Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Vorremmo ringraziare J.P. Chanton, J.E. Kostka e M.M. Kolton per assistenza con la raccolta di campioni di torba. Parti di questo lavoro sono stati condotti presso il laboratorio di scienze molecolari ambientale, un ufficio di DOE di impianto utente scienza sponsorizzato dall'ufficio di biologico e ricerca ambientale. PNNL è gestito da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC05-76RL01830. Questo lavoro è stato supportato dal US Department of Energy, ufficio per la scienza e della ricerca ufficio di biologico e ambientale (concede: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 e DE-SC0014416).

1. sequenziale estrazione della materia organica da suolo, sedimenti o torba
<ol><li>Raccogliere il suolo, sedimenti o torba tramite carotaggi e dividere nuclei secondo l'ipotesi che in fase di test (ad es., profondità). Esempi di Store in politetrafluoroetilene rivestito contenitori e congelare a-80 ° C per la conservazione prima dell'analisi. Nota: Circa 25 mg C è necessario per questo protocollo. Per torba (in genere 45% C), 50 mg di torba secca è richiesto. Grandi quantità di campione può...

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	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. 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Il singolo-throughput, analisi completamente accoppiati flusso utilizzato per caratterizzare metaboliti e il proteoma fornisce intuizioni le vie da cui C ciclismo è in corso in un complesso ecosistema. Terreno e torba sono matrici eterogenee, e di conseguenza, si verifica una delle fasi critiche di questo metodo nei primi passaggi nel garantire che la partenza di torba o materiale del terreno è altamente omogeneo. È preferibile per macinare il campione bene come aggregati possono ridurre l'efficienza di estrazione. Si...

Globalmente, le zone umide sono stimate a contengono Pg 529 del carbonio (C), principalmente come C organico seppellito in depositi di torba1. Attualmente, tali torbiere agiscono come un lavandino C netto, sequestrante 29 Tg C y-1 nel Nord America da solo1. Tuttavia, disturbi ambientali come drenante, incendi, siccità e temperature più calde possono compensare questo sink C aumentando la decomposizione di materia organica con conseguente aumentata C perdite tramite gas serra (anidride carbonica [CO2] e 1,produzione di metano [CH4])2. Cambiamento climatico può contribuire alla perdita di C se temperature più calde o essiccatore condizioni stimolano più veloce C decomposizione da parte dei microrganismi. In alternativa, più alte temperature e concentrazioni in aria CO2 possono stimolare la produzione primaria per sequestrare più CO2 come carbonio organico (OC). In quale misura e quanto velocemente tale OC viene quindi scomposto in CO2 e CH4 dipende da complesse interazioni tra i substrati di donatore di elettrone, la disponibilità di accettori e i microrganismi che mediano il trasformazione. In molti casi, i meccanismi non sono ben caratterizzati, così loro risposta a perturbazioni ambientali non è ben vincolata e non è ancora chiaro quale sarà il risultato del cambiamento climatico sul bilancio del carbonio negli ecosistemi delle torbiere.
La natura complessa della materia organica naturale (NOM) ha fatto anche identificare i composti organici presenti nelle miscele NOM storicamente difficile. Gli avanzamenti recenti hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di caratterizzare i composti che tradizionalmente e, in qualche misura continua ad essere, considerato recalcitrante umico fulvico composti3,4,o5. Ora capiamo che molti di questi composti sono in realtà microbica disponibili e può essere decomposto se un accettore di elettroni terminale adatto (TEA) è reso disponibile6,7. Calcolare lo stato di ossidazione nominale del carbonio (NOSC) per un composto fornisce una metrica per predire il potenziale di decomposizione e il rendimento energetico del tè richiesto. Tuttavia, esso richiede una caratterizzazione a livello molecolare della materia organica7. NOSC è calcolato dalla formula molecolare tramite la seguente equazione7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, dove z è la carica netta. NOSC è correlata con la termodinamica guida forza8, in cui composti con NOSC superiori sono più facili da degradare, mentre composti con bassa NOSC richiedono sempre più energico tè al fine di essere ridotto. Composti con NOSC inferiore a − 2 richiedono un'alta energia producendo tè come O2, nitrato o MnIVe non può essere degradate da che si verificano comunemente più basso energia producendo tè come FeIII o solfato7. Questa è una considerazione importante nelle condizioni anossiche impregnato d'acqua trovato nelle zone umide dove O2 e altre ad alta energia producendo tè sono scarse9 e quindi la degradazione di composti NOSC inferiore in queste condizioni sono termodinamicamente limitato. Perturbazione ambientale può influenzare lo stato termodinamico dell'ecosistema attraverso i cambiamenti idrologici che influenzano O2 (il più energico accettore di elettroni), cambiamenti in substrati organici e accettori messi a disposizione dal principale produzione e in misura minore dalla temperatura. Un esempio importante degli effetti di temperatura nei sistemi di zona umida si verifica per quanto riguarda il compromesso che si verifica tra homoacetogenesis (cioè, produzione di acetato da CO2 e H2) e hydrogenotrophic metanogenesi ( cioè, produzione4 CH da CO2 e H2). A basse temperature, sembra che homoacetogenesis è leggermente favorito, mentre temperature più calde favoriscono CH4 produzione10. Questo effetto di temperatura può avere implicazioni importanti per la risposta degli ecosistemi al cambiamento climatico, come CH4 è un gas serra molto più forte di CO211 e quindi aumentare la produzione di CH4 a spese di CO2 alle temperature più calde può contribuire ad un feedback positivo con il riscaldamento climatico.
Le torbiere producono globalmente significative quantità di CO2 e CH46tramite respirazione microbica di biofiltri organici importa. NOSC dei substrati organici carbonio determina la proporzione relativa di CO2: CH4 prodotto che è un parametro critico a causa del maggiore forcing radiativo di CH4 rispetto al CO211, ma anche perché sforzi modellanti hanno identificato questo rapporto come un parametro critico per la stima C flusso in torbiere12. In assenza di accettori terminali diverso da CO2, può essere dimostrato dall'equilibrio di elettroni che substrati organici C con volontà > 0 NOSC producano CO2: CH4 > 1, C organico con NOSC = 0 produce CO2 e CH4 in rapporto equimolare e C organico con NOSC < 1 produrrà CO2: CH4 < 113. Decomposizione di OC negli ecosistemi naturali è mediata da microrganismi, così che anche quando la degradazione di un composto specifico è thermodinamicamente fattibile, cineticamente è limitato dall'attività di enzimi microbici e, in condizioni anossiche, per la forza motrice termodinamico (cioè, NOSC)7. Fino ad ora esso è stato impegnativo per caratterizzare completamente la materia organica, perché la diversità dei composti presenti richiede diverse tecniche complementari per la loro caratterizzazione. Gli avanzamenti recenti hanno chiuso il gap; utilizzo di una suite di tecniche analitiche possiamo analizzare una vasta gamma di composti organici fornendo la caratterizzazione a livello molecolare e, in alcuni quantificazione di casi, da piccoli metaboliti primari come il glucosio fino a 800 Da poli-eterocicli. In precedenza tali grandi molecole complesse sarebbero sono state caratterizzate semplicemente come lignina-come o tannino-come e presupposto per essere stato ricalcitrante. Caratterizzazione molecolare-livello, tuttavia, consente il calcolo di NOSC per anche queste grandi molecole complesse. Questi valori NOSC sono correlati linearmente con la forza motrice termodinamica che permettano una valutazione della qualità della sostanza organica disponibile per decomposizione, che in molti casi rivela che queste molecole complesse possono effettivamente essere microbica degradabile anche sotto le condizioni anossiche che prevalgono nelle zone umide.
Poiché introduzione di O2 permette di materia organica di quasi tutti i valori NOSC naturalmente osservati per essere decomposto, qui ci concentriamo sui cambiamenti nella materia organica e proteomica microbica che rischiano di essere i driver primari in zona umida (cioè, sistemi di limitata O2). Tuttavia, tutte le tecniche che si discuterà possono essere applicate alla materia organica da qualsiasi ecosistema. Comunemente, misurazioni di massa sulla basano ottica, e l'analisi di fluorescenza sono stati usati per valutare la qualità di materia organica3,14. Quando si utilizza bulk misure come queste, tuttavia, dettagli raffinati sono persi come un numero elevato di molecole Classificato insieme in termini generici come humics o fulvics. Le definizioni di queste categorie non sono vincolate e, infatti, possono variare da studio a Studio facendo paragoni impossibili. Inoltre, misurazioni di massa non forniscono i dettagli molecolari necessari per calcolare la termodinamica che regolano il sistema e pertanto sono privi veramente valutare qualità di materia organica15.
Tecniche individuali come Fourier trasformano ionica a risonanza ciclotronica (FTICR-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), gas cromatografia spettrometria (GC-MS) di massa e fare liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) fornire tali dettagli a livello molecolare. Mentre ciascuna di queste tecniche presenta le proprie limitazioni, portano anche i propri punti di forza che può essere sfruttati in un approccio integrato per raggiungere i minimi dettagli molecolari necessari per quantificare la qualità di materia organica in un rigoroso senso termodinamico . GC-MS è utile per l'identificazione dei metaboliti piccole critiche che possano avere influenza prossimale il CO2 e produzione di4 CH (per esempio, glucosio, acetato, ecc.); Tuttavia, GC-MS richiede la verifica rispetto a uno standard ed è quindi limitato ai già noti composti presenti nel database impedendo l'identificazione di nuovi composti. Inoltre, GC-MS è una tecnica semi-qualitativa permettendo inferenza circa i cambiamenti nelle concentrazioni relative, ma non fornisce le informazioni di effettiva concentrazione necessarie per il calcolo ad esempio energie libere di Gibb. Infine, GC-MS richiede derivatizzazione di molecole prima dell'analisi che limita la risoluzione a composti più ~ 400 Da piccolo e alcoli volatili vengono perse durante la fase di asciugatura.
Unidimensionale (1D) 1H stato liquido NMR permette la caratterizzazione altamente quantitativa dei piccoli metaboliti (compresi i metaboliti primari piccolo peso molecolare e composti volatili come acetato, alcool, acetone, formiato, piruvato, succinato, gli acidi grassi a catena corta, come pure una gamma di carboidrati notoriamente assente o compromesse da metodi basati su MS) e le loro concentrazioni sono particolarmente utili per il calcolo dei parametri termodinamici. Eppure, come GC-MS, NMR 1D di miscele complesse richiede standardizzazione rispetto a un database e pertanto non solo permettono una facile identificazione di nuovi composti che rischiano di essere abbondanti in ecosistemi naturali e mutevoli complessi. Inoltre, è meno sensibile che le tecniche basate su MS NMR e dunque, profiling del metabolita quantitativa è realizzato solo di sopra di 1 µM mediante NMR sistemi dotati di sonde-freddo raffreddato ad elio. Non ampiamente apprezzato, alcuni NMR freddo-sonde sono sale-tolleranti e consentono un'analisi ambientale miscela in presenza di concentrazioni millimolar sale quando utilizzato in più piccolo diametro (< 3 mm di diametro esterno) campione tubi16. Tuttavia, un'ulteriore complicazione di RMN è che elevate quantità di minerali e metalli paramagnetici (ad es., Fe e Mn sopra 1-3 wt %), che può essere abbondante nei terreni di montagna, può ampliare le caratteristiche spettrali e complicano l'interpretazione degli spettri NMR . Mediante estrazione in fase solida (SPE) possono contribuire all'interpretazione di NMR e MS-based metabolomica metodi riducendo i sali minerali e aumentando la qualità spettrale.
FTICR-MS di iniezione diretta è una tecnica altamente sensibile in grado di rilevare decine di migliaia di metaboliti da un unico campione, ma non acquisisce i metaboliti di piccoli critici come succinato, piruvato e acetato ed è notoriamente difficile da utilizzare per gli zuccheri e altri carboidrati17, né fornisce informazioni quantitative. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, FTICR-MS eccelle all'individuazione e assegnazione formula molecolare di nuovi composti e identifica pertanto il maggior numero di composti che fornisce informazioni più molecolare rispetto a qualsiasi delle altre tecniche descritte. Questo è utile, perché le informazioni molecolari fornite da FTICR-MS (e altre tecniche) possono essere utilizzate per calcolare NOSC è imparentato con la forza motrice termodinamica che disciplinano la probabilità di determinate reazioni8 e le loro tariffe in determinate condizioni7. Inoltre, accoppiando FTICR-MS con tecniche di separazione, come LC insieme a tandem MS, informazioni strutturali quantitative possono essere raggiunti, compensare alcuni degli svantaggi di questa tecnica. LC-MS è utile per identificare composti lipido-simili e altri metaboliti che non sono ben caratterizzati da uno qualsiasi degli altri metodi. FTICR LC-MS o LC-MS di accoppiamento con un collezionista di frazione e raccogliendo le frazioni di incognite specifici di interesse per la delucidazione strutturale dallo stato liquido di bidimensionale (2D) NMR è la situazione ideale per identificare e quantificare i composti sconosciuti18 ,19. Tuttavia, questo è un passo molto che richiede tempo che potrebbe essere utilizzato se e quando necessario. Presi singolarmente, ognuna di queste tecniche forniscono un'istantanea differente della materia organica, e integrandoli, possiamo raggiungere una comprensione più completa rispetto all'utilizzo di qualsiasi tecnica di isolamento.
Mentre le considerazioni termodinamiche impostano i vincoli ultimati su quali trasformazioni sono possibili in un sistema, decomposizione di materia organica è mediata dai microrganismi di cui attività enzimatiche controllare la velocità di reazione. Quindi, comprendere pienamente i controlli sulla decomposizione di materia organica e, in definitiva, produzione di gas (CO2 e CH4) Serra da zone umide richiede un approccio integrato omics alla che caratterizzano l'attività degli enzimi microbici, nonché i metaboliti. In questo articolo, descriviamo un metodo per il raggiungimento di tali un'analisi completa da un unico campione utilizzando un approccio sequenziale che si traduce in un'analisi completamente accoppiata. Questo approccio consente di espandere il metabolita, la proteina ed il protocollo di estrazione (MPLex) del lipido in cui proteomica è stato accoppiato con GC-MS e LC-MS20 per identificare piccoli metaboliti, proteine e lipidi incorporando informazioni quantitative metabolita via NMR e identificazione dei maggiori metaboliti secondari tramite FTICR-Sig. ra leggermente diverso da MPLex, iniziamo il protocollo con l'estrazione di acqua e quindi uso sequenziale estrazione con solventi non polari sempre più. Tutte le estrazioni sono effettuate su un campione unico che conserva il campione quando i volumi sono limitati o difficili da ottenere e diminuisce l'errore sperimentale introdotto attraverso variazioni tra le aliquote da matrici di campioni eterogenei (ad es., terreno e torba) o differenze nelle condizioni di conservazione e durata.
Infine, accoppiando le analisi di OM con analisi proteomica della comunità microbica, possiamo costruire reti metaboliche che descrivono le vie e la trasformazione di decomposizione di materia organica. Questo ci permette di testare ipotesi specifiche sull'influenzano di perturbazioni al sistema ultimate CO2 e produzione4 CH attraverso alterazione i substrati organici disponibili, accettori e comunità microbiche mediando le reazioni tramite l'attività di catalizzatori di enzima.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo di singola velocità effettiva per l'analisi dei metaboliti, lipidi e proteine microbiche da un singolo campione creando un dataset completamente accoppiato per la costruzione di reti metaboliche mentre vincolando gli errori analitici .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1067px;" width="1065">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

Materia organica naturale (NOM) è composto da una miscela molto complessa di migliaia di composti organici che, storicamente, si è rivelata difficile da caratterizzare. Tuttavia, per comprendere i controlli termodinamici e cinetici di produzione di gas (anidride carbonica [CO2] e [CH4] metano) serra derivanti dalla decomposizione di NOM, una caratterizzazione a livello molecolare accoppiato con microbica analisi del proteoma è necessario. Clima e cambiamenti ambientali si prevedono ulteriori, per perturbare gli ecosistemi naturali, sconvolgendo potenzialmente complesse interazioni che influenzano sia la fornitura di substrati di materia organica e i microrganismi eseguire le trasformazioni. Una dettagliata caratterizzazione molecolare della materia organica, proteomica microbica e le vie e le trasformazioni mediante il quale la materia organica viene decomposta sarà necessaria prevedere la direzione e l'entità degli effetti dei cambiamenti ambientali. Questo articolo viene descritto un throughput metodologico per la caratterizzazione completa del metabolita in un singolo campione di iniezione diretta Fourier transform ionica risonanza ciclotronica (FTICR-MS), gas cromatografia spettrometria di massa (GC-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) e l'analisi proteomica. Questo approccio si traduce in un set di dati completamente accoppiato che migliora la confidenza statistica per la deduzione delle vie di decomposizione di materia organica, la risultante di CO2 e tassi di produzione4 CH e le loro risposte a perturbazioni ambientali. Qui presentiamo i risultati dell'applicazione di questo metodo a NOM campioni raccolti da torbiere; Tuttavia, il protocollo è applicabile a qualsiasi campione NOM (ad es., torba, terreno boscoso, sedimenti marini, ecc.).

Abbiamo eseguito il protocollo descritto analisi complementari ed abbiamo paragonato la torba con profondità nella palude S1 in abete e le torbiere risposta sotto cambiando ambienti (SPRUCE) sito in Minnesota, Stati Uniti d'America. Questi risultati sono paragonati a quelli da una palude di permafrost e fen dal nord della Svezia per mostrare come siti possono variare nelle attività metabolita e degli enzimi. Abbiamo identificato 3.312 enzimi nell'analisi proteomica. Un'analisi delle attività di enzimi con profondità ...

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Questo protocollo descrive il metodo per una caratterizzazione molecolare completa e imparziale di un singolo campione usando sia la spettrometria di massa, usando metabolomica, proteomica e lipidomica, sia piattaforme di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Il significato di questo approccio è che possiamo caratterizzare un sistema biologico a valle del genoma, identificando diversi tipi di molecole, permettendoci di dedurre vie metaboliche e di decomposizione. Tecnica di estrazione sequenziale, consente l'estrazione di composti polari biodisponibili utilizzando acqua, seguita da MPLEx per catturare eventuali composti polari aggiuntivi o metaboliti, nonché proteine e lipidi da un singolo campione.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché guida lo scienziato attraverso la separazione dei tre strati durante la seconda fase di estrazione e la divisione delle estrazioni tra diversi strumenti di analisi. Le analisi multiomiche integrative consentono indagini più efficaci e una comprensione completa di sistemi biologici complessi. Questo metodo robusto estrae un'ampia varietà di molecole ed è applicabile a diversi tipi di campioni.Iniziare questa procedura con la raccolta e la preparazione degli esempi come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando un utensile in acciaio inossidabile lavato con etanolo, aliquota 50 milligrammi di ciascuno dei campioni essiccati in singoli due tubi di vetro millilitro. Aggiungere un millilitro di acqua distillata e degassata a ciascun campione.Quindi limitare le fiale e agitare per due ore su un tavolo shaker. Centrifugare i campioni a 15 mila volte la gravità per 30 minuti. E poi lasciare che le soluzioni si fermino a temperatura ambiente per 20 minuti.Decantare e salvare il supernatante da ogni campione. Condurre un'estrazione MPLEx sui residui ora estratti dall'acqua ripetendo queste fasi di estrazione. Tranne che per sostituire una miscela meno 20 gradi celsius da quattro a tre cloroformio con la miscela di metanolo per l'acqua distillata e degassata.Separare accuratamente i due strati di solvente risultanti, che saranno visivamente distinguibili rimuovendo lo strato superiore mediante un'attenta pipettazione. Asciugare lo strato inferiore non polare nell'essiccatore a congelamento. Non appena è asciutto, aggiungere cinque microlitri di cloroformio e 195 microlitri di metanolo se si analizzano entro i prossimi due giorni.Per migliorare l'efficienza di ionizzazione elettrospray per la spettrometria di massa a risonanza ciclotronica ionica a trasformata fourier, abbreviata FTICR-MS per iniezione diretta. Diluire l'estratto cloroformio uno a uno in metanolo, e l'acqua estrarre due a uno in metanolo. Calibrare lo spettrometro FTICR iniettando direttamente 100 microlitri di una soluzione di sintonizzazione, che si estende su un intervallo di massa di circa 100-1.300 daltoni, nell'FTICR-MS.Iniettare direttamente 100 microlitri dello standard dell'acido fulvico del fiume Suwannee alla sorgente di ionizzazione elettrospray. Accoppiato allo spettrometro FTICR attraverso una pompa per siringhe impostata su una portata di 3,0 microlitri al minuto. Impostare la tensione dell'ago su 4,4 kilovolt positivi.Coda da uno a 100 rapporto massa-carica e capillare in vetro a 180 gradi celsius. Ispezionare gli spettri risultanti utilizzando il software di analisi per confermare la qualità dei dati. Ora, introdurre 100 microlitri di ogni estratto tramite iniezione diretta alla sorgente di ionizzazione elettrospray, accoppiati allo spettrometro FTICR attraverso una pompa per siringhe impostata su una portata di 3,0 microlitri al minuto.Impostare i parametri come prima. Regolare il tempo di accumulo degli ioni per ciascun campione o gruppo di campioni in modo da tenere conto della variazione della concentrazione di carbonio. Raccogliere 144 scansioni per ogni campione, eseguire in media le scansioni e quindi eseguire una calibrazione interna utilizzando una serie CH2 omologa.Essiccare gli estratti usando un concentratore e salvare il resto degli estratti per la successiva spettrometria di massa gascromatografica, spettrometria di massa cromatografica liquida e analisi della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Per prepararsi a GC-MS, preparare innanzitutto esempi di controllo vuoti come descritto nel protocollo di testo. Per proteggere i gruppi di carbinolo aggiungere 20 microlitri da 30 milligrammi per millilitro metoxamina cloridrato in Paradyne a ciascuno dei campioni, compresi gli estratti di metanolo, gli estratti d'acqua, gli spazi vuoti e i campioni di calibrazione FAME.Sigillare le fiale con tappi. Vortice gli estratti per 20 secondi, quindi sonicare gli estratti per 60 secondi. Centrifugare gli estratti a 37 gradi celsius per 90 minuti a 100 volte la gravità.Aggiungere 80 microlitri di MSTFA con 1%trimetilclorosilano a ciascun campione. Dopo aver vortice e sonicato gli estratti come prima, centrifugare nuovamente gli estratti a 37 gradi celsius per 30 minuti a gravità 100 volte. Dopo aver raffreddamento gli estratti a temperatura ambiente, trasferire in flaconcini autocampionatore GC-MS.Procedere all'analisi GC-MS e all'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per prepararsi all'analisi NMR allo stato liquido, diluire il resto degli estratti d'acqua del 10% con uno standard interno DSS da cinque millimolari. Trasferire la miscela in un tubo NMR in vetro borosilicato di alta qualità di tre millimetri di diametro esterno.Procedere all'analisi NMR e all'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire l'analisi lipidomica LC-MS, iniettare 10 microlitri di ogni estratto in un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni, accoppiato a uno spettrometro di massa Orbitrap utilizzando una colonna ibrida di superficie caricata in fase inversa. Impostare una sfumatura di 34 minuti come elencato nel protocollo di testo con una portata di 250 microlitri al minuto.Usa sia modalità di ionizzazione negativa che positiva con una maggiore dissociazione da collisione energetica e dissociazione indotta dalla collisione. Per eseguire l'analisi della proteomica, estrarre prima le proteine secondo il protocollo MPLEx per il resto della fase del metanolo come delineato nel protocollo di testo. La torba è stata confrontata con la profondità nella palude S1 presso il sito Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments o SPRUCE in Minnesota, USA.3.312 enzimi sono stati identificati nell'analisi della proteomica. Un'analisi delle attività enzimatiche con profondità rivela che il numero di enzimi diminuisce bruscamente tra i 15 centimetri e i 45 centimetri nella palude di ABETE ROSSO. Per mostrare come i siti possono variare nelle attività metabolite ed enzimatiche, i risultati di SPRUCE sono confrontati con quelli di una palude di Permafrost e Fen nel nord della Svezia.Complessivamente sono stati identificati 67.040 metaboliti in tutti i campioni di torba SPRUCE dalla combinazione di analisi FTICR-MS, NMR, GC-MS e LC-MS. Qui è mostrata la frazione relativa delle diverse classi chimiche identificate attraverso varie tecniche nelle diverse profondità. Mentre gli amminoacidi e gli zuccheri diminuiscono con la profondità, questo non si osserva per i lipidi.Convalidando incrociatamente i metaboliti identificati in tutte le analisi sulla base di dati KEGG è stato determinato che i composti identificati sono coinvolti in percorsi metabolici comuni come il ciclo dell'acido tricarrbossilico, la glicolisi e il metabolismo dello zucchero. Nel corso di questa procedura è fondamentale essere consapevoli delle potenziali fonti di contaminazione. A partire dalla raccolta del campione attraverso l'analisi, i campioni non devono entrare in contatto con plastiche ancorate che possono influire negativamente sulla ionizzazione.Molti dei solventi utilizzati durante la procedura di estrazione sono pericolosi o infiammabili. Indossare sempre DPI appropriati per evitare il contatto con la pelle e gli occhi, nonché per evitare di contaminare i campioni.

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Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

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