Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我们要感谢 j. p. chanton、j. e. kostka 和 m. m. kulton 协助收集泥炭样品。这项工作的一部分是在生物和环境研究办公室赞助的 doe 科学办公室用户设施----环境分子科学实验室进行的。pnnl 由 battelle 根据 de-ac05-76r01830 合同为指定经营实体运营。这项工作得到了美国能源部、科学办公室和生物与环境研究办公室的支持 (赠款: de-ac05-00or22725、de-sc0004632、desc0010580、de-sc0012088 和 de-sc0014416)。

1. 从土壤、沉积物或泥炭中顺序提取有机物
<ol><li>通过取心收集土壤、沉积物或泥炭, 并根据所测试的假设 (例如深度) 划分岩心。将样品存放在聚四氟乙烯涂层容器中, 并在分析前冻结在-80°c 进行储存。 注: 此协议需要大约25毫克 c。对于泥炭 (通常为 45% c), 需要50毫克的干泥炭。根据 c 含量 (高达5克) 的不同, 矿物或森林高地土壤等低有机样品可能需要更多的样品。由于用有机溶?...

<ol>
	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unambiguous+Metabolite+Identification+in+High-throughput+Metabolomics+by+Hybrid+1DNMR/ESI+MS+Approach.">Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).</li><li>Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MPLEx+Protocol+for+Multi-omic+Analyses+of+Soil+Samples.">The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples.</a> J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. 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用于表征代谢物和蛋白质组的单吞吐量、全耦合分析流提供了对 c 循环在复杂生态系统中发生的途径的洞察。土壤和泥炭是异质矩阵, 因此, 这种方法的关键步骤之一发生在最早的步骤, 以确保启动泥炭或土壤材料是高度均匀的。最好是研磨样品和聚集体可以降低提取效率。对于 c 含量低、矿物含量高的聚集土壤和土壤来说, 这是一个特别的问题, 可能需要使用不锈钢球磨床进行充分的均质化。由于...

在全球范围内, 湿地估计含有 529 pg 的碳 (c), 主要是埋在泥炭矿床1中的有机 c。目前, 这类泥炭地起到了净 c 汇的作用, 仅在北美就有 29 tg c-1。然而, 排水、火灾、干旱和温度升高等环境干扰可以通过增加有机物分解来抵消这种 c 汇,从而通过温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产1,2。如果温度升高或干燥机条件刺激微生物更快地分解 c, 气候变化可能会导致 c 损失。另外, 较高的温度和空气二氧化碳浓度可能会刺激初级生产, 以将更多的 co2 作为有机碳 (oc) 来固存.然后将 oc 分解为 co2 和 ch4 的程度和速度取决于电子供体基板、电子受体的可用性以及介导转型。在许多情况下, 这些机制的特点并不好, 因此它们对环境扰动的反应没有得到很好的限制, 气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的净结果仍然不清楚。
天然有机物 (nom) 的复杂性使得即使是识别 nom 混合物中存在的有机化合物也变得困难。最近的进展大大提高了我们对传统上被视为顽抗的腐殖质或黄腐化合物的化合物的特性的能力, 3,4,5。我们现在了解到, 这些化合物中的许多实际上是微生物可用的, 如果一个合适的终端电子受体 (tea) 可用6,7, 可能会被分解。计算化合物的碳 (nosc) 的名义氧化状态为预测分解潜力和所需的 tea 的能量产率提供了一个指标。然而, 它需要分子水平的表征的有机物 7.nosc通过以下等式7计算: nosc =-(-z + 4 (#C) + (#H)-3 (#O) + 5 (#P)-2 (#S))/(#C)) + 4, 其中 z 为净电荷。nosc 与热力学驱动力8相关, 其中具有较高的 nosc 的化合物更容易降解, 而具有较低的 nosc 的化合物需要越来越高的能量 tea 才能减少。nosc 小于-2 的化合物需要高能量产生的 tea, 如 o2、硝酸盐或锰iv, 并且不能通过通常发生的较低的能量产生的 tea (如fe iii或 thatif7) 而降解.这是一个重要的考虑因素, 在湿地的水淹缺氧条件下发现, 那里的 o2和其他高能量产生的 tea 很少9 , 因此, 在这些条件下, 低 nosc 化合物的降解是热力学上的限制。环境扰动可以通过影响 o2 (最有能量的电子受体) 的水文变化、有机基板的变化和初级可获得的电子受体来影响生态系统的热力学状态生产, 并在较小的范围内由温度。湿地系统中温度影响的一个重要例子是在同质乙酰发生 (即二氧化碳和 h2产生的醋酸盐) 和氢养能力甲烷生成 (即, co2 和 h2 的 ch4生产)。在低温下, 同种异体的表现似乎略受欢迎, 而温度较高则有利于ch4生产10。这种温度效应可能对生态系统对气候变化的反应产生重要影响, 因为 ch4 是一种比 co2-11 强得多的温室气体, 因此增加了ch4的产量, 而牺牲了在温度较高的情况下, 二氧化碳可能会对气候变暖产生积极的反馈。
泥炭地通过天然有机质的微生物呼吸产生全球大量的 co2 和 ch46.有机碳基板的 nosc 决定了生产的 co:ch4的相对比例, 这是一个关键参数, 因为 ch4的辐射强迫高于co211,但也因为建模工作已确定该比率为估计泥炭地12中 c 通量的关键参数。在没有二氧化碳以外的终端电子受体的情况下, 电子天平可以看出 nosc > 0 的有机 c 基板会产生 co2:ch 4 >1, 有机 c 与 nosc= 0 产生 co2 和 ch 4 .在等摩尔比和有机 c 与 nosc < 1 将产生 co2:ch 4 < 1 13.oc 在自然生态系统中的分解是由微生物介导的, 因此, 即使特定化合物的降解在热力学上是可行的, 它也受到微生物酶活性的内在限制, 在缺氧条件下, 也受到热力学驱动力 (即nosc)7。到目前为止, 充分表征有机物一直是一项挑战, 因为存在的化合物的多样性需要不同的互补技术来表征其特性。最近的进展弥补了这一差距;使用一套分析技术, 我们可以分析大量的有机化合物提供分子水平的表征, 并在某些情况下量化, 从小质代谢物, 如葡萄糖到800大多杂环。以前, 这样的大型复杂分子会被简单地描述为木质素样或单宁样, 并被认为是顽抗的。分子级表征, 然而, 允许计算 nosc, 即使这些大的复杂分子。这些 nosc 值与热力学驱动力呈线性关系, 可以评估可分解的有机物的质量, 这在许多情况下表明, 这些复杂的分子实际上可能是微生物的即使在湿地普遍存在的缺氧条件下也可以降解。
由于引入 o2可以分解几乎所有自然观测到的 nosc 值的有机物, 因此我们关注的是有机物和微生物蛋白质组学的变化, 这些变化很可能是湿地的主要驱动因素 (即,有限的 o2) 系统。然而, 我们将要讨论的所有技术都可以应用于来自任何生态系统的有机物。通常, 基于光学和荧光分析的批量测量被用来评估有机物质量3,14。然而, 当使用这样的批量测量时, 由于大量的分子被归类为腐殖质或富维生物等泛型术语, 因此会丢失精细的细节。这些类别的定义没有受到很好的限制, 事实上, 由于研究的不同, 不可能进行比较, 这些定义可能会有所不同。此外, 体积测量没有提供计算控制系统的热力学所需的分子细节, 因此无法真正评估有机物质量15。
其它技术, 如傅里叶变换离子回旋共振质谱 (fticr-ms)、核磁共振 (nmr) 光谱、气相色谱质谱 (gc-ms) 和液相色谱质谱 (lc-ms))提供这样的分子级细节。虽然这些技术中的每一种都有其自身的局限性, 但它们也带来了自己的优势, 可以用综合的方法来实现在严格的热力学意义上量化有机物质量所需的精细分子细节.gc-ms 可用于识别可能对 co2 和 ch4 生产有近端影响的关键小代谢物 ( 如葡萄糖、醋酸盐等); 然而, 气相色谱-质谱联用要求对照标准进行验证, 因此仅限于数据库中已经已知的化合物, 无法识别新的化合物。此外, gc-ms 是一种半定性技术, 可以推断相对浓度的变化, 但没有提供计算 gibb 自由能量所需的实际浓度信息。最后, gc-ms 要求分子在分析之前进行衍生化, 这限制了小于 ~ 400 da 的化合物的分辨率, 而挥发性醇在干燥步骤中丢失。
一维 (1d) 1h 液态核磁共振允许对小代谢物 (包括初级小分子量代谢物和醇、醋酸、丙酮、甲酸酯、丙酮酸、琥珀酸等挥发物) 进行高度定量的表征,短链脂肪酸, 以及一系列的碳水化合物, 众所周知的缺失或妥协的 ms 为基础的方法) 和他们的浓度是特别有用的计算热力学参数。然而, 与 gc-ms 一样, 复杂混合物的一维核磁共振需要相对于数据库的标准化, 因此, 仅靠这些化合物并不容易识别, 而这些化合物在复杂的自然和不断变化的生态系统中可能很丰富。此外, 核磁共振比基于 ms 的技术灵敏度较低, 因此, 使用装有氦冷却冷探头的核磁共振系统, 定量代谢产物分析仅达到1μm 以上。一些核磁共振冷探头没有得到广泛的重视, 在较小直径 (< 3 毫米外径) 样品管16中使用时, 可以在存在四能盐浓度的情况下进行环境混合物分析.然而, 核磁共振的另一个复杂因素是, 大量的顺磁性金属和矿物 (例如, 铁和锰含量在 1-3% 以上), 在高地土壤中可以很丰富, 可以扩大光谱特征, 使核磁共振光谱的解释复杂化.使用固相萃取 (spe) 可以通过减少矿物盐和提高光谱质量来辅助解释核磁共振和基于 ms 的代谢组学方法。
直接注射的 fticr-ms 是一种高度敏感的技术, 能够从单个样本中检测到数万种代谢物, 但它不捕获关键的小代谢物, 如醋酸盐、丙酮酸和琥珀酸, 而且众所周知, 很难用于糖和其他碳水化合物17, 也不能提供定量信息。然而, 与其他技术不同的是, fticr-ms 擅长识别新化合物并将其分配为分子式, 因此可识别提供比任何其他描述技术更多分子信息的化合物数量最多的化合物。这是有用的, 因为 fticr-ms (和其他技术) 提供的分子信息可用于计算 nosc, 这与控制某些反应的可能性的热力学驱动力和它们在某些情况下的速率有关。条件7。此外, 通过将 fticr-ms 与 lc 和串联 ms 等分离技术耦合, 可以获得定量的结构信息, 弥补了该技术的一些缺点。lc-ms 可用于识别脂质类化合物和其他代谢物, 这些化合物和代谢物没有得到任何其他方法的充分表征。将 lc fticr-ms 或 lc-ms 与分数收集器耦合, 并收集特定未知的分数, 通过二维 (2d) 液态核磁共振进行结构阐明, 是识别和量化未知化合物的理想情况18 ,19。然而, 这是一个非常耗时的步骤, 可以在需要时使用。单独来看, 这些技术中的每一种都提供了不同的有机物快照, 通过集成它们, 我们可以实现比单独使用任何技术更完整的理解。
虽然热力学的考虑对一个系统中可能发生的转变设置了最终的约束, 但有机物分解是由酶活性控制反应速率的微生物介导的。因此, 要充分了解湿地对有机物分解和最终温室气体 (co2 和 ch 4) 生产的控制, 需要采用综合的组学方法来描述微生物酶的活性, 以及代谢物。在本文中, 我们介绍了一种方法, 用于从单个样本中使用顺序方法实现这种全面分析, 从而实现完全配对的分析。这种方法扩展了代谢物、蛋白质和脂质提取 (mplex) 协议, 其中蛋白质组学与 gc-ms 和 lc-ms20结合, 通过纳入代谢物定量信息来识别小的代谢物、蛋白质和脂类通过nmr 和通过fticr-ms 对较大的次生代谢物进行鉴定. 与 mplex 稍有不同, 我们从水提取开始, 然后对越来越多的非极性溶剂进行顺序萃取。所有提取都是在单个样品上进行的, 在体积有限或难以获得的情况下, 可以保存样品, 并减少通过不同样品基质 (如土壤和泥炭) 中的等价物之间的变化而引入的实验误差, 或储存条件和持续时间的差异。
最后, 通过将 om 分析与微生物群落的蛋白质组学分析相结合, 我们可以建立描述有机物分解途径和转化的代谢网络。这使我们能够通过改变可用的有机基板、电子受体和微生物群落来测试关于系统扰动将如何影响最终 co2 和 ch4 生产的具体假设通过酶催化剂的活性来调节反应。
该方法的总体目标是提供一个单一的吞吐量协议, 用于分析单个样本中的代谢物、脂质和微生物蛋白, 从而为构建代谢网络创建一个完全配对的数据集, 同时约束分析错误.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1067px;" width="1065">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

天然有机物 (nom) 是由数千种有机化合物组成的高度复杂的混合物, 历史上证明很难表征。然而, 为了了解由 nom 分解而产生的温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产的热力学和动力学控制, 该分子水平的特性与微生物结合在一起蛋白质组分析是必要的。此外, 气候和环境变化预计将扰乱自然生态系统, 有可能破坏复杂的相互作用, 影响有机物质底物的供应和进行转变的微生物。要预测环境变化影响的方向和大小, 就必须对有机物、微生物蛋白质组学以及有机物分解的途径和转化进行详细的分子描述。本文介绍了通过直接注射傅里叶变换离子回旋共振质谱法 (fticr-ms)、气相色谱质谱 (gc-ms) 对单个样品进行综合代谢物表征的方法学吞吐量,核磁共振 (nmr) 光谱、液相色谱质谱 (lc-ms) 和蛋白质组学分析。这种方法产生了一个完全配对的数据集, 提高了推断有机物分解路径、由此产生的 co2 和 ch4 产率及其对环境扰动的反应的统计信心。在此基础上, 我们提出了将该方法应用于从泥炭地采集的 nom 样本的结果;但是, 该协议适用于任何 nom 样品 (例如泥炭、森林土壤、海洋沉积物等)。

我们执行了所述的互补分析协议, 并在美国明尼苏达州的云杉和泥炭地响应 (spring) 现场的 s1 沼泽中进行了泥炭与深度的比较。这些结果与瑞典北部的永久冻土沼泽沼泽和芬的结果进行了比较, 以显示位点在代谢物和酶活性方面的差异。我们在蛋白质组学分析中发现了3312酶。对酶活性的深度分析表明, 在 spring 沼泽中, 酶的数量在15厘米至45厘米之间急剧下降 (图 1)。
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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

该协议描述了互补分析和组学技术的单一吞吐量, 最终形成了不同生态系统中天然有机物和微生物蛋白质组学的完全配对特征。这种方法可以进行强有力的比较, 以确定代谢途径和转化, 这对于描述温室气体的产生和预测对环境变化的反应十分重要。

用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

该协议描述了使用质谱法对单个样品进行综合、无偏分子表征的方法，使用代谢组学、蛋白质组学和唇部学法，以及核磁共振光谱学平台。这种方法的意义是，我们可以通过识别不同类型的分子来描述基因组下游的生物系统，使我们能够推断代谢和分解途径。顺序提取技术，允许利用水提取生物可利用的极性化合物，然后MPLEx从单个样品中捕获任何其他极性化合物或代谢物以及蛋白质和脂质。这种方法的可视化演示至关重要，因为它指导科学家在第二次提取步骤中分离三层，并在不同的分析仪器之间分离提取。综合多生物分析能够更有效地调查和全面了解复杂的生物系统。这种稳健的方法提取了多种分子，适用于多种样品类型。从收集并准备示例开始此过程，如文本协议中所述。使用乙醇洗涤，不锈钢器具，等价50毫克，每个干燥的样品到单独的两毫升玻璃管。在每个样品中加入一毫升蒸馏、脱气水。然后盖上小瓶，在摇床桌上摇动两个小时。将样品在重力15000倍时离心30分钟。然后让溶液在室温下站立20分钟。从每个样品中抽取并保存上一个样本。通过重复这些提取步骤，对现在提取的水提取残留物进行 MPLEx 提取。除了用零下20摄氏度的4至3个氯仿代替甲醇混合物作为蒸馏的脱气水。小心地分离两个产生的溶剂层，通过仔细移液去除顶层，可以直观地区分。干燥冷冻干燥机中的下部非极性层。一旦干燥，如果在未来几天内分析，添加5微升氯仿和195微升甲醇。为了提高四变离子回振质谱的电喷电离效率，通过直接喷射缩写了FTICR-MS。将氯仿提取物在甲醇中稀释一对一，水在甲醇中萃取二对一。通过直接将 100 微升调谐溶液（跨越大约 100 至 1，300 道尔顿）的质量范围注入 FTICR-MS 来校准 FTICR 光谱仪。直接向电喷电离源注入100微升苏万尼河富尔维克酸标准。通过注射器泵与 FTICR 光谱仪耦合，流量设置为每分钟 3.0 微升。将针电压设置为正 4.4 千伏。排队 1 到 100 质量充电比和玻璃毛细管在 180 摄氏度。使用分析软件检查生成的光谱，以确认数据的质量。现在，通过直接喷射将每个提取物的100微升引入电喷电离源，通过注射器泵将FTICR光谱仪耦合到每分钟3.0微升的流速。将参数设置为以前一样。调整每个样品或一组样品的离子积累时间，以考虑碳浓度的变化。收集每个样品的 144 次扫描，平均扫描，然后使用同源 CH2 系列进行内部校准。使用浓缩器干燥提取物，并保存其余提取物，以便随后进行气相色谱质谱法、液相色谱质谱法和核磁共振光谱分析。若要准备 GC-MS，请先准备文本协议中详述的空白控件示例。为了保护卡宾诺组，在每一个样品中加入20微升，每毫升甲氧胺30毫克，包括甲醇提取物、水提取物、空白和 FAME 校准样品。用瓶盖密封小瓶。漩涡提取物20秒，然后声波提取物60秒。在37摄氏度下将提取物在100倍重力下离心90分钟。在每个样品中加入 80 微升 MSTFA，其中 1%为三氯硅烷。在像以前一样对提取物进行涡旋和声波后，在37摄氏度下再次将提取物在100倍重力下离心30分钟。将提取物冷却至室温后，转移到GC-MS自动采样器小瓶中。按照文本协议中所述，继续进行 GC-MS 分析和数据处理。为准备液状态 NMR 分析，使用 5 毫摩尔 DSS 内部标准将剩余的水提取物稀释 10%。将混合物转移到一个高质量的三毫米外径硅酸盐玻璃 NMR 管中。按照文本协议中所述，继续进行 NMR 分析和数据处理。为了执行LC-MS唇部分析，将每种提取物的10微升注入超高性能液相色谱系统中，并结合使用反相带电表面混合柱的轨道拉普质谱仪。以每分钟 250 微升的流速设置文本协议中列出的 34 分钟渐变。使用负电离和正电离模式，具有较高的能量碰撞分离和碰撞引起的分离。要执行蛋白质组学分析，首先根据MPLEx协议提取蛋白质，以完成文本协议中概述的甲醇相剩余的部分。将泥炭与美国明尼苏达州云杉和泥炭地环境变化或云杉场的S1沼泽的深度进行比较。在蛋白质组学分析中确定了3，312种酶。对深度酶活性的分析表明，在云杉博格中，酶的数量急剧下降在15厘米到45厘米之间。为了显示在代谢物和酶活性中站点如何变化，SPRUCE 的结果与瑞典北部的永久变形博格和芬的结果进行比较。从 FTICR-MS、NMR、GC-MS 和 LC-MS 分析的组合中，在所有云杉泥炭样品中共发现了 67，040 种代谢物。这里展示的是不同深度通过各种技术识别的不同化学类的相对部分。虽然氨基酸和糖随着深度而下降，但脂质则未观察到这一点。通过交叉验证所有分析中针对 KEGG 数据库的代谢物，确定所鉴定的化合物涉及常见的代谢途径，如三叶酸循环、糖解和糖代谢。在整个过程中，了解潜在的污染源至关重要。从样品采集开始分析，样品不应与会对电离产生负面影响的固定塑料接触。在萃取过程中使用的许多溶剂都是危险或易燃的。始终佩戴适当的 PPE，以避免皮肤和眼神接触，以及避免污染样品。

Research

JoVE Journal

Environment

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

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高分辨率红外热成像（HRIT）的冰核和冰传播的植物研究中的应用

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

科研

环境科学

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

活性有机碳评估土壤中连续熏蒸孵化程序

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

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了解溶解有机物生物地球化学通过<em&gt;原位</em&gt;在河流生态系统营养手法

Dissolved organic matter (DOM) is a highly diverse mixture of molecules providing one of the largest sources of energy and nutrients to stream ecosystems. ...

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

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自动化，高清晰度移动采集系统对NO的氮同位素分析<sub系列&gt; X</sub

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Organic particulate matter (PM) is increasingly recognized as important to the Earth's climate system as well as public health in urban regions, and the ...

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The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

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婆罗洲 "爆炸蚂蚁" (蚁科昆虫) 对下颌腺储层含量的分离--gc-ms 和 MetaboliteDetector Volatilome 分析

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Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

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Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

微生物动力学的特征-基于流式细胞仪的工作流从纯文化到自然群落

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