Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Nous tenons à remercier J.P. Chanton, J.E. Kostka et M.M. Kolton d’assistance avec le prélèvement d’échantillons de tourbe. Parties de ce document ont été effectuées au laboratoire de Sciences moléculaires environnement, un DOE bureau de l’utilisateur installation scientifique parrainé par l’Office of Biological and Environmental Research. PPNL est exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC05-76RL01830. Ce travail a été soutenu par l’US Department of Energy Office of Science et Office of Biological and Environmental research (subventions : DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 et DE-SC0014416).

1. sequential Extraction de matière organique du sol, de sédiments ou de tourbe
<ol><li>Recueillir les sols, les sédiments ou tourbe par carottage et diviser les cœurs selon l’hypothèse testée (p. ex., profondeur). Échantillons de magasin en polytétrafluoroéthylène enduit contenants et congeler à-80 ° C pour le stockage avant l’analyse. NOTE : Environ 25 mg C est nécessaire pour ce protocole. Pour la tourbe (en général 45 % C), 50 mg de tourbe séchée est nécessaire. Plus gran...

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	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. 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Le single-débit, flux de plein-accouplées analyse utilisé pour caractériser les métabolites et le protéome permet de mieux comprendre les voies par lesquelles C cyclisme se produit dans un écosystème complex. Sol et la tourbe sont des matrices hétérogènes, et par conséquent, une des étapes essentielles de cette méthode se produit dans les premières étapes en veillant à ce que le départ de tourbe ou les matériaux du sol est très homogène. Il est préférable de broyer l’échantillon ainsi que les ag...

Dans le monde, zones humides contiennent environ 529 Pg de carbone (C), principalement en tant que C organique enfouie dans les gisements de tourbe1. Actuellement, ces tourbières agissent comme un puits net de C, séquestrant 29 Tg C y-1 en Amérique du Nord seulement1. Cependant, les perturbations environnementales telles que la vidange, les incendies, la sécheresse et des températures plus chaudes peuvent compenser ce puits de carbone en augmentant la décomposition des matières organiques résultant en une augmentation C pertes par effet de serre (dioxyde de carbone [CO2] et la production de méthane [CH4])1,2. Le changement climatique peut contribuer à une perte C si les températures plus chaudes ou conditions de sécheuse stimulent plus rapide C décomposition par les microorganismes. Alternativement, des températures plus élevées et les concentrations atmosphériques de CO2 peuvent stimuler la production primaire pour piéger le plus de CO2 sous forme de carbone organique (OC). Dans quelle mesure et à quelle vitesse cette OC est ensuite décomposé en CO2 et CH4 dépend d’interactions complexes entre les substrats de donneur d’électrons, la disponibilité des accepteurs d’électrons et les microorganismes qui médient le transformation. Dans de nombreux cas, les mécanismes ne sont pas bien caractérisés, ainsi leur réponse aux perturbations de l’environnementales n’est pas bien et on ne sait toujours pas quel sera le résultat net du changement climatique sur le bilan du carbone dans les écosystèmes de tourbières.
La nature complexe de la matière organique naturelle (mon) a fait de même identifier les composés organiques présents dans les mélanges NOM historiquement difficiles. Les progrès récents ont grandement amélioré notre capacité à caractériser les composés qui traditionnellement et, dans une certaine mesure, continuer à être, considéré comme récalcitrants humiques ou fulviques composés3,4,5. Nous comprenons maintenant que bon nombre de ces composés sont effectivement microbienne disponibles et peuvent être décomposées si un accepteur d’électron terminal approprié (thé) est rendu disponible6,7. Calcul de l’état d’oxydation nominale du carbone (CNOP) pour un composé fournit une métrique pour prédire le potentiel de décomposition et le rendement énergétique du thé requis. Cependant, elle nécessite une qualification de niveau moléculaire de la matière organique7. CNOP est calculée de la formule moléculaire par l’équation suivante7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, où z est la charge nette. CNOP est corrélée avec la thermodynamique conduite force8, dans lequel composés avec NOSC supérieur sont plus faciles à se dégrader, tandis que les composés avec NOSC inférieur nécessitent des thés de plus en plus énergiques afin de réduire. Composés avec NOSC moins de −2 nécessitent une énergie élevée produisant des thés tels que O2, nitrate ou MnIVet ne peut être dégradés par fréquents s’abaissent en énergie, ce qui donne des thés comme FeIII ou sulfate7. Il s’agit d’une considération importante dans les conditions anoxiques gorgés d’eau, milieux humides où O2 et autre énergie élevée produisant des thés sont rares9 et donc la dégradation des composés NOSC inférieur dans ces conditions sont thermodynamiquement limitée. Les perturbations environnementales peuvent influencer l’état thermodynamique de l’écosystème à travers les changements hydrologiques qui influencent O2 (le plus énergique accepteur d’électron), changements de substrats organiques et les accepteurs d’électrons mis à disposition par primaire production et dans une moindre mesure de la température. Un exemple important des effets de la température dans les systèmes de zones humides se produit en ce qui concerne le compromis qui se produit entre homoacetogenesis (p. ex., production d’acétate de CO2 et H2) et (méthanogénèse) hydrogenotrophic par exemple, production4 CH de CO2 et H2). À basse température, il semble que homoacetogenesis est légèrement favorisé, alors que les températures plus chaudes favorisent CH4 production10. Cet effet de la température peut avoir des implications importantes pour la réponse des écosystèmes au changement climatique, comme CH4 est un gaz à effet de serre beaucoup plus fort que le CO211 et donc augmentation de la production de CH4 au détriment de CO2 à des températures plus chaudes peuvent contribuer à une rétroaction positive avec le réchauffement climatique.
Tourbières produisent des quantités importantes de CO2 et CH46via la respiration microbienne d’origine naturelle organique d’importance. Le CNOP des substrats organiques de carbone détermine la proportion relative du CO2: CH4 produit qui est un paramètre essentiel à cause du forçage radiatif supérieur de CH4 par rapport au CO211, mais aussi parce que les efforts de modélisation ont identifié ce ratio comme un paramètre essentiel pour l’estimation des flux de C dans les tourbières,12. En l’absence d’accepteurs d’électrons terminal autres que le CO2, il peut être démontré par prépondérance des électrons que des substrats organiques C avec la volonté de > 0 NOSC produisent CO2: CH4 > 1, C organique avec NOSC = 0 produit CO2 et CH4 dans rapport équimolaire et C organique avec NOSC < 1 produira CO2: CH4 < 113. Décomposition du crime organisé dans les écosystèmes naturels est médiée par des micro-organismes, afin que même quand la dégradation d’un composé particulier est thermodynamiquement possible, elle est cinétiquement limité par l’activité d’enzymes microbiennes et, dans des conditions anoxiques, par la force motrice thermodynamique (c'est-à-direCNOP)7. Jusqu'à présent, il a été difficile pour caractériser complètement la matière organique, car la diversité des composés présents nécessite différentes techniques complémentaires pour leur caractérisation. Les progrès récents ont comblé l’écart ; à l’aide d’un ensemble de techniques d’analyse, nous pouvons analyser une large gamme de composés organiques, fournissant la caractérisation moléculaire et, dans certains quantification de cas, de petits métabolites primaires comme glucose jusqu'à 800 Da poly-hétérocycles. Auparavant ces grosses molécules complexes seraient ont été caractérisées simplement comme comme la lignine ou tanin-like et supposé avoir été récalcitrant. Caractérisation moléculaire-niveau, cependant, permet de calculer NOSC pour ces grosses molécules complexes. Ces valeurs NOSC sont corrélées linéairement avec la force motrice thermodynamique permettant d’évaluer la qualité de la matière organique disponible par décomposition, ce qui, dans de nombreux cas, révèle que ces molécules complexes peuvent effectivement être microbienne dégradable même dans des conditions anoxiques qui prévalent dans les milieux humides.
Depuis l’introduction de O2 permet de presque toutes les valeurs NOSC naturellement observées à décomposer la matière organique, dans les présentes, nous nous concentrons sur les changements dans la matière organique et de la protéomique microbienne qui risquent d’être les principaux facteurs en milieu humide (c'est-à-dire, systèmes de limitée O2). Cependant, toutes les techniques que nous allons discuter peuvent être appliquées à la matière organique d’un écosystème. Communément, en vrac mesures basées sur optique et analyses de fluorescence ont été utilisés pour évaluer la qualité de la matière organique3,14. Lors de l’utilisation de mesures en vrac tels que ceux-ci, cependant, les détails fins sont perdus comme un grand nombre de molécules est classé ensemble sous des termes génériques comme dérivés humiques ou fulvics. Les définitions de ces catégories ne sont pas bien contraintes et, en fait, peuvent varier d’une étude à faire des comparaisons impossibles. En outre, mesures en vrac ne fournissent les détails moléculaires nécessaires pour le calcul de la thermodynamique qui régissent le système et ne répondent donc vraiment évaluer les matières organiques qualité15.
Techniques individuelles telles que Fourier transforment ion cyclotron resonance spectrométrie de masse (FTICR-MS), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) de la spectrométrie de masse, et faire de la spectrométrie de masse par chromatographie liquide (LC-MS) fournir ces détails au niveau moléculaire. Alors que chacune de ces techniques présente ses propres limites, ils apportent aussi leurs propres points forts qui peuvent être exploitées dans une approche intégrée pour atteindre la finesse des détails moléculaires nécessaires pour quantifier la qualité de la matière organique dans un sens rigoureux de thermodynamique . GC-MS est utile pour identifier des métabolites petites critiques qui sont susceptibles d’exercer une influence proximale sur le CO2 et de production de4 CH (p. ex., glucose, acétate, etc.) ; Cependant, GC-MS requiert la vérification contre une norme et est donc limité à des composés déjà connus présents dans la base de données, empêchant l’identification de nouveaux composés. En outre, GC-MS est une technique semi qualitative permettant d’inférence sur les changements dans les concentrations relatives, mais ne pas fournir les informations de concentration réelle nécessaires pour le calcul des énergies libres de Gibbs par exemple. Enfin, GC-MS nécessite la dérivatisation de molécules avant l’analyse, ce qui limite la résolution de composés plus petits que ~ 400 Da et alcools volatiles sont perdus pendant l’étape de séchage.
Unidimensionnelle (1D) 1H état liquide NMR permet une caractérisation très quantitative des petits métabolites (y compris les métabolites primaires de faible poids moléculaire et substances volatiles comme l’acétate, acétone, formiate, pyruvate, alcools, succinate, paraffines chlorées des acides gras, comme un éventail de glucides notoirement absents ou compromis de méthodes axées sur le MS) et leurs concentrations sont particulièrement utiles pour le calcul des paramètres thermodynamiques. Pourtant, comme le GC-MS, 1D NMR de mélanges complexes nécessite la normalisation par rapport à une base de données et donc ne permet pas seul faciliter l’identification de nouveaux composés qui sont susceptibles d’être abondante dans des écosystèmes complexes naturels et changeantes. En outre, la RMN est moins sensible que les techniques basées sur MS et donc, profilage métabolite quantitative est réalisé seulement au-dessus de 1 µM à l’aide de systèmes NMR équipés de sondes froid refroidi à l’hélium. Pas très apprécié, certains NMR froid-sondes sont tolérantes au sel et permettent une analyse environnementale de mélange en présence de concentrations millimolaires de sels lorsqu’il est utilisé dans le plus petit diamètre (< 3 mm de diamètre extérieur) échantillon tubes16. Cependant, une autre complication de la RMN est celui des quantités élevées de minéraux et des métaux paramagnétiques (p. ex., Fe et Mn au-dessus % de poids de 1-3), qui peut être abondant dans les sols secs, peut élargir les caractéristiques spectrales et compliquer l’interprétation des spectres RMN . À l’aide d’extraction en phase solide (SPE) peut aide dans l’interprétation de la RMN et de métabolomique basées sur les méthodes de réduction des sels minéraux et en augmentant la qualité spectrale.
FTICR-MS par injection directe est une technique très sensible permettant de détecter des dizaines de milliers de métabolites provenant d’un échantillon unique, mais elle ne capture pas les métabolites petites critiques tels que l’acétate, le pyruvate et succinate et est notoirement difficile à utiliser des sucres et autres glucides17, ni fournit des informations quantitatives. Cependant, contrairement aux autres techniques, FTICR-MS excelle en identifiant et en assignant la formule moléculaire de nouveaux composés et identifie par conséquent le plus grand nombre de composés en fournissant des informations moléculaires plus que n’importe lequel des autres techniques décrites. Ceci est utile, car l’information moléculaire fournie par FTICR-MS (et d’autres techniques) peut être utilisée pour calculer NOSC qui est liée à la force motrice thermodynamique régissant la probabilité de certaines réactions8 et leurs tarifs dans certaines conditions7. En outre, en couplant FTICR-MS avec des techniques de séparation, comme LC avec tandem MS, informations structurelles quantitatives peuvent être atteint, compenserait une partie des inconvénients de cette technique. LC-MS est utile pour identifier des composés de type lipidique et d’autres métabolites qui ne sont pas bien caractérisés par une des autres méthodes. Couplage LC FTICR-MS ou LC-MS avec un collecteur de fraction et recueillant des fractions d’inconnues spécifiques d’intérêt pour l’élucidation de la structure de l’état liquide de deux dimensions (2D) NMR est la situation idéale pour identifier et quantifier les composés inconnus18 ,,19. Il s’agit cependant d’une très longue étape qui pourrait être utilisée si nécessaire. Pris individuellement, chacune de ces techniques présentent un portrait différent de la matière organique, et en les intégrant, nous pouvons parvenir à une compréhension plus complète que l’utilisation des techniques d’isolément.
Alors que les considérations thermodynamiques définir les contraintes ultimes sur quelles transformations sont possibles dans un système, décomposition des matières organiques est médiée par des microorganismes dont les activités enzymatiques contrôlent les vitesses de réaction. Bien comprendre les contrôles sur la décomposition des matières organiques et, finalement, la production de gaz (CO2 et CH4) à effet de serre des milieux humides exige donc une approche intégrée omiques pour caractériser les activités des enzymes microbiennes ainsi que les métabolites. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour parvenir à une telle analyse complète d’un seul échantillon en utilisant une approche séquentielle qui se traduit par une analyse complètement appariée. Cette approche se développe sur le métabolite, protéines et lipides extraction (MPLex) protocole dans lequel protéomique a été couplé avec le GC-MS et LC-MS20 pour identifier les petits métabolites, les protéines et les lipides en incorporant les informations quantitatives métabolite par l’intermédiaire RMN et identification des grandes métabolites secondaires via FTICR-Mme légèrement différentes à MPLex, nous commençons le protocole avec un captage d’eau, puis utiliser l’extraction séquentielle avec plus en plus des solvants non-polaires. Toutes les extractions sont effectuées sur un échantillon unique qui conserve l’échantillon lorsque les volumes sont limités ou difficiles à obtenir et diminue les erreurs expérimentales introduites par la variation entre les aliquotes de matrices de prélèvement hétérogènes (par exemple, le sol et tourbe) ou différences dans les conditions d’entreposage et de la durée.
Enfin, en couplant les analyses de l’OM avec les analyses protéomique de la communauté microbienne, nous pouvons bâtir des réseaux métaboliques qui décrivent les voies et la transformation de la décomposition des matières organiques. Cela nous permet de tester des hypothèses spécifiques au sujet de comment les perturbations au système influenceront ultime CO2 et production4 CH au travers les substrats organiques disponibles, accepteurs d’électrons et les communautés microbiennes médiation des réactions via l’activité de catalyseurs enzymatiques.
L’objectif général de cette méthode consiste à fournir un protocole de débit unique pour l’analyse des métabolites, des lipides et des protéines microbiennes auprès d’un échantillon unique, créant ainsi un ensemble de données totalement apparié pour la construction de réseaux métaboliques tout en limitant les erreurs analytiques .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1067px;" width="1065">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

Matière organique naturelle (mon) est composée d’un mélange très complexe de milliers de composés organiques qui, historiquement, s’est révélée difficiles à caractériser. Toutefois, pour comprendre les contrôles thermodynamiques et cinétiques de la production de gaz (dioxyde de carbone [CO2] et de méthane [CH4]) à effet de serre résultant de la décomposition du NOM, une caractérisation moléculaire couplé avec microbienne proteome analyses est nécessaire. En outre, changements climatiques et environnementaux sont censés perturbent les écosystèmes naturels, potentiellement perturber les interactions complexes qui influent sur la livraison des substrats de la matière organique et les microorganismes, effectuer des transformations des. Une caractérisation moléculaire détaillée de la matière organique, protéomique microbienne et les voies et les transformations par lequel la matière organique est décomposée sera nécessaire de prévoir la direction et l’ampleur des effets des changements environnementaux. Cet article décrit un débit méthodologique pour la caractérisation de métabolites complète dans un seul échantillon par injection directe Fourier transform ion cyclotron resonance spectrométrie de masse (FTICR-MS), chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), la spectrométrie de masse spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), chromatographie en phase liquide spectrométrie de masse (LC-MS) et d’analyse protéomique. Cette approche se traduit par un ensemble de données totalement appariés qui améliore la confiance statistique pour inférer les voies de la décomposition des matières organiques, la résultante de CO2 et les taux de production de4 CH et leurs réactions aux perturbations environnementales. Ci-après nous présentons les résultats de l’application de cette méthode au NOM des échantillons prélevés dans les tourbières ; Toutefois, le protocole s’applique à n’importe quel échantillon NOM (par exemple, de tourbe, les sols forestiers, les sédiments marins, etc.).

Nous avons effectué le protocole d’analyse complémentaires décrites et comparées de tourbe avec la profondeur dans la tourbière de S1 dans le site épinettes et tourbières réponse sous changer environnements () dans le Minnesota, USA. Ces résultats sont comparés à ceux d’une tourbière du pergélisol et de la fen, du Nord de la Suède pour montrer comment les sites peuvent varier en métabolite et les activités enzymatiques. Nous avons identifié 3 312 enzymes dans l’analyse protéomique. L’analyse de ...

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Ce protocole décrit un débit unique pour les techniques analytiques et omiques complémentaires aboutissant à une caractérisation entièrement appariés de la matière organique naturelle et de la protéomique microbienne dans les écosystèmes différents. Cette approche permet des comparaisons robustes pour l’identification des voies métaboliques et les transformations importantes pour décrire la production de gaz à effet de serre et de prédire les réponses aux changements environnementaux.

Single-débit haute résolution analytique des Techniques complémentaires pour caractériser les mélanges complexes de matière organique naturelle

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Ce protocole décrit la méthode de caractérisation moléculaire complète et impartiale d’un seul échantillon en utilisant à la fois la spectrométrie de masse, en utilisant la métabolomique, la protéomique et la lipidomique, et les plates-formes nucléaires de spectroscopie par résonance magnétique. L’importance de cette approche est que nous pouvons caractériser un système biologique en aval du génome, en identifiant différents types de molécules, ce qui nous permet d’déduire les voies métaboliques et de décomposition. Technique d’extraction séquentielle, permettre l’extraction de composés polaires biodisponibles à l’aide de l’eau, suivie de MPLEx pour capturer d’autres composés polaires ou métabolites ainsi que des protéines et des lipides à partir d’un seul échantillon.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle parce qu’elle guide le scientifique en séparant les trois couches au cours de la deuxième étape d’extraction, et en divisant les extraits entre différents instruments d’analyse. Les analyses multi-omiques intégratives permettent des investigations plus efficaces et une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Cette méthode robuste extrait une grande diversité de molécules et s’applique à divers types d’échantillons.Commencez cette procédure par la collecte et la préparation des échantillons tels que décrits dans le protocole texte. À l’aide d’un ustensile en acier inoxydable lavé à l’éthanol, aliquot 50 milligrammes de chacun des échantillons séchés en tubes de verre individuels de deux millilitres. Ajouter un millilitre d’eau distillée et dégazée à chaque échantillon.Ensuite, capuchon les flacons et secouer pendant deux heures sur une table shaker. Centrifuger les échantillons à 15 mille fois la gravité pendant 30 minutes. Et ensuite permettre aux solutions de se tenir à température ambiante pendant 20 minutes.Décanter et enregistrer le surnatant de chaque échantillon. Effectuer une extraction MPLEx sur les résidus maintenant extraits d’eau en répétant ces étapes d’extraction. Sauf pour substituer un moins 20 degrés Celsius quatre à trois chloroformes au mélange de méthanol pour l’eau distillée et dégazée.Séparez soigneusement les deux couches de solvants qui en résultent, qui seront visuellement discernables en enlevant la couche supérieure par un tuyautage minutieux. Séchez la couche inférieure non polaire dans le séchoir à congélation. Dès qu’il est sec, ajouter cinq microlitres de chloroforme et 195 microlitres de méthanol s’ils sont analysés dans les prochains jours.Pour améliorer l’efficacité d’ionisation d’électrospray pour la spectrométrie de masse de résonance de cyclotron d’ion de fourier-transformer, abrégé FTICR-MS par injection directe. Diluer l’extrait de chloroforme un à un dans le méthanol, et l’extrait d’eau deux à un dans le méthanol. Calibrer le spectromètre FTICR en injectant directement 100 microlitres d’une solution de réglage, couvrant une plage de masse d’environ 100 à 1 300 daltoniens, dans le FTICR-MS.Injecter directement 100 microlitres de la norme d’acide fulvic de la rivière Suwannee à la source d’ionisation de l’électrospray. Couplé au spectromètre FTICR à l’aide d’une pompe à seringues réglée à un débit de 3,0 microlitres par minute. Réglez la tension de l’aiguille à 4,4 kilovolts positifs.File d’attente un à 100 masse à charge ratio et le verre capillaire à 180 degrés Celsius. Inspectez les spectres qui en résultent à l’aide du logiciel d’analyse pour confirmer la qualité des données. Maintenant, introduisez 100 microlitres de chaque extrait par injection directe à la source d’ionisation d’électrospray, couplé au spectromètre de FTICR par une pompe de seringue réglée à un taux d’écoulement de 3.0 microlitres par minute.Définissez les paramètres comme avant. Ajuster le temps d’accumulation d’ion pour chaque échantillon ou groupe d’échantillons pour tenir compte de la variation de la concentration de carbone. Recueillir 144 scans pour chaque échantillon, faire la moyenne des analyses, puis effectuer un étalonnage interne à l’aide d’une série homologue CH2.Séchez les extraits à l’aide d’un concentrateur et enregistrez le reste des extraits pour la spectrométrie de masse de chromatographie gazeuse ultérieure, la spectrométrie de masse chromatographie liquide et l’analyse de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Pour se préparer au GC-MS, préparez d’abord des échantillons de contrôle vierge tels que détaillés dans le protocole texte. Pour protéger les groupes de carbinols ajouter 20 microlitres de 30 milligrammes par millilitre hydrochoxamine hydrochlorure à Paradyne à chacun des échantillons, y compris les extraits de méthanol, les extraits d’eau, les blancs et les échantillons d’étalonnage FAME.Sceller les flacons avec des bouchons. Vortex les extraits pendant 20 secondes, puis sonifier les extraits pendant 60 secondes. Centrifugeuse les extraits à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes à 100 fois la gravité.Ajouter 80 microlitres de MSTFA avec 1% trimethylchlorosilane à chaque échantillon. Après le vortex et la sonification des extraits comme avant, centrifuger les extraits à nouveau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 fois la gravité. Après refroidissement des extraits à température ambiante, transférer dans des flacons autosampler GC-MS.Procédez à l’analyse GC-MS et au traitement des données tel que décrit dans le protocole texte. Pour se préparer à l’analyse nmr à l’état liquide, diluer le reste des extraits d’eau de 10% avec une norme interne DSS de cinq millimolaires. Transférer le mélange dans un tube NMR en verre borosilicate de diamètre extérieur de haute qualité de trois millimètres.Procédez à l’analyse NMR et au traitement des données tel que décrit dans le protocole texte. Pour effectuer l’analyse lipidomique LC-MS, injectez 10 microlitres de chaque extrait dans un système de chromatographie liquide ultra performant, couplé à un spectromètre de masse Orbitrap à l’aide d’une colonne hybride de surface chargée en phase inversée. Définissez un gradient de 34 minutes tel qu’indiqué dans le protocole texte à un débit de 250 microlitres par minute.Utilisez des modes d’ionisation négatifs et positifs avec une dissociation plus élevée des collisions d’énergie et une dissociation induite par la collision. Pour effectuer l’analyse protéomique, extraire d’abord des protéines selon le protocole MPLEx pour le reste de la phase de méthanol tel que décrit dans le protocole de texte. La tourbe a été comparée à la profondeur de la tourbière S1 à la réponse de l’épinette et des tourbières dans des environnements changeants ou sur le site de l’ÉPINETTE au Minnesota, aux États-Unis.3 312 enzymes ont été identifiées dans l’analyse protéomique. Une analyse des activités enzymatiques avec profondeur révèle que le nombre d’enzymes diminue fortement entre 15 centimètres et 45 centimètres dans la tourbière spruce. Pour montrer comment les sites peuvent varier dans les activités métabolites et enzymatiques, les résultats de l’ÉPINETTE sont comparés à ceux d’une tourbière de pergélisol et de fen dans le nord de la Suède.Dans l’ensemble, 67 040 métabolites ont été identifiés dans tous les échantillons de tourbe du SPRUCE provenant de la combinaison des analyses FTICR-MS, NMR, GC-MS et LC-MS. Il est indiqué ici la fraction relative des différentes classes chimiques identifiées par diverses techniques dans les différentes profondeurs. Bien que les acides aminés et les sucres diminuent avec la profondeur, ce n’est pas observé pour les lipides.En validant croiséement les métabolites identifiés dans toutes les analyses par rapport à la base de données KEGG, il a été déterminé que les composés identifiés sont impliqués dans des voies métaboliques communes telles que le cycle de l’acide tricarboxylique, la glycolyse et le métabolisme du sucre. Tout au long de cette procédure, il est essentiel d’être conscient des sources potentielles de contamination. À partir de la collecte de l’échantillon par l’analyse, les échantillons ne devraient pas entrer en contact avec des plastiques fixés qui peuvent nuire à l’ionisation.Bon nombre des solvants utilisés pendant la procédure d’extraction sont dangereux ou inflammables. Portez toujours des EPI appropriés pour éviter tout contact avec la peau et les yeux, ainsi que pour éviter de contaminer les échantillons.

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