescos según sea necesario para mantener las células en una o dos veces 10 a las seis células por concentración de mililitro. Para detectar la expresión de la célula T CAR por citometría de flujo, transfiera tres veces 10 a la quinta célula CAR y células T no transducidas en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros.Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 200 microlitros de tampón FACS complementado con 1%suero humano. Divida cada muestra de célula en 100 alícuotas de microlitros en tubos individuales de poliestireno FACS de cinco mililitros sobre hielo. Después de cinco minutos, agregue un microlitro de fragmentos FAB2 biotinilados de FAB2 antiratón de cabra FAB2 a un tubo de cada tipo de célula y dos microlitros de anticuerpo antietiquetado con etiqueta PE al otro tubo de cada tipo de célula con una mezcla completa.Después de 30 minutos sobre hielo, lave las células con tres mililitros de tampón FACS fresco y después de centrifugar decantar los sobrenadantes. Resuspender los pellets en el sobrenadante restante y añadir dos microlitros de APC anti-CD3 y dos microlitros de 7-AAD a cada tubo. Añadir un microlitro de Streptavidin con etiqueta de PE con una breve mezcla en el tubo manchado con anticuerpos anti-FAB2 e incubar todos los tubos sobre hielo durante 30 minutos.Al final de la incubación, analice las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar que gating las células T por dispersión hacia delante contra dispersión lateral y expresión CD3 frente a 7-AAD. Para un ensayo de potencia de citolisis en tiempo real, agregue de 50 a 100 microlitros del medio de cultivo celular objetivo a cada pozo de una placa electrónica y mida la impedancia de fondo en un instrumento de analizador celular. Detecte las células cancerosas diana de la placa de cultivo usando trippsina.Lavar las células en 15 mililitros de cultivo fresco medio y centrífuga. Resuspender el pellet de células cancerosas en cinco mililitros de medio fresco para contar y ajustar la densidad celular a la concentración celular objetivo adecuada. Agregue las celdas al número adecuado de pozos y deje la placa electrónica durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten uniformemente en la parte inferior de los pozos.Al final del período de equilibrio, coloque la placa en el analizador de células en tiempo real e inicie la medición de la impedancia automáticamente cada 15 minutos durante la noche. La adhesión y proliferación de las células de destino se puede rastrear en tiempo real. A la mañana siguiente, diluir el efector CAR y controlar las células T a la concentración adecuada en tubos individuales y eliminar 50 a 100 microlitros de cada pozo de la placa electrónica para que el volumen final en cada pozo sea de 100 microlitros.A continuación, sembrar el efector y controlar las células T en los pozos apropiados en las proporciones de efector a objetivo adecuadas en 100 microlitros de medio por pozo. A continuación, equilibre la placa electrónica durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de devolver la placa al sistema analizador celular. Para medir la eficacia de la muerte mediada por células T de las células cancerosas objetivo, monitoree la matanza mediada por CAR-T durante 96 horas.Alrededor del 50% de las células CAR-T se tiñen positivamente para el anticuerpo de fragmento variable de cadena anti-única que indica la expresión de CAR en aproximadamente el 50% de las células T. En este experimento representativo, se utilizó una relación de efector a destino de 10 a uno para todos los grupos. Las células Raji solamente y las células T CD22-CAR trataron las células Raji mostraron una matanza significativa en comparación con la célula T de control solamente y los grupos de células Auto-T de Mock.En este experimento, sólo las células CD47-CAR-T fueron eficaces para matar las células cancerosas pancreáticas. Además, la señal de impedancia de las células CD47-CAR-T por sí sola estaba ligeramente por encima de la señal de índice de celda medida en los pozos medios solos, lo que indica que la señal de impedancia resultante de las células de suspensión como las células CAR-T es mínima y no contribuye a la señal de impedancia general cuando las células CAR-T se agregan a las células cancerosas de destino. En particular, se observó que el dominio coestimulatorio de la GITR era más eficaz para mejorar la matanza de células CAR-T contra las células diana positivas del receptor del factor de crecimiento epitelial en comparación con las construcciones originales de la CAR sin el dominio GITR.El medio de los pozos de placas electrónicas se puede recoger para analizar el perfil de citoquinas en los puntos de tiempo, ya sea durante o después del ensayo de acuerdo con las necesidades del experimento. En general, xCELLigence ha mejorado la eficiencia de la evaluación de la potencia de diversas inmunoterapias que van desde los activadores de células T bi-específicas y los virus oncolíticos hasta los inhibidores del punto de control inmune en las terapias combinadas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...