Name: a tripeptide-stabilized nanoemulsion of oleic acid
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00
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Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.

1. síntesis del Acids–Platinum(II) ácido oleico conjugado
<ol><li>Activación de cisplatino<ol>
<li>Suspender (0.167 mmol) de 50 mg de cisplatino, en 4 mL de agua (por ejemplo, nanopure) a 60 ° C.</li>
		<li>Añadir gota a gota 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 en 0,5 mL de agua a la solución de cisplatino y revuelva la reacción durante al menos 2 h a 60 ° C. El precipitado blanco de AgCl forma indicando el progreso de la reacción.</li>
		<li>Para determinar si la reacción de activación se ha completa...

Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condicion...

En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1, 5,6. Materiales derivados biológicamente, tales como proteínas y péptidos, durante mucho tiempo han sido reconocidos como componentes prometedores de nanoestructuras multifuncionales debido a su flexibilidad de secuencia7,8. Péptidos, uno mismo-montar en arquitecturas supramoleculares altamente ordenadas formación helicoidal cintas9,10, andamios fibroso11,12y muchos más, allanando así el camino para la construcción Nanoestructuras basados en biomoléculas híbrido utilizando un fondo enfoque13.
Péptidos se han explorado para aplicaciones en medicina y biotecnología, especialmente para la terapia contra el cáncer14 y enfermedades cardiovasculares15 así como en cuanto a desarrollo de antibiótico16,17, metabólicos trastornos18y19de las infecciones. Hay más de un centenar de pequeños péptidos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos20. Péptidos son fáciles de modificar y a sintetizar a bajo costo. Además, son biodegradables, que facilita sus aplicaciones biológicas y farmacéuticas21,22. El uso de péptidos como componentes estructurales incluye la ingeniería de nanopartículas basada en péptidos, sensibles y depósitos de hidrogel para liberación controlada23,24,25,26 , 27, biosensores basados en péptidos28,29,30,31o dispositivos bio-electrónicos32,33,34. Lo importante, se encontraron péptidos cortos incluso con dos o tres residuos de aminoácidos que incluyen fenilalanina para guiar a la uno mismo-Asamblea35,36,37 los procesos y crear emulsiones estabilizadas38 .
Fármacos basados en platino, debido a su alta eficacia, se utilizan en muchos regimenes de tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con otros agentes39,40. Compuestos de platino inducen daño en el ADN por formación de enlaces cruzados de monoadducts e intrafilamentoso o interstrand. Las lesiones de Pt-ADN son reconocidas por la maquinaria celular y, si no se repara, conducen a la apoptosis celular. El mecanismo más importante, por que Pt(II) contribuye a la muerte de la célula de cáncer, es la inhibición de DNA transcripción41,42. Sin embargo, los beneficios de la terapia de platino son disminuidos por la toxicidad sistémica de Pt(II) que provoca efectos secundarios graves. Esto conduce a baja dosificación clínicos de Pt(II)43, que a menudo resulta en concentraciones subterapéuticas de platino alcanzando el ADN. Como consecuencia, la reparación del ADN que sigue contribuye a la supervivencia de la célula de cáncer y adquisición de resistencia de Pt(II). La quimio-resistencia del platino es un problema importante en la terapia contra el cáncer y la principal causa de fracaso de tratamiento44,45.
Hemos desarrollado un estable nanosistemas que encapsula al agente Pt(II) para proporcionar un efecto protector en la circulación sistémica y a disminuir los efectos secundarios inducidos por el Pt II. El sistema se basa en un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) estabilizado con un tripéptido KYF para formar una nanoemulsión (KYF-Pt-NE)46. Los bloques de edificio de KYF-Pt-NE, los aminoácidos de la tripéptido así como el ácido oleico, poseen el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) con alimentos y drogas (FDA). KYF-Pt-NE se prepara utilizando un método de nanoprecipitation47. En Resumen, el acids-Pt(II) oleico conjugado es disuelto en un solvente orgánico y luego se agrega gota a gota a una solución acuosa de KYF (figura 1) a 37 ° C. La solución se agita durante varias horas permitir que uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-ne La nanoemulsión está concentrada en concentradores centrífugos de 10 kDa y lavaron tres veces con agua. La modificación química de KYF con un fluoróforo permite la síntesis de FITC-KYF-Pt-NE fluorescente adecuado para la proyección de imagen biomédica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium 
			tetrafluoroborate (TBTU)</td>
			<td>ANASPEC INC.:</td>
			<td>AS-20376</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well chamber confocal dish</td>
			<td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-bromohexanoic acid</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>24477</td>
			<td>Click modification for peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780</td>
			<td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td>
			<td></td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D11901</td>
			<td>water filtration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUCHI rotavapor R-3</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Z568090</td>
			<td>For solvent removal and sample drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5811F</td>
			<td>For platinum complex separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>19376-0050</td>
			<td>in vitro tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP70</td>
			<td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td>
			<td></td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-134</td>
			<td>For warming up media for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Brookhaven Instrument Corporation</td>
			<td></td>
			<td>For nanoparticle size measurments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1978</td>
			<td>ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>00493</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01914</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H59730</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Fisher</td>
			<td></td>
			<td>incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure syringe pump</td>
			<td>New Era</td>
			<td>1010-US</td>
			<td>For platinum complex addition in nanoparticle synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate/stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>For sample stirring and heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-18821 AF647</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>005027</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ninhydrin 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10409</td>
			<td>Kaiser test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01421</td>
			<td>For platinum complex synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OV90</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11732</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>For cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A92500</td>
			<td>Kaiser test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A248-25</td>
			<td>negative stain for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine 99%</td>
			<td>BTC</td>
			<td>219260-2.5L</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum AAS standard soultion</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>88086</td>
			<td>1000ug/ml for calibration curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propargyl bromide 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L10595</td>
			<td>For alkyne modification of fluoresceine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific biological cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific Fisher</td>
			<td>1385</td>
			<td>Bio-hood for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-Cleaning Vacuum System</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2028</td>
			<td>Vacuum pump for rotavapor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>19768-0250</td>
			<td>Cisplatin activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S313-1</td>
			<td>For platinum complex synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin (II) chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208256</td>
			<td>Test for Platinum presence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOV21G</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11730</td>
			<td>Ovarian cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid 99% (TFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06374</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane (TIPS)</td>
			<td>Chem-Impex INT&#8217;L INC.</td>
			<td>01966</td>
			<td>SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranine powder 40%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25328A</td>
			<td>For alkyne modification of fluoresceine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>For Nanoparticle wash and condensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Inverted Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-462</td>
			<td>For cell culture monitoring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tripeptide-stabilized nanoemulsion of oleic acid

Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.

Imagen de TEM representante de KYF-Pt-NE preparado mediante este protocolo se muestra en la figura 2A. KYF-Pt-NEs son esféricos en morfología, bien dispersa y uniforme en tamaño. El diámetro del núcleo de KYF-Pt-NEs, medido directamente en tres imágenes TEM con un mínimo de 200 medidas hecho, es 107 ± 27 nm. Diámetro hidrodinámico de KYF-Pt-NE, analizada mediante espectroscopia de luz dinámica (DLS), fue encontrado para ser 240 nm con un índice de...

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A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Dada la amplia gama de secuencias de péptidos cortos, este método se puede extender a muchos otros diseños de nanopartículas. La modificación del péptido puede hacer que el sistema sea adecuado para fines de diagnóstico. Encapsular el platino anticascológico en medicamentos con agente estabilizador biodegradable de baja toxicidad es muy relevante para aplicaciones farmacéuticas.Los estudios preliminares en vivo con cáncer de ovario son prometedores y se investigarán más a fondo. Para empezar, suspende 50 miligramos de cisplatino en cuatro mililitros de agua ultrapura a 60 grados centígrados. Agregue la solución de nitrato de plata a la solución de cisplatino y revuelva la mezcla a 300 a 400 RPM durante dos horas a 60 grados centígrados en la oscuridad.Después de eso, utilice 10%en peso ácido clorhídrico para confirmar que no hay iones de plata libres en la solución. Si no se forma cloruro de plata adicional al agregar ácido clorhídrico, centrifugar la mezcla a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros.A continuación, pruebe el filtrado en busca de platino aplicando de dos a tres gotas a 10 dos cristales de cloruro. El platino está presente si la suspensión se vuelve marrón oscuro o naranja. A continuación, añadir 13,3 miligramos de hidróxido de sodio en un mililitro de agua en 94,2 miligramos de suspensión de ácido oleico en tres mililitros de agua a 60 grados centígrados.Revuelva la mezcla durante dos horas a 60 grados centígrados. Luego, apague el fuego y continúe revolviendo a temperatura ambiente durante 16 a 24 horas para obtener el producto crudo como un precipitante aceitoso, de color amarillo-marrón. Centrifugar la mezcla de reacción a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos, y retire el sobrenadante.Seque los productos en un evaporador rotatorio a 25 grados centígrados. Suspenda el producto crudo en cinco mililitros de acetonitrilo mediante vórtice y recuperando el producto por centrifugación. Repita este proceso de lavado al menos dos tres veces más para obtener el conjugado puro de ácido oleico platino II como un sólido amarillo pálido.En primer lugar, remojar 5,7 gramos de L-fenilalanina protegida Fmoc funcionalizada resina Wang en 25 mililitros de dimetilformamida durante una hora. Luego, remoje la resina en 15 mililitros de 20%piperidina en DMF durante cinco minutos mientras agita a 80 RPM para des-proteger la amina. Escurrir la resina y repetir la desprotección durante 20 minutos.Lavar la resina con DMF y alcohol isopropílico después. Una vez confirmada la desprotección, añadir la L-tirosina protegida por Fmoc TBTU y DIPEA y agitar la mezcla durante 16 a 24 horas para realizar el acoplamiento. Lave la resina con DMF y alcohol isopropílico.Realice la prueba de Kaiser y continúe con la desprotección y lave como se describió anteriormente. Pareja y desprotege la lisina protegida Fmoc de la misma manera. Lave la resina con DMF, IPA, metanol, diclorometano y éter dietílico después.Deje a un lado un gramo de resina con rodamientos KYF para modificar FITC. Remoje la resina restante en 95%ácido trifluoroacético. 2.5%triisopropylsilane y 2.5% agua durante tres horas para cortar el tripéptido de la resina.Precipitar el péptido crudo con éter dietílico enfriado a 20 grados Celsius. Lavar el precipitado tres veces por centrifugación en porciones de 30 a 40 mililitros de éter dietílico frío y secarlo al vacío. A continuación, mezclar el gramo restante de resina KYF con 120,1 miligramos de ácido 6-acetohexanoico en 30 mililitros de DMF con TBTU y DIPEA.Agitar la mezcla durante 16 a 24 horas a temperatura ambiente para obtener el tripéptido modificado de axida. A continuación, combinar 253 miligramos de esta resina con 3,78 miligramos de cobre sólido (I)yoduro 71,9 miligramos de propargyl florisean y 2,24 miligramos de DIPEA. Deje que la mezcla reaccione mientras agita durante 24 horas.A continuación, lave a fondo la resina de cojinete KYF modificada de FITC. Corte el KYF modificado FITC de la resina y purifique de la misma manera que el tripéptido no modificado. Para comenzar a preparar la nanoemoulsión, disolver 10 miligramos del ácido oleico platino II conjugado en 1,5 mililitros de IPA.Dibuje esta solución en una jeringa de 5 mililitros, coloque una aguja de calibre 20 y monte la jeringa en una bomba de jeringa sobre el área de reacción. Ajuste la bomba de la jeringa a 0,1 mililitros por minuto. Para una nanoemulsión con KYF modificado por FITC, disuelva un miligramo de KYF modificado por FITC y un miligramo de KYF sin modificar en 20 mililitros de agua.Para una nanoemulsión con KYF no modificado, disolver en su lugar dos miligramos de KYF en 20 mililitros de agua. Caliente la solución KYF modificada o sin modificar de FITC a 37 grados centígrados. Asegúrese de que la solución KYF esté agitando a unas 400 RPM y de que la jeringa esté alineada con la solución.A continuación, inicie la bomba de la jeringa para comenzar a añadir el ácido oleico platino dos gotas conjugadas sabias. Una vez añadido el conjugado, reduzca la velocidad de agitación a 150 RPM y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Continúe revolviéndolo durante 16 a 24 horas.A continuación, concentre el nanoemultiión en una unidad de filtro centrífugo de 10.000 Daltons. Lave la nanoemulsión en una unidad de filtro centrífuga tres veces con cuatro porciones de mililitro de agua ultrapura. Y luego almacenarlo como una solución acuosa a cuatro grados Centígrados.El producto final es opalescente para nanopartículas KYF y fluorescentes para nanopartículas modificadas por FITC. Las gotas en una nanoemulsión preparada con KYF no modificado eran esféricas, bien dispersas y de tamaño relativamente uniforme. Basados en imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los núcleos tenían unos 107 nanómetros de diámetro.La nanoemulsión modificada por FITC, que aparece aquí en verde, podría entrar en células de varias líneas celulares de cáncer de ovario. Mientras que el diámetro hidrodinámico de ambas formulaciones aumentó durante cuatro meses de almacenamiento en agua, las dimensiones totales se conservaron. Además, no se observó ninguna opsonización de la emulsión después de un día de incubación en un 20% de suero bovino fetal.La liberación de platino de la emulsión fue más lenta a pH 7,4 con sólo el 20,8% del platino liberado después de cuatro horas. La liberación de platino se aceleró a medida que el pH disminuía. La nanoemulsión recubierta de KYF con platino redujo la viabilidad de estas líneas celulares de cáncer de ovario en un grado mucho mayor de lo que se logró con la carboplatina, el análogo clínicamente relevante.La nanoemulsión también mostró una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el cisplatino en cinco de las seis líneas celulares. La nanoemulsión recubierta con KYF indujo consistentemente una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el ácido oleico platino II conjugado solo. Este es un método simple y eficiente para encapsular terapias hidrofóbicas dentro del andamio de nanopartículas de base de tripéptidos.Los péptidos cortos son biodegradables y tienen baja toxicidad, lo que es significativo para la medicina y la biotecnología. Realice este procedimiento bajo la campana de humos para evitar la exposición a disolventes orgánicos. El ácido oleico platino y las nanoemulsiones de platino KYF tienen propiedades contra el cáncer y, por lo tanto, deben manejarse con especial cuidado.Este método es simple en términos de baja actividad de filabilator y equipos, sin embargo se basa en la correcta aplicación de la estrategia de síntesis, y los conceptos químicos subyacentes. Nuestro método se puede extender para entregar otras moléculas de fármacos pequeños. El núcleo de nanopartículas consiste en ácido oleico y por lo tanto es adecuado para la encapsulación de agentes hidrófobos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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