Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures at JoVE.com

ברצוננו להודות ג'יי. פי Chanton במקום Kostka, קולטון ועותרת לקבלת סיוע עם איסוף דגימות כבול. חלקים של עבודה זו נערכו במעבדה סביבתיים מולקולרית מדעי, DOE Office של המשתמש מתקן מדעי בחסות את Office הביולוגיים ואת המחקר הסביבתי. PNNL מופעל על ידי Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC05-76RL01830. עבודה זו נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, המחקר הביולוגי של משרד איכות הסביבה (מענקים: דה-AC05-00OR22725, דה-SC0004632, DESC0010580, דה-SC0012088 ו- DE-SC0014416).

1. רציפים הפקת חומר אורגני בקרקע, משקעים או כבול
<ol><li>לאסוף את הקרקע, משקעים או כבול ויה גלעון ולחלק ליבות על-פי ההשערה הנבדקת (למשל, עומק). דוגמאות לחנות טפלון מצופה מכולות ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לפני ניתוח. הערה: כ- 25 מ ג ג יש צורך עבור פרוטוקול זה. עבור כבול (בדרך כלל 45% C),...

<ol>
	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+dissolved+organic+matter+quality+in+a+peatland+and+forest+headwater+stream+as+a+function+of+seasonality+and+hydrologic+conditions.">Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions.</a> Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).</li><li>Ejarque, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+and+reactivity+of+dissolved+organic+matter+in+a+Mediterranean+river+across+hydrological+and+spatial+gradients.">Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients.</a> Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).</li><li>Valenzuela, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+methane+oxidation+driven+by+microbial+reduction+of+natural+organic+matter+in+a+tropical+wetland.">Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).</li><li>Lehmann, J., Kleber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contentious+nature+of+soil+organic+matter.">The contentious nature of soil organic matter.</a> Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).</li><li>Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+oxygen+limitations+under+recognized+regulators+of+organic+carbon+turnover+in+upland+soils?.">Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils?.</a> Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).</li><li>LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+natural+organic+matter:+A+thermodynamic+analysis.">Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenation+of+organic+matter+as+a+terminal+electron+sink+sustains+high+CO2:+CH4+production+ratios+during+anaerobic+decomposition.">Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition.</a> Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).</li><li>Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoacetogenesis:+A+potentially+underappreciated+carbon+pathway+in+peatlands.">Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands.</a> Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).</li><li>Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+beyond+global+warming+potentials+to+quantify+the+climatic+role+of+ecosystems.">Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems.</a> Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Constrained+Projections+of+Methane+Fluxes+in+a+Northern+Minnesota+Peatland+in+Response+to+Elevated+CO2+and+Warming.">Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).</li><li>Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+hydrogen+to+methane+production+and+control+of+hydrogen+concentrations+in+methanogenic+soils+and+sediments.">Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments.</a> Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).</li><li>Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+dynamics+of+dissolved+methane+in+lakes+of+the+Mackenzie+Delta+and+the+role+of+carbon+substrate+quality.">Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).</li><li>Wilson, R. M., Tfaily, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+molecular+techniques+provide+new+rigorous+tools+for+characterizing+organic+matter+quality+in+complex+systems.">Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).</li><li>Borton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+laboratory+and+field+investigations+resolve+microbial+interactions+that+underpin+persistence+in+hydraulically+fractured+shales.">Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales.</a> Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).</li><li>Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+competition+and+the+linear+dynamic+range+of+detection+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).</li><li>Boiteau, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Elucidation+of+Unknown+Metabolites+in+Metabolomics+by+Combined+NMR+and+MS/MS+Prediction.">Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction.</a> Metabolites. 8 (1), 8 (2018).</li><li>Walker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unambiguous+Metabolite+Identification+in+High-throughput+Metabolomics+by+Hybrid+1DNMR/ESI+MS+Approach.">Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).</li><li>Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MPLEx+Protocol+for+Multi-omic+Analyses+of+Soil+Samples.">The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples.</a> J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+fatty+acid.">Extraction of fatty acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Tolic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formularity:+software+for+automated+formula+assignment+of+natural+and+other+organic+matter+from+ultrahigh-resolution+mass+spectra.">Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra.</a> Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+metabolomics+analysis+of+a+hot+spring+chlorophototrophic+microbial+mat+leads+to+new+hypotheses+of+community+member+metabolisms.">Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms.</a> Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).</li><li>Hiller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboliteDetector:+comprehensive+analysis+tool+for+targeted+and+nontargeted+GC/MS+based+metabolome+analysis.">MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).</li><li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiehnLib:+mass+spectral+and+retention+index+libraries+for+metabolomics+based+on+quadrupole+and+time-of-flight+gas+chromatography/mass+spectrometry.">FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).</li><li>Kyle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIQUID:+an-open+source+software+for+identifying+lipids+in+LC-MS/MS-based+lipidomics+data.">LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data.</a> Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).</li><li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+annotation+and+metabolic+reconstruction+using+KEGG.">Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG.</a> Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).</li><li>Van Krevelen, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical-statistical+method+for+the+study+of+structure+and+reaction+processes+of+coal.">Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal.</a> Fuel. 29, 269-284 (1950).</li><li>Hodgkins, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+peat+chemistry+associated+with+permafrost+thaw+increase+greenhouse+gas+production.">Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).</li></ol>

יחיד-התפוקה, זרם מצמידים במלואו ניתוח שימוש כדי לאפיין מטבוליטים, את פרוטאום מספק תובנות מסלולים מאת C איזה רכיבה על אופניים היא היווצרותן של מערכת אקולוגית מורכבת. אדמה, כבול הן מטריצות הטרוגנית, לכן, אחד הצעדים הקריטיים של שיטה זו מתרחשת בשלבים המוקדמים ביותר להבטיח כי ההתחלה כבול או אדמ?...

ברחבי העולם, ביצות מוערך להכיל עמוד 529 של פחמן (C), בעיקר בתור C אורגני קבורה כבול פיקדונות1. כיום, peatlands כזה לשמש כיור C נטו, sequestering 29 y Tg ג-1 ב צפון אמריקה לבד1. עם זאת, הפרעה סביבתיים כגון ניקוז, שריפות, הבצורת בטמפרטורות חם ניתן להסיט את הכיור C הזה על-ידי הגברת פירוק חומר אורגני וכתוצאה מכך הפסדים C מוגבר באמצעות גז חממה (פחמן דו-חמצני [CO2] ו 1,לייצור מתאן [CH4])2. שינויי אקלים עשויים לתרום הפסד C אם הטמפרטורות חם או תנאים מייבש לעורר הפירוק C מהר יותר על-ידי מיקרואורגניזמים. לחלופין, טמפרטורות גבוהות יותר אוויר CO2 ריכוזים עשוי לעורר הייצור הראשוני לבודד CO עוד2 בתור פחמן אורגני (OC). באיזו מידה, כמה מהר זה OC מפורקת ואז לתוך CO2 ו- CH4 תלוי הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התורם של אלקטרון, הזמינות של אלקטרון acceptors המיקרואורגניזמים לתווך טרנספורמציה. במקרים רבים, המנגנונים אינם מאופיין היטב, ובכך את תגובתם לפליטת הסביבה אינה מוגבלת היטב, עדיין לא ברור מה יהיה התוצאה הסופית של שינוי האקלים על איזון פחמן peatland מערכות אקולוגיות.
האופי המורכב של חומר אורגני טבעי (NOM) הפך אפילו לזהות את תרכובות אורגניות נוכח תערובות NOM קשה מבחינה היסטורית. ההתקדמות האחרונה שיפרנו בגדול את היכולת לאפיין תרכובות באופן מסורתי זה ולהמשיך, במידה מסוימת, להיחשב הסרבן רקבובי או fulvic תרכובות3,4,5. עכשיו הבנו כי רבים של תרכובות אלו זמינים למעשה microbially, עשוי להיות מפורקת אם מקבל אלקטרון מסוף מתאימים (תה) זמין6,7. חישוב מצב חמצון הנומינלי של הפחמן (NOSC) עבור תרכובת מספק מדד של ניבוי הפוטנציאל הפירוק, את התשואה אנרגיה של התה הנדרש. עם זאת, זה דורש אפיון מולקולרי ברמת של חומר אורגני7. NOSC מחושבת על פי נוסחה מולקולרית באמצעות המשוואה הבאה7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − − 3(#N) 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, כאשר z הוא המטען נטו. NOSC הוא מתואם עם תרמודינמי נהיגה כוח8, שבו תרכובות עם NOSC גבוהה יותר קלים לבזות, בעוד תרכובות עם NOSC נמוך יותר דורשים יותר ויותר אנרגטיים תה כדי להיות מופחת. מתחמים עם NOSC פחות −2 דורשים אנרגיה גבוהה מניבים תה כגון O2, חנקתי או Mnהרביעי, לא יכול להיות מושפל על ידי המתרחשים בדרך כלל נמוך אנרגיה מניבים תה כגון Feהשלישי או חומצה גופרתית7. זהו שיקול חשוב בתנאים אנאוקסיים רטוב נמצאו מקווי מים בהם O2 ואנרגיה גבוהה אחרים מניבים תה נדיר9 , ולכן הם ההשפלה של תרכובות NOSC התחתון בתנאים האלה למה מוגבלת. פרטורבציה סביבתיים יכולים להשפיע על ה תרמודינמי של המערכת האקולוגית באמצעות הידרולוגיה שינויים המשפיעים על O2 (הכי אנרגטית אלקטרון מקבל), שינויים מצעים אורגני אלקטרון acceptors זמין על-ידי ראשי הפקה, ולא במידה קטנה יותר על ידי טמפרטורה. דוגמה חשובה של ההשפעות טמפרטורה במערכות המלחות מתרחשת לגבי החלופה המתרחשת בין homoacetogenesis (קרי, אצטט הפקה של CO2 ו- H2) hydrogenotrophic methanogenesis ( כלומר, CH4 הפקה של CO2 ו- H2). בטמפרטורות נמוכות נראה ש-homoacetogenesis הזה הוא מעט המועדף, בעוד בטמפרטורות חם יותר טובה CH4 ייצור10. אפקט זה טמפרטורה שיש השלכות חשובות על התגובה של מערכות אקולוגיות לשינוי האקלים, כמו CH4 הוא גז חממה הרבה יותר חזק מאשר CO211 ובכך הגדלת הייצור של CH4 -חשבון של CO2 בטמפרטורות חם עשויים לתרום משוב חיובי עם התחממות האקלים.
Peatlands מייצרים כמויות משמעותיות באופן גלובלי של CO2 , CH46באמצעות נשימה מיקרובית של באופן טבעי אורגני משנה. NOSC של סובסטרטים פחמן אורגני קביעת חלקם היחסי של CO2: CH4 המיוצר אשר הוא פרמטר קריטי בגלל גבוה יותר קרינה לאלץ CH4 בהשוואה ל- CO211, אלא גם בגלל מידול המאמצים זיהו את היחס הזה כפרמטר קריטי עבור הערכת השטף C peatlands12. בהיעדרו של אלקטרון מסוף acceptors חוץ CO2, ניתן להראות על ידי אלקטרון איזון כי מצעים אורגני C עם NOSC > 0 רצון לייצר CO2: CH4 > 1, C אורגני עם NOSC = 0 יוצרת CO2 ו- CH4 יחס equimolar, ו C אורגני עם NOSC < 1 יפיק CO2: CH-4 -< 1-13. פירוק של OC ב הטבעיות מתווך על ידי מיקרואורגניזמים, כך גם כאשר השפלה של מתחם מסוים הוא למה ריאלי, זה kinetically מוגבל על ידי הפעילות של אנזימים מיקרוביאלי, בתנאים אנאוקסיים, מאת תרמודינמי הדוחף (קרי, NOSC)7. עד עכשיו זה מאתגר לאפיין באופן מלא את החומר האורגני כי המגוון של תרכובות דורשת טכניקות שונות משלימים עבור האפיון שלהם. התפתחויות אחרונות יש סגר את הפער; באמצעות חבילת בשיטות אנליטיות אנחנו ניתן לנתח את מגוון רחב של תרכובות אורגניות מתן אפיון מולקולרי ברמת, כימות מקרים מסוימים, של מטבוליטים ראשי קטן כמו גלוקוז עד 800 Da פולי-heterocycles. בעבר מולקולות מורכבות גדולים כאלה כבר שאפיינו פשוט כמו כמו ליגנין או דמוי טאנין, בדוי כדי להיות עקשניים. אפיון מולקולרי ברמת, עם זאת, מאפשר חישוב NOSC עבור מולקולות מורכבות גדולה אפילו אלה. ערכים אלה NOSC הן באופן ליניארי בקורלציה עם הכוח המניע תרמודינמי ומאפשר הערכה של איכות חומר אורגני זמין עבור פירוק, אשר במקרים רבים מגלה כי מולקולות מורכבות אלה עשוי למעשה להיות microbially מתכלה אפילו בתנאים אנאוקסיים הקיימות בביצות.
מאז כניסתה של O2 מאפשר חומר אורגני של כמעט כל הערכים NOSC נצפתה באופן טבעי להיות מפורקת, במסמך זה אנו מתמקדים השינויים חומר אורגני ו פרוטאומיקס חיידקים אשר צפויים להיות הנהגים ראשי בביצות (קרי, O מוגבל2) מערכות. עם זאת, כל הטכניקות שבהן נדון ניתן ליישם חומר אורגני של כל המערכת האקולוגית. בדרך כלל, בצובר מדדים המבוססים על אופטי, ניתוחים פלורסצנטיות שימשו להערכת חומר אורגני איכותי3,14. בעת שימוש בצובר מדידות כאלה, עם זאת, הפרטים אינם נשמרים כפי מספר רב של מולקולות מסווגים יחד בתנאים כלליים כמו humics או fulvics. ההגדרות של קטגוריות אלה אינם מוגבל היטב והם, למעשה, עשויים להשתנות אפשרי מחקר כדי לימוד ביצוע השוואות. עוד, מדידות בצובר לא לספק הפירוט מולקולרית הדרושים לחישוב את התרמודינמיקה המסדירים את המערכת, ולכן נופל קצר באמת הערכת איכות חומר אורגני15.
טכניקות בודדים כגון פורייה להפוך יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, גז כרומטוגרפיה המוני מסות (GC-MS) ולבצע כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS) לספק בכזה פירוט ברמה המולקולרית. בעוד כל אחת מהטכניקות הללו מציג את מגבלותיה, הם הביאו את נקודות החוזק שלהם זה ניתן למנף בגישה משולבת כדי להשיג את הפרטים מולקולרית בסדר הכרחי עבור לכימות איכות חומר אורגני במובן תרמודינמי קפדני . GC-MS שימושית לזיהוי מטבוליטים קטן קריטי כי צפויים proximal השפעה על CO2 ו- CH4 הייצור (למשל, גלוקוז, אצטט, וכו '); עם זאת, GC-MS דורש אימות מול תקן ולכן מוגבלת תרכובות ידועות כבר קיים במסד הנתונים מונע זיהוי של תרכובות הרומן. יתר על כן, GC-MS היא טכניקה למחצה איכותי המאפשר הסקה על השינויים בריכוזים יחסית, אבל לא מספק בפועל ריכוז המידע הדרוש לחישוב חינם אנרגיות של גיב לדוגמה. לבסוף GC-MS דורש derivatization של מולקולות לפני ניתוח אשר מגביל את הרזולוציה כדי תרכובות קטן מ- Da ~ 400, כהלים נדיף אובדים במהלך השלב ייבוש.
חד-ממדי (1 ד) 1H למצב נוזלי NMR מאפשרת אפיון כמותי מאוד קטנה מטבוליטים (לרבות מטבוליטים העיקרי משקל מולקולרי קטן שיכללו חומרים נדיפים כמו כהלים, אצטט, אצטון, formate, פירובט, succinate, כבל קצר חומצות שומן, כמו גם מגוון של פחמימות לשמצה נעדר או פרוץ מפעולות שירות מבוססי MS) ריכוזים שלהם הם שימושיים במיוחד לצורך חישוב פרמטרים תרמודינמי. ובכל זאת, כמו GC-MS, 1 י NMR של תערובות מורכבים דורש תקינה יחסית מסד נתונים, ולכן לא לבד לאפשר זיהוי קל של תרכובות הרומן כי צפויים להיות בשפע מורכבות מערכות אקולוגיות טבעיות ומשתנה. בנוסף, NMR רגיש פחות מאשר טכניקות מבוססות MS. לכן, יצירת פרופילים המטבוליט כמותיים מושגת רק מעל 1 מיקרומטר באמצעות NMR מערכות מצויד מקורר הליום קר-הגששים. NMR קצת קר-הגששים מוערך לא נרחב, מלח-סובלניים ולאפשר ניתוח הסביבה תערובת בנוכחות ריכוזי מלח millimolar בשימוש קטנים בקוטר (הקוטר החיצוני < 3 מ מ) מדגם צינורות16. עם זאת, זה סיבוך נוסף של NMR כמויות גבוהות של מתכות פאראמגנטיים ומינרלים (למשל, Fe ו- Mn מעל % wt 1-3), אשר יכול להיות שופע בקרקעות בתוליים, ניתן להרחיב תכונות ספקטרליות, לסבך את הפרשנות של ספקטרום NMR . באמצעות מיצוי מעבדתי (SPE) ניתן עוזרו של פרשנות של NMR והן מבוססות MS מטבולומיקס בשיטות על-ידי הפחתת מלחים מינרליים והגברת איכות ספקטרלי.
FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה היא טכניקה רגישה מאוד מסוגלת לאתר עשרות אלפי מטבוליטים של דוגמה אחת, אבל זה לא ללכוד מטבוליטים קטן קריטיים כגון אצטט, פירובט succinate והוא שקשה לחסלם השתמש עבור סוכרים, פחמימות אחרות17, ואינה מספקת מידע כמותי. אולם, בניגוד טכניקות אחרות, FTICR-MS מצטיין זיהוי והקצאת נוסחה מולקולרית תרכובות הרומן, ולכן מזהה את המספר הגדול ביותר של תרכובות מתן מידע מולקולריות יותר מאשר בכל אחת מהטכניקות שתואר אחרים. דבר זה שימושי, כי המידע מולקולרית FTICR-MS (וטכניקות אחרות) יכול לשמש כדי לחשב את NOSC הקשורה הכוח המניע תרמודינמי המסדירים את הסבירות של תגובות מסוימות8 והתעריפים שלהם תחת מסוימים תנאים7. יתר על כן, על ידי צימוד FTICR-MS עם טכניקות הפרדה, כגון LC יחד עם טנדם MS, כמותיים מבניים בר השגה, קיזוז חלק מהחסרונות של טכניקה זו. LC-MS שימושית לזיהוי חומרים דמויי השומנים, אחרים מטבוליטים שאינם מאופיין היטב על ידי כל אחד השיטות האחרות. צימוד LC FTICR-MS או LC-MS עם שברים של אלמונים מסוימים עניין הבהרה מבנית של אספן שבר ואיסוף דו-ממדית (2D) נוזלי המדינה ש-NMR הוא המצב האידיאלי בזיהוי וכימות לא ידוע תרכובות18 ,19. עם זאת, זהו צעד שצורכת שיכול לשמש אם וכאשר הדרושים. לקחו בנפרד, כל אחת מהטכניקות הללו מספקים תמונה שונה של החומר האורגני, על ידי שילוב אותם, נוכל להשיג הבנה מלאה יותר מאשר שימוש בכל אחת מהטכניקות בבידוד.
בעוד השיקולים תרמודינמי להגדיר את האילוצים האולטימטיבי איזה העתקות אפשריים במערכת, פירוק חומר אורגני מתווך על ידי מיקרואורגניזמים שפעילותם אנזים לשלוט שיעורי התגובה. לכן, אני מבין הפקדים פירוק חומר אורגני ובסופו של דבר החממה הפקת גז (CO2 ו- CH4) מן הביצות דורש גישה משולבת טכנולוגיות אפיון פעילות האנזים מיקרוביאלית כמו גם המטבוליטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להשגת ניתוח מקיף של דוגמה אחת שימוש בגישה סדרתית שתוצאתו ניתוח מלא לזווג. גישה זו מרחיבה על מטבוליט, חלבונים, שומנים בדם החילוץ (MPLex) פרוטוקול שבו פרוטאומיקס היה בשילוב עם GC-MS ו- LC-MS20 כדי לזהות קטנה מטבוליטים, חלבונים ושומנים על-ידי שילוב מידע כמותי מטבוליט ויה NMR וזיהוי של גדול מטבוליטים משניים ויה FTICR-גב' מעט שונה MPLex, אנו מתחילים את הפרוטוקול עם שאיבת מים, ואז השתמש החילוץ רציפים עם ממיסים יותר ויותר לא קוטביים. כל עקירות נעשות על מדגם יחיד אשר חוסך לדוגמה כאשר אמצעי אחסון מוגבל או קשה להשיג, הקטנת השגיאה ניסיוני הציג דרך וריאציה בין aliquots מ מדגם הטרוגנית מטריצות (למשל, אדמה, כבול) או ההבדלים בין תנאי אחסון ומשך.
לבסוף, על-ידי התאמת הניתוחים אום עם פרוטאומיקס ניתוחים של הקהילה מיקרוביאלי, נוכל לבנות רשתות מטבוליות המתארים את המסלולים ואת הפיכתו של פירוק חומר אורגני. זה מאפשר לנו לבדוק היפותזות ספציפיות על איך תשפיע לפליטת למערכת CO האולטימטיבי2 ו- CH4 ייצור באמצעות שינוי של מצעים אורגני זמין, אלקטרון acceptors של הקהילות מיקרוביאלי בתיווכן של תגובות באמצעות הפעילות של אנזימים מזרזים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק תפוקה יחיד פרוטוקול לניתוח מטבוליטים, שומנים, חלבונים מיקרוביאלי מתוך מדגם יחיד ובכך יוצר dataset לזווג מלא לבניית רשתות מטבוליות תוך הגבלת משגיאות אנליטיות .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1067px;" width="1065">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

חומר אורגני טבעי (NOM) מורכבת תערובת מורכבת מאוד אלפי תרכובות אורגניות שהוכיח עצמו, מבחינה היסטורית, קשה לאפיין. עם זאת, כדי להבין את הפקדים תרמודינמי, קינטי החממה הפקת גז (פחמן דו-חמצני [CO2] ו- [CH4] מתאן) הנובע הפירוק של NOM, אפיון מולקולרי ברמת בשילוב עם חיידקים פרוטאום ניתוח הכרחי. יתרה מזאת, אקלים ושינויים סביבתיים צפויים perturb הטבעיות, שעשוי להיות מעצבן לאינטרקציות מורכבות המשפיעים על אספקת מצעים חומר אורגני וגם מיקרואורגניזמים ביצוע העתקות. אפיון מולקולרי מפורט של חומר אורגני, מיקרוביאלי פרוטאומיקס, ואת המסלולים המרות שלפיו מפורקת חומר אורגני יהיה צורך לחזות את הכיוון ואת הגודל של ההשפעות של שינויים סביבתיים. מאמר זה מתאר קצב מתודולוגי אפיון מקיף מטבוליט דגימה בודדת על-ידי הזרקה ישירה פורייה המרה יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), גז כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (GC-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS), וניתוח פרוטאומיקס. גישה זו גורמת dataset מצוייד במלואו, אשר משפר את אמון סטטיסטי עבור מסיקים מסלולים של פירוק חומר אורגני, ה-CO הנוצרת2 קצב ייצור4 CH, ואת התגובות ההפרעות הסביבה שלהם. במסמך זה אנו מציגים תוצאות החלת בשיטה זו NOM דגימות נאספו מ peatlands; עם זאת, הפרוטוקול חל דוגמה NOM (למשל, כבול, מיוער קרקעות, משקעים ימיים, וכו ').

אנו לבצע את הפרוטוקול המתואר ניתוח משלימים, בהשוואה כבול עם עומק לביצה S1 באתר אשוחית, Peatlands תגובה תחת שינוי סביבות (אשוחית) במינסוטה, ארה ב. תוצאות אלו מושווים לאלו שקיבלו והטראגי, הפן משוודיה הצפוני כדי להראות כמה אתרים עשויים להשתנות בפעילויות מטבוליט של אנזים. זיהינו אנזימים 3,312 בניתוח פ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures at JoVE.com

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

פרוטוקול זה מתאר את השיטה לאפיון מולקולרי מקיף ובלתי משוחד של מדגם יחיד באמצעות ספקטרומטריית מסה, באמצעות מטבולומיקה, פרוטומיקה וליפידמיקה, ופלטפורמות ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית. המשמעות של גישה זו היא שאנחנו יכולים לאפיין מערכת ביולוגית במורד הזרם של הגנום, באמצעות זיהוי סוגים שונים של מולקולות, המאפשר לנו להסיק מסלולים מטבוליים פירוק. טכניקת מיצוי רציפה, לאפשר מיצוי של bioavailable, תרכובות קוטב באמצעות מים, ואחריו MPLEx כדי ללכוד כל תרכובות קוטביות נוספות או מטבוליטים, כמו גם חלבונים ושומנים מדגם אחד.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית משום שהיא מנחה את המדען באמצעות הפרדת שלוש השכבות במהלך שלב החילוץ השני, ופיצול התמציות בין מכשירי ניתוח שונים. ניתוחים רב-אטומיים אינטגרטיביים מעצימים חקירות יעילות יותר והבנה מלאה של מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטה חזקה זו מחלצת מגוון רחב של מולקולות והיא ישימה לסוגי מדגם מגוונים.התחל הליך זה עם איסוף והכנת הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות אתנול שטף, כלי נירוסטה, aliquot 50 מיליגרם של כל דגימות מיובשות לתוך צינורות זכוכית בודדים שני מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים, מנוגזים לכל מדגם.לאחר מכן מכסים את הבקבוקונים ומנערים במשך שעתיים על שולחן שייקר. צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 פעמים כבידה במשך 30 דקות. ואז לאפשר את הפתרונות לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.Decant ולשמור את supernatant מכל מדגם. לנהל מיצוי MPLEx על שאריות עכשיו מים שחולצו על ידי חזרה על שלבי החילוץ האלה. מלבד להחליף מינוס 20 מעלות צלזיוס ארבע עד שלוש כלורופורם לתערובת מתנול למים מזוקקים, degassed.בזהירות להפריד את שתי שכבות ממס וכתוצאה מכך, אשר יהיה להבחין חזותית באמצעות הסרת השכבה העליונה על ידי צינור זהיר. מייבשים את השכבה התחתונה שאינה קוטבית במייבש ההקפאה. ברגע שהוא יבש, להוסיף חמישה microliters של כלורופורם ו 195 microliters של מתנול אם מנתחים בתוך הימים הקרובים.כדי לשפר את יעילות יינון electrospray עבור ספקטרומטריית מסה תהודה יון גוון ארבע טרנספורמציה, קיצור FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה. מדללים את תמצית הכלורופורם אחד לאחד במתנול, ואת תמצית המים 2 ל-1 במתנול. כייל את ספקטרומטר FTICR על ידי הזרקת 100 מיקרוליטרים ישירות של פתרון כוונון, המשתרע על פני טווח מסה של כ 100 עד 1, 300 דלתונים, לתוך FTICR-MS.הזרקה ישירה 100 מיקרוליטרים של תקן חומצה פולבית נהר Suwannee למקור יינון electrospray. יחד עם ספקטרומטר FTICR באמצעות משאבת מזרק שנקבעה לקצב זרימה של 3.0 מיקרוליטר לדקה. הגדר את מתח המחט לחיובי 4.4 קילו-וולט.תור אחד עד 100 מסה כדי לטעון יחס נימי זכוכית ב 180 מעלות צלזיוס. בדוק את הספקטרום שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח כדי לאשר את איכות הנתונים. עכשיו, להציג 100 microliters של כל תמצית באמצעות הזרקה ישירה למקור יינון electrospray, יחד עם ספקטרומטר FTICR באמצעות משאבת מזרק להגדיר קצב זרימה של 3.0 microliters לדקה.הגדר את הפרמטרים כבעבר. התאם את זמן הצטברות היונים עבור כל מדגם או קבוצת דגימות כדי להסביר את השונות בריכוז הפחמן. לאסוף 144 סריקות עבור כל מדגם, ממוצע הסריקות ולאחר מכן לבצע כיול פנימי באמצעות סדרת CH2 הומולוגית.יבש את התמציות באמצעות רכז ולשמור את שאר התמציות עבור ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה גז הבאים, ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית. כדי להתכונן ל- GC-MS, הכן תחילה דוגמאות פקד ריק כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להגן על קבוצות קרבינול להוסיף 20 microliters של 30 מיליגרם לכל מיליליטר methoxamine הידרוכלוריד ב Paradyne לכל הדגימות, כולל תמציות מתנול, תמציות מים, החסר ואת דגימות כיול FAME.לאטום את הבקבוקונים עם כובעים. Vortex התמציות במשך 20 שניות, ולאחר מכן sonicate התמציות במשך 60 שניות. צנטריפוגה תמציות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ב 100 פעמים כוח הכבידה.הוסף 80 מיקרוליטרים של MSTFA עם 1%trimethylchlorosilane לכל מדגם. לאחר מערבולת sonicating התמציות כמו קודם, צנטריפוגה תמציות שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 100 פעמים כוח הכבידה. לאחר קירור תמציות לטמפרטורת החדר, להעביר לתוך בקבוקונים GC-MS מדגם אוטומטי.המשך לניתוח GC-MS ועיבוד נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתכונן לניתוח NMR מצב נוזלי, לדלל את שאר תמציות המים על ידי 10% עם תקן פנימי DSS חמישה מילימולרים. מעבירים את התערובת לצינור NMR מזכוכית בורוסיליקט בקוטר 3 מ"מ באיכות גבוהה.המשך לניתוח NMR ועיבוד נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את ניתוח ליפידמיקה LC-MS, להזריק 10 microliters של כל תמצית לתוך מערכת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה, יחד עם ספקטרומטר מסה Orbitrap באמצעות עמודה היברידית משטח טעון שלב הפוך. הגדר מעבר צבע של 34 דקות כמפורט בפרוטוקול הטקסט בקצב זרימה של 250 מיקרוליטר לדקה.השתמש הן במצבי יינון שליליים והן במצבי יינון חיוביים עם דיסוציאציה גבוהה יותר של התנגשות אנרגיה ודיסוציאציה הנגרמת על-ידי התנגשות. כדי לבצע ניתוח פרוטומיקה, ראשית לחלץ חלבונים על פי פרוטוקול MPLEx לשארית שלב המתנול כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כבול הושווה עם עומק בביצה S1 ב Spruce ו Peatlands תגובה תחת סביבות משתנות או אתר SPRUCE במינסוטה, ארה"ב.3, 312 אנזימים זוהו בניתוח פרוטומיקה. ניתוח של פעילות האנזים בעומק מגלה כי מספר האנזימים יורד בחדות בין 15 ס"מ ל -45 ס"מ בביג SPRUCE. כדי להראות כיצד אתרים עשויים להשתנות בפעילויות מטבוליט ואנזים, תוצאות SPRUCE מושווים לאלה של בוג ופן פרמפרווסט בצפון שוודיה.בסך הכל 67, 040 מטבוליטים זוהו בכל דגימות כבול SPRUCE מהשילוב של FTICR-MS, NMR, GC-MS ו LC-MS ניתוחים. מוצג כאן החלק היחסי של מעמדות כימיים שונים שזוהו באמצעות טכניקות שונות במעמקים השונים. בעוד חומצות אמינו וסוכרים לרדת עם עומק, זה לא נצפתה עבור שומנים.על ידי אימות צולב מטבוליטים שזוהו בכל הניתוחים נגד מסד הנתונים KEGG נקבע כי התרכובות שזוהו מעורבים במסלולים מטבוליים נפוצים כגון מחזור חומצה טריקרבוקסילית, גליקוליזה ומטבוליזם סוכר. לאורך הליך זה חיוני להיות מודע למקורות פוטנציאליים של זיהום. החל באיסוף מדגם באמצעות ניתוח, דגימות לא צריך לבוא במגע עם פלסטיק pegged אשר יכול להשפיע לרעה על יינון.רבים מהממסים המשמשים במהלך הליך החילוץ מסוכנים או דליקים. תמיד ללבוש PPE המתאים כדי למנוע מגע עור ועין, כמו גם כדי למנוע דגימות מזהמים.

Research

JoVE Journal

Environment

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

הערכת פחמן אורגני יציב בקרקע שימוש סדרתית פומיגציה ונהלי דגירה

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

הבנה מומס אורגני Biogeochemistry דרך<em&gt; באתרו</em&gt; מניפולציות מזינות במערכות אקולוגיות זרמו

Dissolved organic matter (DOM) is a highly diverse mixture of molecules providing one of the largest sources of energy and nutrients to stream ecosystems. ...

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

אוטומטיות, מערכת איסוף ניידת ברזולוציה גבוהה עבור ניתוח איזוטופי החנקן של NO<sub&gt; x</sub

Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in a Flow Tube Reactor

ייצור, מדידה של החומר חלקיקים אורגניים כור צינור זרימה

Organic particulate matter (PM) is increasingly recognized as important to the Earth's climate system as well as public health in urban regions, and the ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

ייצור, מדידה של חלקיקים אורגניים בבית הבליעה סביבתיים הרווארד

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Improving Infrared Spectroscopy Characterization of Soil Organic Matter with Spectral Subtractions

שיפור ספקטרוסקופית אינפרא אדום אפיון של חומר אורגני בקרקע עם המתחוללות ספקטרלי

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

בידוד של בלוטת Mandibular תוכן המאגר של אפור פרווה "פיצוץ של הנמלים (Formicidae) לניתוח Volatilome על ידי GC-MS ו- MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

הערכת היכולות הסרת חלקיקים של העץ עלים

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...