Name: a tripeptide-stabilized nanoemulsion of oleic acid
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00
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Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.

1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II)
<ol><li>Attivazione di cisplatino<ol>
<li>Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C.</li>
		<li>Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l'avanzamento della reazione.</li>
		<li>Per determinare se la reazione di attivazione è stata complet...

Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l'aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni ...

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all'interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1, 5,6. Materiali biologicamente derivate, quali proteine e peptidi, hanno da tempo riconosciute come promettente componenti di nanostrutture multifunzionale a causa della loro sequenza flessibilità7,8. Peptidi assemblarsi in architetture supramolecolari altamente ordinate formando elicoidale nastri9,10, impalcature fibroso11,12e molti altri, aprendo così la strada alla costruzione nanostrutture ibride basate su biomolecole utilizzando un ascendente approccio13.
Peptidi sono stati esplorati per applicazioni in medicina e biotecnologia, soprattutto per la terapia anticancro14 e malattie cardiovascolari15 anche per quanto riguarda lo sviluppo antibiotico16,17, metabolica disturbi18e infezioni19. Ci sono oltre un centinaio di piccole-peptide terapeutica in fase di test clinici20. Peptidi sono facili da modificare e veloce di sintetizzare a basso costo. Inoltre, sono biodegradabili, che facilita notevolmente il loro applicazioni biologiche e farmaceutiche21,22. L'utilizzo di peptidi come componenti strutturali comprende l'ingegneria di nanoparticelle reattive, peptidici e idrogel depositi per rilascio controllato23,24,25,26 , 27, biosensori peptidici28,29,30,31o dispositivi bio-elettroniche32,33,34. Cosa importante, sono stati trovati anche brevi peptidi con due o tre residui dell'amminoacido che includono fenilalanina per guidare l'auto-assemblaggio elabora35,36,37 e creare emulsioni stabilizzate38 .
Farmaci a base di platino, a causa della loro alta efficacia, sono utilizzati in molti regimi di trattamento del cancro, sia da solo che in combinazione con altri agenti39,40. Composti del platino inducono danni al DNA formando legami incrociati monoadducts e intrastrand o interstrand. Le lesioni di Pt-DNA sono riconosciute dal macchinario cellulare e, se non riparato, portano all'apoptosi cellulare. Il meccanismo più importante, che contribuisce alla morte della cellula tumorale, PT è l'inibizione della trascrizione del DNA41,42. Tuttavia, i benefici della terapia di platino sono diminuiti di tossicità sistemica di PT che provoca gravi effetti collaterali. Questo porta a più basso dosaggio clinica di PT43, che si traduce spesso in concentrazioni sub-terapeutiche di platino raggiungendo il DNA. Di conseguenza, la riparazione del DNA che segue contribuisce alla sopravvivenza della cellula tumorale e l'acquisizione di resistenza Pt. La chemio-resistenza del platino è un problema importante nella terapia anticancro e la causa principale del trattamento fallimento44,45.
Abbiamo sviluppato una stabile irraggiungibili che incapsula l'agente PT al fine di fornire un effetto di schermatura nella circolazione sistemica e per diminuire gli effetti collaterali indotti da Pt II. Il sistema si basa su un nucleo di acido oleico acids-Pt(II) stabilizzato con un tripeptide KYF per formare una Nanoemulsione (KYF-Pt-NE)46. Gli elementi costitutivi di KYF-Pt-NE, gli aminoacidi del tripeptide, come pure l'acido oleico, hanno lo status di generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) con la Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE viene preparato utilizzando un metodo di nanoprecipitazione47. In breve, il coniugato acids-Pt(II) oleico è disciolto in un solvente organico e quindi aggiunto goccia a goccia di una soluzione acquosa di KYF (Figura 1) a 37 ° C. La soluzione è agitata per diverse ore consentire l'auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE. La Nanoemulsione è concentrata in 10 kDa concentratori centrifughi e lavati tre volte con acqua. La modificazione chimica di KYF con un fluoroforo permette la sintesi di fluorescente FITC-KYF-Pt-NE adatto per imaging biomedico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium 
			tetrafluoroborate (TBTU)</td>
			<td>ANASPEC INC.:</td>
			<td>AS-20376</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber confocal dish</td>
			<td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-bromohexanoic acid</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>24477</td>
			<td>Click modification for peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780</td>
			<td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td>
			<td></td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D11901</td>
			<td>water filtration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUCHI rotavapor R-3</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Z568090</td>
			<td>For solvent removal and sample drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5811F</td>
			<td>For platinum complex separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>19376-0050</td>
			<td>in vitro tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP70</td>
			<td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td>
			<td></td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-134</td>
			<td>For warming up media for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Brookhaven Instrument Corporation</td>
			<td></td>
			<td>For nanoparticle size measurments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1978</td>
			<td>ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>00493</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01914</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H59730</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Fisher</td>
			<td></td>
			<td>incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure syringe pump</td>
			<td>New Era</td>
			<td>1010-US</td>
			<td>For platinum complex addition in nanoparticle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>For sample stirring and heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-18821 AF647</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>005027</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ninhydrin 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10409</td>
			<td>Kaiser test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01421</td>
			<td>For platinum complex synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OV90</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11732</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A92500</td>
			<td>Kaiser test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A248-25</td>
			<td>negative stain for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine 99%</td>
			<td>BTC</td>
			<td>219260-2.5L</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum AAS standard soultion</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>88086</td>
			<td>1000ug/ml for calibration curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl bromide 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L10595</td>
			<td>For alkyne modification of fluoresceine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific biological cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific Fisher</td>
			<td>1385</td>
			<td>Bio-hood for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-Cleaning Vacuum System</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2028</td>
			<td>Vacuum pump for rotavapor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>19768-0250</td>
			<td>Cisplatin activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S313-1</td>
			<td>For platinum complex synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin (II) chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208256</td>
			<td>Test for Platinum presence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOV21G</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11730</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid 99% (TFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06374</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane (TIPS)</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01966</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranine powder 40%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25328A</td>
			<td>For alkyne modification of fluoresceine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>For Nanoparticle wash and condensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-462</td>
			<td>For cell culture monitoring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tripeptide-stabilized nanoemulsion of oleic acid

Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l'imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L'auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell'aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.

Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indi...

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A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Data l'ampia gamma di brevi sequenze peptidiche, questo metodo può essere esteso a molti altri progetti di nanoparticelle. La modifica peptidica può rendere il sistema adatto a scopi diagnostici. L'incapsulamento del platino anti-cancro in farmaci con agente stabilizzante biodegradabile a bassa tossicità è altamente rilevante per le applicazioni farmaceutiche.Gli studi preliminari in vivo con cancro alle ovaie sono promettenti e saranno ulteriormente studiati. Per iniziare, sospendere 50 milligrammi di cisplatino in quattro millilitri di acqua ultra pura a 60 gradi Celsius. Aggiungere la soluzione di nitrato d'argento per quanto riguarda la goccia alla soluzione di cisplatino e mescolare la miscela a 300-400 giri/min per due ore a 60 gradi Celsius al buio.Successivamente, utilizzare il 10% in peso acido cloridrico per confermare che non ci sono ioni d'argento liberi in soluzione. Se non si forma cloruro d'argento aggiuntivo all'aggiunta di acido cloridrico, centrifugare la miscela a 3.220 volte la gravità per 10 minuti. Decantare il supernatante e filtrarlo attraverso un filtro siringa da 0,2 micrometri.Quindi, testare il filtrato per il platino applicando da due a tre gocce a 10 due cristalli di cloruro. Il platino è presente se la sospensione diventa marrone scuro o arancione. Successivamente, aggiungere 13,3 milligrammi di idrossido di sodio in un millilitro d'acqua in sospensione di 94,2 milligrammi di acido oleico in tre millilitri di acqua a 60 gradi Celsius.Mescolare la miscela per due ore a 60 gradi Celsius. Quindi, spegnere il fuoco e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 16-24 ore per ottenere il prodotto grezzo come precipitante oleoso giallo-marrone. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 volte la gravità per 10 minuti e rimuovere il supernatante.Asciugare i prodotti su un evaporatore rotativo a 25 gradi Celsius. Sospendere il prodotto grezzo in cinque millilitri di acetonitrile vortice e recuperando il prodotto mediante centrifugazione. Ripetere questo processo di lavaggio almeno altre due tre volte per ottenere il coniugato puro di acido oleico platino II come solido giallo pallido.In primo luogo, immergere 5,7 grammi di resina Wang funzionalizzata A L-fenilalanina protetta da Fmoc in 25 millilitri di dimetilformamide per un'ora. Quindi, immergere la resina in 15 millilitri di piperidina al 20% in DMF per cinque minuti mentre si trema a 80 giri/min per de-proteggere l'ammina. Scolare la resina e ripetere la deprotezione per 20 minuti.Lavare la resina con DMF e alcol isopropile in seguito. Una volta confermata la deprotezione, aggiungere L-tirosina TBTU e DIPEA protetti da Fmoc e agitare la miscela per 16-24 ore per eseguire l'accoppiamento. Lavare la resina con DMF e alcol isopropile.Eseguire il test Kaiser e continuare con la protezione e il lavaggio come descritto in precedenza. Coppia e de-proteggere Fmoc protetto lisina allo stesso modo. Lavare la resina con DMF, IPA, metanolo, diclorometano e etere dietile in seguito.Mettere da parte un grammo di resina portante KYF per la modifica FITC. Immergere la resina rimanente in acido trifluoroacetico al 95%. 2,5% di triisopropilsilano e 2,5% di acqua per tre ore per scindere il tripeptide dalla resina.Precipitare il peptide grezzo con etere dietile raffreddato a 20 gradi Celsius. Lavare il precipitato tre volte con centrifugazione in porzioni da 30 a 40 millilitri di etere dietile freddo e asciugarlo sotto vuoto. Quindi, mescolare il grammo rimanente di resina KYF con 120,1 milligrammi di acido 6-acetoesanoico in 30 millilitri di DMF con TBTU e DIPEA.Agitare la miscela per 16-24 ore a temperatura ambiente per ottenere il tripeptide modificato azide. Quindi, combinare 253 milligrammi di questa resina con 3,78 milligrammi di rame solido(I)ioduro 71,9 milligrammi di propargil florisean e 2,24 milligrammi di DIPEA. Lasciare reagire la miscela tremando per 24 ore.Quindi, lavare accuratamente la resina portante KYF modificata FITC. Scindere il KYF modificato FITC dalla resina e purificarlo allo stesso modo del tripeptide non modificato. Per iniziare a preparare la nanoemoulsione, sciogliere 10 milligrammi dell'acido oleico platino II coniugato in 1,5 millilitri di IPA.Disegna questa soluzione in una siringa da 5 millilitri, attacca un ago calibro 20 e monta la siringa su una pompa per siringhe sopra l'area di reazione. Impostare la pompa della siringa su 0,1 millilitri al minuto. Per una nanoemulsione con KYF modificato FITC, sciogliere un milligrammo di KYF modificato FITC e un milligrammo di KYF non modificato in 20 millilitri di acqua.Per una nanoemulsione con KYF non modificato, sciogliere invece due milligrammi di KYF in 20 millilitri di acqua. Riscaldare la soluzione KYF modificata o non modificata FITC a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che la soluzione KYF si mescola a circa 400 giri/min e che la siringa sia allineata alla soluzione.Quindi, avviare la pompa della siringa per iniziare ad aggiungere l'acido oleico platino due coniugati goccia saggio. Una volta aggiunto il coniugato, ridurre la velocità di agitazione a 150 giri/min e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Continuare a mescolarlo per 16-24 ore.Quindi, concentrare la nanoemulzione in un'unità filtrante centrifuga da 10.000 Dalton. Lavare la nanoemulsione in un'unità filtrante centrifuga tre volte con quattro porzioni milliliter di acqua ultrapura. E poi conservarlo come una soluzione acquosa a quattro gradi Celsius.Il prodotto finale è opalescente per le nanoparticelle KYF e fluorescente per nanoparticelle modificate fitc. Le goccioline in una nanoemulsione preparata con KYF non modificato erano sferiche, ben disperse e di dimensioni relativamente uniformi. Basati su immagini di microscopia elettronica a trasmissione, i nuclei avevano un diametro di circa 107 nanometri.La nanoemulsione modificata dal FITC, che appare qui in verde, potrebbe entrare nelle cellule di varie linee cellulari tumorali ovariane. Mentre il diametro idrodinamico di entrambe le formulazioni è aumentato durante quattro mesi di stoccaggio in acqua, le dimensioni complessive sono state preservate. Inoltre, dopo una giornata di incubazione nel siero bovino fetale non è stata osservata alcuna opsonizzazione dell'emulsione.Il rilascio di platino dall'emulsione è stato più lento a pH 7.4 con solo il 20,8% del platino rilasciato dopo quattro ore. Il rilascio di platino accelerò con la diminuzione del pH. La nanoemulsione rivestita di KYF contenente platino ha ridotto la vitalità di queste linee cellulari tumorali ovariane in misura molto maggiore di quella raggiunta dal carboplatino, l'analogo clinicamente rilevante.La nanoemulsione ha anche mostrato una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto alla cisplatino in cinque delle sei linee cellulari. La nanoemulsione rivestita di KYF ha costantemente indotto una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto al solo coniugato di platino II dell'acido oleico. Questo è un metodo semplice ed efficiente per incapsulare le terapie idrofobiche all'interno dell'impalcatura della nanoparticella di base tripeptide.I peptidi corti sono biodegradabili e hanno una bassa tossicità, che è significativa per la medicina e la biotecnologia. Eseguire questa procedura sotto la cappa dei fumi per evitare l'esposizione a solventi organici. L'acido oleico di platino e le nanoemulsioni di platino KYF hanno proprietà anti-cancro e quindi devono essere maneggiate con particolare cura.Questo metodo è semplice in termini di bassa attività filabilator e attrezzature, tuttavia si basa sulla corretta applicazione della strategia di sintesi e dei concetti chimici sottostanti. Il nostro metodo può essere esteso per fornire altre piccole molecole di farmaci. Il nucleo della nanoparticella è costituito da acido oleico e quindi è adatto per l'incapsulamento di agenti idrofobici.

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