Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Wir möchten J.P. Chanton, j.e. Kostka und M.M. Kolton danken für Unterstützung mit Torf Proben. Teile dieser Arbeit wurden an den molekularen Wissenschaften Umweltlabor, eine DOE Büro der Wissenschaft Benutzer Einrichtung vom Büro des biologischen und Umweltforschung durchgeführt. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert. Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science und Büro der biologische und ökologische Forschung unterstützt (gewährt: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 und DE-SC0014416).

(1) sequentielle Extraktion der organischen Substanz aus Boden, Sediment oder Torf
<ol><li>Sammeln Sie Boden, Sedimente oder Torf über Kernbohrungen und teilen Sie Kerne nach der Hypothese getestet (z.B. Tiefe). Shop-Proben im Polytetrafluorethylen beschichtet Container und Einfrieren bei-80 ° C Lagerung vor der Analyse. Hinweis: Ca. 25 mg C ist für dieses Protokoll benötigt. Für Torf (in der Regel 45 % C) ist 50 mg von getrockneten Torf erforderlich. Größere Probenmengen können für niedri...

<ol>
	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. 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Der Single-Durchsatz bietet voll-gekoppelte Analyse Bach Metaboliten und das Proteom zu charakterisieren Einblicke in die Wege, durch welche, die c Radfahren in ein komplexes Ökosystem stattfindet. Boden und Torf sind heterogene Matrizen, und daher einer der kritischen Schritte dieser Methode tritt in die ersten Schritte um sicherzustellen, dass der Start Torf oder Bodenmaterial sehr homogen ist. Es empfiehlt sich, die Probe Schleifen sowie Aggregate Extraktionseffizienz reduzieren können. Dies ist ein besonderes Probl...

Weltweit sind Feuchtgebiete schätzungsweise 529 Pg Kohlenstoff (C), enthalten meist als organischen C in Torf Einlagen1begraben. Derzeit wirken solche Mooren als Netto C Senke, Sequestrierung 29 Tg C y-1 in Nordamerika allein1. Jedoch kann ökologische Störungen wie Entwässerung, Brände, Dürre und wärmeren Temperaturen diese C-Senke durch Erhöhung der Abbau organischer Materie, was zu erhöhten C Verluste über Treibhausgas aufgehoben (Kohlendioxid [CO2] und [CH-4] Methan) Produktion1,2. Klimawandel kann zu C beitragen, wenn wärmere Temperaturen oder trockener Bedingungen schneller C Zersetzung durch Mikroorganismen stimuliert. Alternativ können höhere Temperaturen und Luftkonzentrationen CO2 Primärproduktion um mehr CO2 als organischem Kohlenstoff (OC) absondern stimulieren. In welchem Umfang und wie schnell diese OC ist dann zerlegt in CO2 und CH4 hängt die komplexen Wechselwirkungen zwischen Elektron Spender Substrate, die Verfügbarkeit von Elektronen-Akzeptoren und die Mikroorganismen, die vermitteln die Diese Transformation. In vielen Fällen die Mechanismen sind nicht gut charakterisierten, damit ihre Reaktion auf ökologische Störungen ist nicht gut eingeschränkt und es bleibt unklar, was das Ergebnis des Klimawandels auf die Kohlenstoffbilanz in Mooren Ökosysteme.
Die komplexe Natur der natürlichen organischen Substanz (NOM) hat sogar die organischen Verbindungen im NOM Mischungen historisch schwierig zu identifizieren. Die jüngsten Fortschritte haben unsere Fähigkeit, Verbindungen, traditionell zu charakterisieren und zu einem gewissen Grad als widerspenstige Huminsäuren oder Fulvinsäuren Verbindungen3,4,5angesehen werden, weiterhin verbessert. Wir verstehen jetzt, dass viele dieser Verbindungen eigentlich mikrobiell verfügbar sind und zerlegt werden, können wenn eine geeignete terminal Elektronen-Akzeptor (Tee) zur Verfügung6,7 erfolgt. Berechnung der nominellen Oxidationsstufe des Kohlenstoffs (NOSC) für eine Verbindung bietet eine Metrik für die Vorhersage des Potenzials für die Zersetzung und die Energieausbeute des Tees erforderlich. Es erfordert jedoch eine Charakterisierung molekularer Ebene der organischen Substanz7. NOSC errechnet sich aus der Summenformel über die folgende Gleichung7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, wo z der Nettoladung ist. NOSC korreliert mit der thermodynamischen treibende Kraft8, wobei Verbindungen mit höheren NOSC leichter sind zu verschlechtern, während Verbindungen mit niedriger NOSC bedürfen zu ihrer zunehmend energetische Tees reduziert werden. Verbindungen mit weniger als −2 NOSC erfordern eine hohe Energie Gewinnung Tees wie O2, Nitrat oder MnIV, und kann nicht abgebaut werden, durch die häufig auftretenden niedriger Energie Gewinnung Teesorten wie FeIII oder Sulfat-7. Dies ist ein wichtiger Aspekt in den aufgeweichten anoxischen Bedingungen in Feuchtgebiete, wo O2 und andere hochenergetische nachgeben Tees knapp9 sind und deshalb der Abbau von niedrigeren NOSC Verbindungen unter diesen Bedingungen thermodynamisch begrenzt. Ökologische Störung beeinflussen den thermodynamischen Zustand des Ökosystems durch hydrologische Veränderungen, die Einfluss auf O2 (die energiereichsten Elektronen-Akzeptor), Veränderungen der organischen Substraten und Elektronen-Akzeptoren zur Verfügung gestellt, von primären Produktion, und in geringerem Maße von der Temperatur. Ein wichtiges Beispiel für die Temperatureffekte in Feuchtgebieten Systemen tritt in Bezug auf die Trade-off zwischen Homoacetogenesis (d.h., Acetat-Produktion von CO2 und H2) und Hydrogenotrophic () Methanogenese tritt d. h., CH4 Produktion von CO2 und H2). Bei niedrigen Temperaturen scheint es, dass Homoacetogenesis etwas begünstigt wird, während wärmere Temperaturen CH4 Produktion10bevorzugen. Diese Temperatur kann wichtige Implikationen für die Reaktion von Ökosystemen zu wechselnden Klima, wirken wie CH4 Treibhausgas ist viel stärker als CO211 und damit Steigerung der Produktion von CH4 auf Kosten des CO2 bei wärmeren Temperaturen kann auf ein positives Feedback mit Erwärmung des Klimas beitragen.
Mooren produzieren weltweit bedeutende Mengen von CO2 und CH46über mikrobielle Atmung von natürlich vorkommendem organische Materie. Die NOSC der organischen Kohlenstoff Substrate bestimmt den relativen Anteil der CO2: CH4 hergestellt, was ein kritischer Parameter aufgrund der höheren Strahlungsantriebs CH4 im Vergleich zu CO211, sondern auch, weil Modellierung Bemühungen haben dieses Verhältnis als ein kritischer Parameter für die Schätzung der C Flussmittel in Mooren12identifiziert. In Abwesenheit von terminal Elektronen Akzeptoren als CO2, es kann durch Elektron Balance gezeigt werden, dass Bio C Substrate mit NOSC > 0 wird CO-2produzieren: CH4 > 1, Bio C mit NOSC = 0 produziert CO2 und CH4 in äquimolaren Verhältnis und Bio C mit NOSC erzeugt < 1 CO2: CH4 < 113. Zersetzung von OC in natürlichen Ökosystemen wird durch Mikroorganismen, vermittelt, so dass auch beim Abbau eines bestimmten Stoffes thermodynamisch möglich ist, es kinetisch durch die Aktivität der mikrobiellen Enzyme und unter anoxischen Bedingungen von begrenzt ist die thermodynamische Antriebskraft (d.h.NOSC)7. Bis jetzt hat es schwierig, um die organische Substanz vollständig zu charakterisieren, da die Vielfalt der Verbindungen, die verschiedenen komplementäre Techniken für deren Charakterisierung erfordert. Die jüngsten Fortschritte haben die Lücke geschlossen; mit einer Suite von analytischen Techniken können wir eine Vielzahl von organischen Verbindungen, die Bereitstellung von Charakterisierung molekularer Ebene und in einigen Fällen Quantifizierung von kleinen primären Metaboliten wie Glukose bis zu 800 Da Poly-Heterozyklen analysieren. Zuvor würde so große komplexe Moleküle einfach als Lignin-ähnliche oder Tannin-Like und angenommenen widerspenstigen gewesen zu sein geprägt haben. Charakterisierung der molekularen Ebene, ermöglicht jedoch die Berechnung der NOSC für selbst diese große komplexe Moleküle. Diese NOSC Werte sind linear korreliert mit der thermodynamischen Motor ermöglicht eine Beurteilung der Qualität von organischem Material zur Zersetzung, die in vielen Fällen zeigt, dass diese komplexe Moleküle tatsächlich mikrobiell sein kann abbaubare auch unter anoxischen Bedingungen, die in den Feuchtgebieten herrschen.
Seit Einführung von O2 organischen Substanz von fast allen natürlich NOSC Beobachtungswerte zerlegt werden kann, konzentrieren hier wir uns auf Veränderungen in der organischen Substanz und mikrobielle Proteomics Haupttreiber im Feuchtgebiet (d. h., sein dürften begrenzte O2) Systeme. Jedoch können die Techniken, die wir besprechen auf organischer Substanz aus jedem Ökosystem angewendet werden. Allgemein, Bulk Messungen basierend auf optischen und Fluoreszenz-Analysen wurden verwendet, um organische Substanz Qualität3,14zu beurteilen. Bei der Verwendung von Bulk-Messungen wie diese sind feine Details verloren wie die große Zahl von Molekülen zusammen unter Oberbegriffe wie Humics oder Fulvics kategorisiert werden. Die Definitionen dieser Kategorien sind nicht gut eingeschränkt und in der Tat variieren von Studie zu Studie machen Vergleiche unmöglich. Weiter, Bulk-Messungen nicht die molekularen Details zur Berechnung der Thermodynamik für das System und daher wirklich Beurteilung organischer Qualität15zurückbleiben.
Einzeltechniken wie Fourier transformieren Ion Cyclotron Resonance Massenspektrometrie (FTICR-MS), Kernresonanzspektroskopie (NMR), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) tun Geben Sie die Details solcher molekularer Ebene. Während jede dieser Techniken seine eigenen Grenzen präsentiert, bringen sie auch ihre eigenen Stärken, die in einem integrierten Ansatz zu molekularen Details zur Quantifizierung organischer Qualität in einem rigorosen thermodynamischen Sinne notwendig genutzt werden können . GC-MS ist nützlich zur Identifikation von kritischen kleine Metaboliten, die voraussichtlich proximalen Einfluss auf CO2 und CH4 Produktion (z. B.Glukose, Acetat, etc.); jedoch, GC-MS erfordert Überprüfung gegen einen Standard und beschränkt sich daher auf bereits bekannte Verbindungen, die in der Datenbank, die Identifizierung der neuartige Substanzen zu verhindern. GC-MS ist eine semi-qualitative Technik erlaubt Rückschlüsse über die Veränderungen im relativen Konzentrationen, aber nicht der Information tatsächliche Konzentration notwendig für die Berechnung der Gibb freie Energien zum Beispiel. Zu guter Letzt GC-MS erfordert Derivatisierung von Molekülen vor der Analyse die Auflösung kleiner als ~ 400 Da Verbindungen begrenzt und flüchtige Alkohole sind verloren während der Trocknung.
Eindimensionale (1D) 1H flüssigen Zustand NMR ermöglicht hoch quantitative Charakterisierung der kleinen Metaboliten (einschließlich primäre kleines Molekulargewicht Metaboliten und flüchtigen Stoffen wie Alkohole, Acetat, Aceton, Formiat, Pyruvat, Succinat, kurzkettige Fettsäuren, sowie eine Reihe von Kohlenhydraten notorisch abwesend oder gefährdete aus MS-basierte Methoden) und deren Konzentrationen sind besonders nützlich für die Berechnung der thermodynamischen Parameter. Doch wie GC-MS, 1D NMR von komplexen Gemischen erfordert Standardisierung im Vergleich zu einer Datenbank und daher nicht allein erlauben einfache Identifizierung von neuartigen Verbindungen, die reich an komplexen Natur- und veränderten Ökosysteme sein dürften. Darüber hinaus NMR ist unempfindlicher als die MS-basierte Techniken und Profilierung quantitative Metabolit daher erst ab 1 µM mit NMR-Systeme ausgestattet mit Helium gekühlt Kälte-Sonden erreicht ist. Nicht weithin geschätzt, einige NMR Kälte-Sonden sind salztoleranten und ökologischen Mischung Analyse im Beisein von millimolaren Salzkonzentrationen bei Verwendung in kleineren Durchmesser (< 3 mm Außendurchmesser) Probe Rohre16ermöglichen. Eine weitere Komplikation der NMR ist jedoch, dass hohe Mengen an paramagnetischen Metalle und Mineralien (z.B.Fe und Mn über 1-3 wt %(), die reichlich in Hochland Böden lässt, können spektrale Funktionen zu erweitern und erschweren die Interpretation von NMR-Spektren . Mit Festphasenextraktion (SPE) können Hilfe bei der Interpretation von NMR und MS-basierte Metabolomik Methoden durch die Verringerung der Mineralsalze und spektrale Qualitätssteigerung.
FTICR-MS durch direkte Injektion ist eine hochsensible Technik in der Lage, Zehntausende von Metaboliten aus einer einzigen Probe zu erkennen, aber es erfasst nicht die kritische kleine Metaboliten wie Acetat, Pyruvat und Succinat und ist notorisch schwierig zu Verwenden Sie für Zucker und andere Kohlenhydrate17, noch enthält es quantitative Angaben. Jedoch im Gegensatz zu den anderen Techniken FTICR-MS zeichnet sich bei identifizieren und neuartige Substanzen Molekulare Formel zuweisen und somit die größte Anzahl an Verbindungen mehr molekularen Informationen als alle anderen beschriebenen Techniken identifiziert. Dies ist nützlich, weil die molekularen Informationen FTICR-MS (und andere Techniken) verwendet werden kann, um NOSC zu berechnen, bezogen auf die thermodynamische Antriebskraft für die Wahrscheinlichkeit, dass bestimmte Reaktionen8 und ihre Preise unter bestimmten Bedingungen-7. Darüber hinaus kann durch die Kopplung von FTICR-MS mit Trennverfahren, wie z. B. LC zusammen mit Tandem MS, quantitative Strukturinformationen erreicht werden versetzen einige der Nachteile dieser Technik. LC-MS ist nützlich zur Identifikation von Lipid-ähnliche Verbindungen und andere Metaboliten, die nicht gut zeichnen sich durch eine der anderen Methoden. Kupplung FTICR LC-MS oder LC-MS mit Fraktionssammler und sammeln von Bruchteilen von bestimmten unbekannten von Interesse für strukturelle Aufklärung durch zweidimensionale (2D) flüssigen Zustand NMR ist die ideale Situation für die Identifizierung und Quantifizierung der unbekannte Verbindungen18 ,19. Dies ist jedoch eine sehr zeitaufwendige Schritt, der verwendet werden könnte, bei Bedarf. Einzeln genommen, jede dieser Techniken bieten eine andere Momentaufnahme der organischen Substanz und von zu integrieren, können wir ein vollständigeres Verständnis als die Verwendung einer der Techniken isoliert.
Während die thermodynamischen Überlegungen die ultimative Einschränkungen stellen für welche Transformationen in einem System möglich sind, ist Abbau organischer Materie durch Mikroorganismen vermittelt, deren Enzymaktivitäten Reaktionsgeschwindigkeiten steuern. Vollständig zu verstehen, die Steuerelemente am Abbau organischer Materie und letztlich (CO2 und CH4) Treibhausgasproduktion aus Feuchtgebieten erfordert daher einen integrierte Omics Ansatz zur Charakterisierung mikrobieller Enzymaktivitäten sowie die Metaboliten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erreichung einer umfassenden Analysis von einer einzigen Probe mit einem sequentiellen Ansatz, der eine vollständig gekoppelte Analyse führt. Dieser Ansatz baut auf der Metabolit, Protein und Lipid-Extraktion (MPLex)-Protokoll in der Proteomik mit GC-MS und LC-MS20 kleine Metaboliten, Proteinen und Lipiden zu identifizieren, durch die Einbeziehung quantitativer Metabolit Informationen gekoppelt war über NMR und Identifizierung von größeren Sekundärmetaboliten über FTICR-Frau etwas anders, MPLex, beginnen wir das Protokoll mit einem Wasserextraktion und dann Verwendung sequentielle Extraktion mit zunehmend unpolaren Lösungsmitteln. Alle Extraktionen erfolgen auf einer einzigen Probe die Probe konserviert, wenn Volumen begrenzt oder schwer zu beschaffen sind und experimentellen Fehler eingeführt durch Unterschiede zwischen den Aliquoten aus heterogenen Stichprobe Matrizen (z.B., Erde und Torf) verringert oder Unterschiede in der Lagerbedingungen und Dauer.
Schließlich können wir durch die Kopplung der OM-Analysen mit Proteomics Analysen der mikrobiellen Gemeinschaft, metabolische Netzwerke aufbauen, die die Wege und die Transformation der Abbau organischer Materie zu beschreiben. Dies ermöglicht uns, testen Sie spezifische Hypothesen, wie Störungen des Systems ultimative CO2 und CH4 Produktion durch Änderung der vorhandenen organischen Substrate, Elektronen-Akzeptoren und mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen wird Vermittlung der Reaktionen über die Aktivität des Enzymkatalysatoren.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein einzelnes Durchsatz-Protokoll zur Verfügung stellen für die Analyse von Metaboliten, Lipide und mikrobielle Proteine aus einer einzigen Probe, wodurch eine vollständig gekoppelte Dataset für metabolische Netzwerke aufzubauen, während analytische Fehler einschränken .

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		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

Natürliche organischer Substanz (NOM) besteht aus eine hochkomplexe Mischung aus Tausenden von organischen Verbindungen, die in der Vergangenheit zur Charakterisierung schwierig erwiesen. Jedoch gekoppelt um die thermodynamischen und kinetischen Steuerelemente auf (Kohlendioxid [CO2] und [CH4] Methan) Treibhausgasproduktion infolge der Zersetzung des NOM zu verstehen, eine Charakterisierung molekularer Ebene mit mikrobiellen Proteom-Analyse ist notwendig. Darüber hinaus sollen Klima- und Umweltveränderungen natürlicher Ökosysteme, potenziell stören komplexe Interaktionen, die Einfluss auf die Versorgung mit organischer Substrate und die Mikroorganismen die Transformationen durchführen, lassen. Eine detaillierte molekulare Charakterisierung der organischen Substanz, mikrobielle Proteomics und die Wege und Transformationen, die durch die organischer Substanz zersetzt ist werden die Richtung und das Ausmaß der Auswirkungen von Veränderungen der Umwelt vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt einen methodischen Durchsatz für umfassende Metabolit Charakterisierung in einer einzigen Probe durch direkte Injektion Fourier Transform Ion Zyklotron Resonanz Massenspektrometrie (FTICR-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Kernresonanzspektroskopie (NMR), Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Proteomics Analysen. Das Ergebnis ist ein vollständig gepaart Dataset, das verbessert die statistische Zuverlässigkeit für Wege der Abbau organischer Materie, die sich daraus ergebenden CO2 und CH4 Produktionsraten und ihre Antworten auf ökologische Störung ableiten. Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Anwendung dieser Methode auf NOM Proben aus Mooren; das Protokoll ist jedoch für jede NOM-Probe (z. B. Torf, bewaldeten Böden, marinen Sedimenten, etc.).

Wir die beschriebenen ergänzenden Analyse-Protokoll durchgeführt und verglichen Torf mit Tiefe im S1 Moor in der Fichte und Mooren Antwort unter wechselnden Umgebungen (Fichte) Website in Minnesota, USA. Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu denen aus dem Permafrost Moor und Fen aus Nordschweden zu zeigen, wie Websites in Metaboliten und Enzym-Aktivitäten variieren können. Wir identifizierten 3.312 Enzyme in der Proteomik-Analyse. Eine Analyse der Aktivitäten der Enzyme mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme sc...

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur umfassenden, unvoreingenommenen molekularen Charakterisierung einer einzelnen Probe unter Verwendung sowohl der Massenspektrometrie, der Metabolomik, Proteomik und Lipidomik als auch der Kernspinresonanzspektroskopieplattformen. Die Bedeutung dieses Ansatzes besteht darin, dass wir ein biologisches System charakterisieren können, das dem Genom nachgelagert ist, indem wir verschiedene Arten von Molekülen identifizieren, so dass wir Stoffwechsel- und Zersetzungswege ableiten können. Sequential Extraction Technique, ermöglichen die Extraktion von bioverfügbaren, polaren Verbindungen mit Wasser, gefolgt von MPLEx, um alle zusätzlichen polaren Verbindungen oder Metaboliten sowie Proteine und Lipide aus einer einzigen Probe zu erfassen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie den Wissenschaftler durch die Trennung der drei Ebenen während des zweiten Extraktionsschritts und die Aufteilung der Extrakte auf verschiedene Analyseinstrumente führt. Integrative multi-omische Analysen ermöglichen effektivere Untersuchungen und ein vollständiges Verständnis komplexer biologischer Systeme. Diese robuste Methode extrahiert eine große Vielfalt an Molekülen und ist auf verschiedene Probentypen anwendbar.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung und Vorbereitung der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit einem Ethanol gewaschen, Edelstahl-Utensil, aliquot 50 Milligramm jeder der getrockneten Proben in einzelnen zwei Milliliter Glasröhren. Fügen Sie jeder Probe einen Milliliter destilliertes, entgastes Wasser hinzu.Dann die Fläschchen kappen und zwei Stunden lang auf einem Shaker-Tisch schütteln. Zentrifugieren Sie die Proben mit 15 Tausend Mal Schwerkraft für 30 Minuten. Und dann lassen Sie die Lösungen bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen.Dekant und speichere den Überstand aus jeder Probe. Führen Sie eine MPLEx-Extraktion auf den nun wasserextrahierten Rückständen durch Wiederholung dieser Extraktionsschritte durch. Außer ein minus 20 Grad Celsius vier bis drei Chloroform zu Methanolgemisch für das destillierte, entgaste Wasser zu ersetzen.Trennen Sie sorgfältig die beiden resultierenden Lösungsmittelschichten, die durch das Entfernen der obersten Schicht durch sorgfältiges Pipetieren visuell unterscheidbar sind. Trocknen Sie die untere nichtpolare Schicht im Gefriertrockner. Sobald es trocken ist, fügen Sie fünf Mikroliter Chloroform und 195 Mikroliter Methanol, wenn sie innerhalb der nächsten tage.Zur Verbesserung der Elektrospray-Ionisationseffizienz für die Vierier-Transform-Ionen-Zyklon-Resonanzmassenspektrometrie, abgekürzt FTICR-MS durch Direkteinspritzung. Den Chloroform-Extrakt eins zu eins in Methanol verdünnen und das Wasser zwei zu eins in Methanol extrahieren. Kalibrieren Sie das FTICR-Spektrometer, indem Sie direkt 100 Mikroliter einer Tuning-Lösung in den FTICR-MS in einen Massenbereich von etwa 100 bis 1.300 Daltons einspritzen.Direkte Injektion von 100 Mikrolitern des Suwannee River Fulvic Acid Standards in die Elektrospray-Ionisationsquelle. Gekoppelt mit dem FTICR-Spektrometer durch eine Spritzenpumpe, die auf eine Durchflussrate von 3,0 Mikroliter pro Minute eingestellt ist. Stellen Sie die Nadelspannung auf positive 4,4 Kilovolt ein.Warteschlange eins bis 100 Masse-Zu-Lade-Verhältnis und die Glaskapillare bei 180 Grad Celsius. Überprüfen Sie die resultierenden Spektren mit der Analysesoftware, um die Qualität der Daten zu bestätigen. Bringen Sie nun 100 Mikroliter jedes Extrakts per Direkteinspritzung in die Elektrospray-Ionisationsquelle ein, gekoppelt an das FTICR-Spektrometer durch eine Spritzenpumpe, die auf eine Durchflussrate von 3,0 Mikroliter pro Minute eingestellt ist.Legen Sie die Parameter wie zuvor fest. Passen Sie die Ionenakkumulationszeit für jede Probe oder Gruppe von Proben an, um die Variation der Kohlenstoffkonzentration zu berücksichtigen. Sammeln Sie 144 Scans für jede Probe, durchschnittlich die Scans und führen Sie dann eine interne Kalibrierung mit einer homologen CH2-Serie durch.Trocknen Sie die Extrakte mit einem Konzentrator und speichern Sie den Rest der Extrakte für die anschließende Gaschromatographie-Massenspektrometrie, flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie-Analyse. Zur Vorbereitung auf GC-MS bereiten Sie zunächst leere Kontrollbeispiele vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Zum Schutz von Carbinolgruppen fügen Sie 20 Mikroliter 30 Milligramm pro Milliliter Methoxaminhydrochlorid in Paradyne zu jeder der Proben hinzu, einschließlich der Methanolextrakte, der Wasserextrakte, der Rohlinge und der FAME-Kalibrierungsproben.Versiegeln Sie die Fläschchen mit Kappen. Wirbeln Sie die Extrakte für 20 Sekunden, dann beschallen Sie die Extrakte für 60 Sekunden. Zentrifugieren Sie die Extrakte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten bei 100-facher Schwerkraft.Fügen Sie 80 Mikroliter MSTFA mit 1%Trimethylchlorsilan zu jeder Probe hinzu. Nach dem Wirbeln und Beschallen der Extrakte wie bisher zentrieren Sie die Extrakte wieder bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bei 100-facher Schwerkraft. Nach dem Abkühlen der Extrakte auf Raumtemperatur in GC-MS Autosampler-Fläschchen übertragen.Fahren Sie mit der GC-MS-Analyse und -Datenverarbeitung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um sich auf die NMR-Analyse im Flüssigzustand vorzubereiten, verdünnen Sie den Rest der Wasserextrakte mit einem internen Standard von fünf Millimolaren DSS um 10 %. Übertragen Sie das Gemisch in ein hochwertiges Borosilikatglas NMR-Rohr mit einem Außendurchmesser von drei Millimetern.Fahren Sie mit der NMR-Analyse und -Datenverarbeitung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die LC-MS-Lipidomik-Analyse durchzuführen, injizieren Sie 10 Mikroliter jedes Extrakts in ein Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiesystem, gekoppelt mit einem Orbitrap-Massenspektrometer mit einer umgekehrten Phasen-geladenen Oberflächenhybridsäule. Legen Sie einen 34-minütigen Farbverlauf fest, der im Textprotokoll mit einer Durchflussrate von 250 Mikrolitern pro Minute aufgeführt ist.Verwenden Sie sowohl negative als auch positive Ionisationsmodi mit höherer Energiekollisionsdissoziation und kollisionsinduzierter Dissoziation. Um die Proteomikanalyse durchzuführen, extrahieren Sie zunächst Proteine gemäß dem MPLEx-Protokoll für den Rest der Methanolphase, wie im Textprotokoll beschrieben. Torf wurde mit der Tiefe im S1-Moor am Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments oder SPRUCE-Standort in Minnesota, USA, verglichen.3, 312 Enzyme wurden in der Proteomik-Analyse identifiziert. Eine Analyse der Enzymaktivitäten mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme im SPRUCE Bog zwischen 15 Zentimetern und 45 Zentimetern stark zurückgeht. Um zu zeigen, wie sich die Standorte bei Metaboliten- und Enzymaktivitäten unterscheiden können, werden die SPRUCE-Ergebnisse mit denen eines Permafrost-Moores und Fens in Nordschweden verglichen.Insgesamt wurden 67 040 Metaboliten in allen SPRUCE Peat Proben aus der Kombination von FTICR-MS-, NMR-, GC-MS- und LC-MS-Analysen identifiziert. Hier ist der relative Anteil verschiedener chemischer Klassen dargestellt, der durch verschiedene Techniken in den verschiedenen Tiefen identifiziert wird. Während Aminosäuren und Zucker mit der Tiefe abnehmen, wird dies bei Lipiden nicht beobachtet.Durch kreuzvalidierende Metaboliten, die in allen Analysen gegen die KEGG-Datenbank identifiziert wurden, wurde festgestellt, dass die identifizierten Verbindungen an gemeinsamen Stoffwechselwegen wie Tricarbonsäurezyklus, Glykolyse und Zuckerstoffwechsel beteiligt sind. Während dieses gesamten Verfahrens ist es wichtig, sich der potenziellen Kontaminationsquellen bewusst zu sein. Ab der Probenentnahme sollten Proben nicht mit gezischen Kunststoffen in Berührung kommen, die sich negativ auf die Ionisierung auswirken können.Viele der während des Extraktionsverfahrens verwendeten Lösungsmittel sind gefährlich oder entzündlich. Tragen Sie immer geeignete PSA, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden, sowie um eine Kontamination von Proben zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Environment

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Forschung

Umwelt

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Bewertung von Labile organischer Kohlenstoff im Boden Mit Sequential Begasung Incubation Procedures

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

Organische Substanzen Biogeochemie Gelöster Verständnis durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nährstoff Manipulations in Stream-Ecosystems

Dissolved organic matter (DOM) is a highly diverse mixture of molecules providing one of the largest sources of energy and nutrients to stream ecosystems. ...

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

Automatisierte, hochauflösende Mobilsammelsystem für die Stickstoffisotopenanalyse von NO<sub&gt; x</sub

Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in a Flow Tube Reactor

Herstellung und Messung von organischen Partikeln in einem Flow Rohrreaktor

Organic particulate matter (PM) is increasingly recognized as important to the Earth's climate system as well as public health in urban regions, and the ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Herstellung und Messung von organischen Partikeln in der Harvard-Klimakammer

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Improving Infrared Spectroscopy Characterization of Soil Organic Matter with Spectral Subtractions

Verbesserung der Infrarot-Spektroskopie Charakterisierung der organischen Bodensubstanz mit spektralen Subtraktionen

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Beurteilung der Feinstaub entfernen Fähigkeiten des Baumes Blätter

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...