Name: single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer ajuda a recolha de amostras de turfa J.P. Chanton, J.E. Kostka e Kolton M.M. Partes deste trabalho foram conduzidos do laboratório de ciências ambientais Molecular, um DOE escritório de ciência instalação patrocinada pelo escritório de biológicos e pesquisa ambiental. PNNL é operado pela Battelle para o DOE sob contrato DE-AC05-76RL01830. Este trabalho foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência e pesquisa do escritório de biológico e ambiental (concede: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 e DE-SC0014416).

1. sequencial extração de matéria orgânica do solo, sedimentos ou turfa
<ol><li>Coletar o solo, sedimentos ou turfa através do dielétrico e dividir os núcleos de acordo com a hipótese que está sendo testado (por exemplo, profundidade). Loja de amostras em politetrafluoretileno revestido recipientes e congelam a-80 ° C para armazenamento antes da análise. Nota: Aproximadamente 25 mg C é necessária para este protocolo. Para turfa (normalmente 45% C), 50 mg de turfa seca é necessária. M...

<ol>
	<li>Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbon+balance+of+North+American+wetlands.">The carbon balance of North American wetlands.</a> Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).</li><li>Wilson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greenhouse+gas+balance+over+thaw-freeze+cycles+in+discontinuous+zone+permafrost.">Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).</li><li>Broder, T., Knorr, K. 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O single-produção, fluxo de análise totalmente acoplados usado para caracterizar metabólitos e o proteome fornece insights sobre os caminhos pelos qual C ciclismo está ocorrendo em um complexo ecossistema. Solo e a turfa são matrizes heterogêneas, e, portanto, uma das etapas críticas desse método ocorre nos primeiros passos no sentido de garantir que a partida de turfa ou material de solo é altamente homogênea. É preferível moer a amostra, bem como agregados podem reduzir a eficiência de extração. Este é...

Globalmente, as zonas húmidas são estima-se que contêm Pg 529 de carbono (C), principalmente como orgânico C enterrado em depósitos de turfa1. Atualmente, tais turfeiras atuam como uma líquido C pia, sequestrando 29 Tg C y-1 na América do Norte sozinho1. No entanto, perturbações ambientais tais como drenagem, incêndios, seca e temperaturas mais quentes podem compensar esse coletor C, aumentando a decomposição de matéria orgânica, resultando em aumento C perdas através de gases de efeito estufa (dióxido de carbono [CO2] e 1,de produção metano [CH4])2. Mudança climática pode contribuir para a perda de C se temperaturas mais quentes ou secador condições estimulam mais rápido C decomposição por microorganismos. Alternativamente, umas mais altas temperaturas e concentrações no ar de CO2 podem estimular a produção primária para sequestrar mais CO2 como carbono orgânico (OC). Em que medida e rapidez que OC é então decomposta em CO2 e CH4 depende de interações complexas entre os substratos de doador de elétron, a disponibilidade de aceitadores de electrões e os microorganismos que medeiam a transformação. Em muitos casos, os mecanismos não são bem caracterizados, assim, sua resposta a perturbações ambientais não é bem restrita e ainda não está claro qual será o resultado da mudança climática no balanço de carbono em turfeiras ecossistemas.
A natureza complexa da matéria orgânica natural (NOM) tem feito mesmo identificando os compostos orgânicos presentes nas misturas NOM historicamente difícil. Avanços recentes têm melhorado muito nossa capacidade de caracterizar compostos que tradicionalmente e, em certa medida continuam a ser, considerado como recalcitrantes húmicos ou fúlvico compostos3,4,5. Agora entendemos que muitos destes compostos são na verdade amostras disponíveis e podem ser decompostos se um aceptor de elétron terminal apropriado (TEA) feito disponível6,7. Calcular o estado de oxidação nominal do carbono (NOSC) para um composto fornece uma métrica para predizer o potencial de decomposição e o rendimento energético do chá exigido. No entanto, requer uma caracterização do nível molecular da matéria orgânica7. NOSC é calculado a partir da fórmula molecular através da seguinte equação7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, onde z é a carga líquida. NOSC está correlacionada com a termodinâmica condução força8, em que compostos com maior NOSC são mais fáceis de degradar, enquanto compostos com menor NOSC exigem cada vez mais enérgicos chás para ser reduzido. Compostos com NOSC menos do que − 2 exigem uma alta energia produzindo chás como O2, nitrato ou MnIVe não pode ser degradados por ocorrem comumente baixa energia produzindo chás como FeIII ou sulfato de7. Esta é uma consideração importante nas condições anóxica alagadas encontrados em zonas húmidas onde O2 e outra alta energia produzindo chás são escassos9 e, portanto, a degradação de compostos NOSC inferiores sob essas condições são termodinamicamente limitada. Perturbações ambientais podem influenciar o estado termodinâmico do ecossistema por mudanças hidrológicas que influenciam O2 (o aceptor de elétron mais energético), alterações em substratos orgânicos e aceitadores de electrões disponibilizados pela primária produção e em menor grau pela temperatura. Um exemplo importante dos efeitos da temperatura em sistemas de zonas húmidas ocorre no que diz respeito a troca que ocorre entre homoacetogenesis (ou seja, produção de acetato de CO2 e H2) e hydrogenotrophic metanogênese ( ou seja, produção de4 CH de CO2 e H2). A baixas temperaturas, parece que esse homoacetogenesis é ligeiramente favorecida, enquanto temperaturas mais quentes favorecem CH4 produção10. Este efeito da temperatura pode ter implicações importantes para a resposta dos ecossistemas às mudanças climáticas, como CH4 é um gás de efeito estufa muito mais forte do que o CO211 e, consequentemente, aumento da produção de CH4 , às custas de CO2 em temperaturas mais quentes podem contribuir para um feedback positivo com aquecimento climático.
Turfeiras produzem globalmente significativas quantidades de CO2 e CH46via microbiana respiração de ocorrência natural orgânico importa. O NOSC de substratos orgânicos carbono determina a proporção relativa de CO2: CH4 produzido que é um parâmetro crítico devido a força radioativa maior de CH4 comparado com CO211, mas também porque esforços de modelagem identificaram esta relação como um parâmetro crítico para estimar o fluxo de C em turfeiras12. Na ausência de aceitadores de electrões terminal diferente de CO2, pode ser mostrado pelo saldo de elétron que os substratos orgânicos C com vontade de > 0 NOSC produzem CO2: CH4 > 1, C orgânico com NOSC = 0 produz CO2 e CH4 em proporção equimolar e C orgânico com NOSC < 1 produzirá CO2: CH4 < 113. Decomposição de OC em ecossistemas naturais é mediada por microorganismos, para que mesmo quando a degradação de um composto específico é termodinamicamente possível, é cineticamente limitada pela atividade de enzimas microbianas e, sob condições anóxica, pelo termodinâmico força (ou seja, NOSC)7. Até agora tem sido desafiador para caracterizar plenamente a matéria orgânica, porque a diversidade de compostos presentes requer diferentes técnicas complementares para a sua caracterização. Recentes avanços tem fechado o intervalo; utilizando um conjunto de técnicas analíticas podemos analisar uma grande variedade de compostos orgânicos, proporcionando a caracterização molecular-nível e, em alguns quantificação de casos, de pequenos metabolitos primários como glicose até 800 Da poli-heterocíclicos. Anteriormente tais moléculas grandes e complexas que foram caracterizadas simplesmente como lignina como ou como tanino e assumiu ter sido recalcitrantes. Caracterização molecular-nível, no entanto, permite o cálculo do NOSC mesmo essas grandes moléculas complexas. Esses valores NOSC são linearmente correlacionadas com a força motriz termodinâmica, permitindo uma avaliação da qualidade da matéria orgânica disponível para a decomposição, que, em muitos casos, revela que estas moléculas complexas podem ser bacteriana degradável, mesmo sob as condições anóxica que prevalecem nas zonas húmidas.
Desde que a introdução de O2 permite que a matéria orgânica de quase todos os valores NOSC naturalmente observados para ser decomposto, neste documento, focamos em mudanças na matéria orgânica e proteomics microbiana que possam ser os drivers primários no Pantanal (i.e., sistemas de limitado O2). No entanto, todas as técnicas que iremos discutir podem ser aplicadas a matéria orgânica de qualquer ecossistema. Comumente, medições em massa com base em óptica e análises de fluorescência têm sido utilizadas para avaliar a qualidade de matéria orgânica3,14. Quando usando medições em massa tais como estes, no entanto, detalhes são perdidos como um grande número de moléculas é categorizado juntos em termos genéricos, como humics ou fulvics. As definições destas categorias não são bem restrita e, na verdade, podem variar de estudo para estudo fazendo comparações impossíveis. Além disso, medidas em massa não fornecem os detalhes moleculares necessários para o cálculo da termodinâmica que regem o sistema e aquém, portanto, verdadeiramente, avaliação de qualidade de matéria orgânica15.
Técnicas individuais como Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), cromatografia gasosa (GC-MS) de espectrometria de massa, e fazer de espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) fornece tais detalhes no nível molecular. Enquanto cada uma dessas técnicas apresenta suas próprias limitações, eles também trazem suas próprias forças que podem ser aproveitadas em uma abordagem integrada para alcançar os detalhes moleculares necessários para quantificar a qualidade da matéria orgânica em um rigoroso sentido termodinâmico . GC-MS é útil para a identificação de metabolitos pequenos críticos que são susceptíveis de ter influência proximal em CO2 e a produção de4 CH (por exemplo, glicose, acetato, etc.); no entanto, GC-MS requer verificação contra um padrão e, portanto, é limitada aos já conhecidos compostos presentes no banco de dados impedindo a identificação de novos compostos. Além disso, GC-MS é uma técnica qualitativa semi permitindo inferência sobre as alterações na concentração relativa, mas não fornecendo as informações reais de concentração necessárias para calcular as energias livres de Gibb, por exemplo. Finalmente, GC-MS exige derivatização de moléculas antes da análise, que limita a resolução menor do que o Da ~ 400 compostos e álcoois voláteis são perdidos durante a etapa de secagem.
Unidimensional (1D) 1H estado líquido NMR permite a caracterização altamente quantitativa de metabólitos pequenas (incluindo metabolitos primários peso molecular pequeno e voláteis como álcoois, acetato, acetona, formiato, piruvato, ácido succínico, ácidos graxos de cadeia curta, bem como uma variedade de carboidratos notoriamente ausentes ou comprometidos de métodos baseados em MS) e suas concentrações são particularmente úteis para cálculo dos parâmetros termodinâmicos. Ainda, como GC-MS, 1D NMR de misturas complexas requer padronização em relação a um banco de dados e, portanto, sozinho não permite a fácil identificação de novos compostos que são susceptíveis de ser abundante em complexos ecossistemas naturais e em constante mudanças. Além disso, NMR é menos sensível do que as técnicas baseadas em MS e, portanto, de perfil quantitativo metabólito é conseguida apenas acima de 1 µM, usando sistemas de NMR equipados com hélio-refrigeração frio-sondas. Não muito apreciado, algum frio NMR-sondas são sal-tolerante e permitam análise ambiental mistura na presença de concentrações milimolar de sal quando usado em menor diâmetro (diâmetro exterior de < 3 mm) tubos de amostra16. No entanto, uma outra complicação de NMR é que quantidades elevadas de paramagnéticos metais e minerais (por exemplo, Fe e Mn acima de 1-3 wt %), que pode ser abundante em solos de terra firme, pode ampliar características espectrais e complicar a interpretação dos espectros NMR . Usando a extração de fase sólida (SPE) pode auxiliar na interpretação de NMR e baseados em MS metabolomics métodos reduzindo os sais minerais e aumentando a qualidade espectral.
FTICR-MS por injecção directa é uma técnica altamente sensível capaz de detectar a dezenas de milhares de metabólitos de uma única amostra, mas não captura os metabolitos pequenos críticos como acetato, piruvato e succinato e é notoriamente difícil de Use para açúcares e outros carboidratos17, nem fornecer informações quantitativas. No entanto, ao contrário de outras técnicas, FTICR-MS é excelente em identificar e atribuir a fórmula molecular de novos compostos e, portanto, identifica o maior número de compostos, fornecendo informações moleculares mais do que qualquer das outras técnicas descritas. Isso é útil, porque a informação molecular fornecida pelo FTICR-MS (e outras técnicas) pode ser usada para calcular NOSC que está relacionada com a força motriz termodinâmica que regem a probabilidade de certas reações8 e suas tarifas em certas condições7. Além disso, pelo acoplamento FTICR-MS com técnicas de separação, tais como LC juntamente com tandem MS, informações quantitativas estruturais podem ser alcançadas, compensando algumas das desvantagens desta técnica. LC-MS é útil para identificar compostos lipídicos, como e outros metabolitos que não são bem caracterizados por qualquer um dos outros métodos. Acoplamento FTICR de LC-MS ou LC-MS com um coletor de fração e coletando frações de incógnitas específicas de interesse para a elucidação estrutural por estado de líquido bidimensional (2D) NMR é a situação ideal para identificação e quantificação dos compostos desconhecidos18 ,19. No entanto, este é um passo muito demorado que poderia ser usado se e quando necessário. Tomadas individualmente, cada uma dessas técnicas fornecem um instantâneo diferente da matéria orgânica, e integrando-os, nós pode alcançar uma compreensão mais completa do que usando qualquer uma das técnicas isoladamente.
Enquanto as considerações termodinâmicas definir as restrições de finais sobre quais transformações são possíveis em um sistema, decomposição de matéria orgânica é mediada por microorganismos cujas actividades enzimáticas controlam taxas de reação. Assim, entender completamente os controles na decomposição de matéria orgânica e, finalmente, a produção de gás (CO2 e CH4) estufa de zonas húmidas exige uma abordagem integrada omics para caracterizar as atividades da enzima microbiana, bem como os metabólitos. Neste artigo, descrevemos um método para a realização de uma análise abrangente de uma única amostra, utilizando uma abordagem sequencial que resulta em uma análise totalmente emparelhada. Esta abordagem expande o metabolito, proteína e protocolo de extração (mplexas) de lipídios na qual proteomics foi acoplado com GC-MS e LC-MS20 para identificar pequenos metabólitos, proteínas e lipídios, incorporando informações quantitativas metabólito através NMR e identificação dos maiores metabólitos secundários através de FTICR-Sra. ligeiramente diferente do mplexas, começamos o protocolo com uma extração de água e depois uso sequencial extração com solventes não-polares cada vez mais. Todas as extrações são feitas em uma única amostra que conserva a amostra quando volumes são limitados ou difíceis de obter e diminui o erro experimental introduzido através da variação entre alíquotas de matrizes de amostra heterogênea (por exemplo, o solo e turfa) ou diferenças nas condições de armazenamento e duração.
Finalmente, pelo acoplamento das análises de OM com proteomics análises da comunidade microbiana, podemos construir redes metabólicas que descrevem os caminhos e a transformação da decomposição de matéria orgânica. Isto permite-nos testar hipóteses específicas sobre como as perturbações ao sistema influenciará final de CO2 e a produção de4 CH através de alteração para os substratos orgânicos disponíveis, aceitadores de electrões e as comunidades microbianas mediando as reações através da atividade de catalisadores de enzima.
O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo único de taxa de transferência para a análise de metabólitos, lipídios e proteínas microbianas de uma única amostra, criando um conjunto de dados totalmente pareado para a construção de redes metabólicas enquanto erros analíticos a restrição .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1067px;" width="1065">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">226904</td>
			<td style="width:253px;">derivitization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">capillary GC column HP-5MS column (30 m &#215; 0.25 mm &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;">AG19091S-433</td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m particle size)</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>instrumentation</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">2 mL glass vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">46610-722</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">autosampler vials</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">97055-324; 9467671</td>
			<td>sample vials</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Chloroform</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>JT9174-3</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">Ethanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67002.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">methanol</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH85681.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">pyridine</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td style="width:123px;">BDH67007.400</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">178837</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">C8-C24 fatty acid methyl ester</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">CRM18918</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">24589-78-4</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:617px;">Suwanee River Fulvic Acid standard</td>
			<td style="width:73px;">International Humic Substances Society</td>
			<td style="width:123px;">2S101F</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">trimethylchlorosilane</td>
			<td style="width:73px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89595</td>
			<td>standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Tuning Solution</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">FTICR-MS analysis software</td>
			<td style="width:73px;">Bruker</td>
			<td colspan="2">Compass DataAnalysis 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:617px;">Formularity Software</td>
			<td style="width:73px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">Formularity</td>
			<td style="width:253px;">available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">GC-MS</td>
			<td style="width:73px;">Agilent</td>
			<td colspan="2">Agilent GC 7890A with MSD 5975C</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:617px;">silica-based sorbent</td>
			<td style="width:73px;">Phenomenex (Torrance, CA)</td>
			<td colspan="2">Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:617px;">NMR TUBE 3MM 8 150 CS5</td>
			<td style="width:73px;">VWR International</td>
			<td>KT897820-0008</td>
			<td>NMR tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:617px;">Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">Varian Inova</td>
			<td>Varian Direct Drive 600-MHz</td>
			<td>NMR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chenomx NMR Suite 8.3</td>
			<td style="width:73px;">Chenomx</td>
			<td>Chenomx NMR Suite</td>
			<td>NMR software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultra-performance liquid chromatograph&#160;</td>
			<td style="width:73px;">waters</td>
			<td>Aquity UPLC H&#160;</td>
			<td>liquid chromatograph&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:73px;">ThermoFisher</td>
			<td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td>
			<td>mass spectrometer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-throughput complementary high-resolution analytical techniques for characterizing complex natural organic matter mixtures

Matéria orgânica natural (NOM) é composta por uma mistura altamente complexa de milhares de compostos orgânicos que, historicamente, revelou-se difícil caracterizar. No entanto, para entender os termodinâmicos e cinéticos de controles na produção de gás (dióxido de carbono [CO2] e [CH4] de metano) com efeito de estufa resultantes da decomposição de NOM, uma caracterização do nível molecular juntamente com microbiana análises de Proteome é necessário. Além disso, clima e mudanças ambientais são esperadas para perturbar os ecossistemas naturais, potencialmente perturbador interações complexas que influenciam tanto o fornecimento de substratos matéria orgânica e microorganismos realizando as transformações. Uma detalhada caracterização molecular da matéria orgânica, proteomics microbiana e os caminhos e transformações pelo qual a matéria orgânica é decomposta será necessária prever a direção e a magnitude dos efeitos das mudanças ambientais. Este artigo descreve um throughput metodológica para caracterização do metabólito abrangente em uma única amostra por injeção direta de Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectrometria de massa de cromatografia gasosa (GC-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) e análise proteômica. Essa abordagem resulta em um conjunto de dados totalmente emparelhados que melhora a confiança estatística para inferir caminhos de decomposição de matéria orgânica, a resultante de CO2 e taxas de produção de4 CH e suas respostas a perturbação ambiental. Aqui apresentamos os resultados da aplicação deste método para NOM amostras coletadas de turfeiras; no entanto, o protocolo é aplicável para qualquer amostra NOM (por exemplo, turfa, solos florestais, sedimentos marinhos, etc.).

Realizamos o protocolo descrito análise complementar e comparado a turfa com profundidade no pântano S1 no site Spruce e turfeiras resposta sob mudando ambientes (SPRUCE) em Minnesota, EUA. Estes resultados são comparados aos de um pântano de permafrost e fen do norte da Suécia, para mostrar como sites podem variar em atividades metabólito e enzima. Nós identificamos 3.312 enzimas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimas com profundidade revela que o número de enzimas declina acentuadamente en...

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Este protocolo descreve o método para caracterização molecular abrangente e imparcial de uma única amostra usando espectrometria de massa, usando plataformas de metabolômica, proteômica e lipidômica, e plataformas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. O significado dessa abordagem é que podemos caracterizar um sistema biológico a jusante do genoma, através da identificação de diferentes tipos de moléculas, permitindo-nos inferir vias metabólicas e decomposição. Técnica de Extração Sequencial, permitir a extração de compostos polares biodisponíveis usando água, seguido por MPLEx para capturar quaisquer compostos polares adicionais ou metabólitos, bem como proteínas e lipídios de uma única amostra.A demonstração visual deste método é fundamental porque orienta o cientista através da separação das três camadas durante a segunda etapa de extração, e da divisão dos extratos entre diferentes instrumentos de análise. Análises multimicômicas integrativas capacitam investigações mais eficazes e compreensão completa de sistemas biológicos complexos. Este método robusto extrai uma ampla diversidade de moléculas e é aplicável a diversos tipos de amostras.Inicie este procedimento com coleta e elaboração das amostras conforme descrito no protocolo de texto. Usando um utensílio de aço inoxidável lavado, aliquot 50 miligramas de cada uma das amostras secas em dois tubos de vidro mililitros individuais. Adicione um mililitro de água destilada e desgaseada a cada amostra.Em seguida, tampe os frascos e agite por duas horas em uma mesa de agitação. Centrifugar as amostras a 15 mil vezes a gravidade por 30 minutos. E então permitir que as soluções fiquem em temperatura ambiente por 20 minutos.Decante e salve o supernaente de cada amostra. Realize uma Extração MPLEx nos resíduos extraídos agora de água repetindo essas etapas de extração. Exceto para substituir um menos 20 graus celsius de quatro a três clorofórmio à mistura de metanol para a água destilada e desgasegada.Separe cuidadosamente as duas camadas de solventes resultantes, que serão visualmente distinguíveis através da remoção da camada superior por tubulação cuidadosa. Seque a camada não polar inferior no secador congelador. Assim que estiver seco, adicione cinco microliters de clorofórmio e 195 microliters de metanol se analisar nos próximos dias.Para melhorar a eficiência de ionização de eletrospray para a espectrometria de massa de ressonância ciclotron de íons de ion de ion fourier-transform, abreviado FTICR-MS por injeção direta. Diluir o extrato de clorofórmio de um a um em metanol, e a água extrair dois a um em metanol. Calibrar o espectrômetro FTICR injetando diretamente 100 microliters de uma solução de ajuste, abrangendo uma faixa de massa de aproximadamente 100 a 1.300 daltons, no FTICR-MS.Injete 100 microlitres do padrão Suwannee River Fulvic Acid à fonte de ionização de eletrospray. Acoplado ao espectrômetro FTICR através de uma bomba de seringa definida para uma taxa de fluxo de 3,0 microliters por minuto. Coloque a tensão da agulha em 4,4 quilovolts positivos.Enfileirar de uma a 100 massas para a taxa de carga e o capilar de vidro a 180 graus celsius. Inspecione os espectros resultantes usando o software de análise para confirmar a qualidade dos dados. Agora, introduza 100 microliters de cada extrato via injeção direta na fonte de ionização de eletrospray, acoplado ao espectrômetro FTICR através de uma bomba de seringa definida para uma taxa de fluxo de 3,0 microliters por minuto.Defina os parâmetros como antes. Ajuste o tempo de acumulação de íons para cada amostra ou grupo de amostras para explicar a variação na concentração de carbono. Colete 144 scans para cada amostra, faça uma média dos exames e, em seguida, realize uma calibração interna usando uma série CH2 homólogo.Seque os extratos usando um concentrador e salve o restante dos extratos para espectrometria de massa de cromatografia gasosa subsequente, espectrometria de massa cromatografia líquida e análise de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Para se preparar para o GC-MS, primeiro prepare amostras de controle em branco conforme detalhado no protocolo de texto. Para proteger os grupos de carbinol, adicione 20 microlitadores de 30 miligramas por cloridrato de methoxamina mililitro em Paradyne a cada uma das amostras, incluindo os extratos de metanol, os extratos de água, os espaços em branco e as amostras de calibração FAME.Sele os frascos com tampas. Vórtice os extratos por 20 segundos, em seguida, sonicar os extratos por 60 segundos. Centrifugar os extratos a 37 graus celsius por 90 minutos a 100 vezes a gravidade.Adicione 80 microliters de MSTFA com 1%trimtilcloosilano em cada amostra. Após vórtices e sonicar os extratos como antes, centrifugar os extratos novamente a 37 graus celsius por 30 minutos a 100 vezes a gravidade. Após o resfriamento extratos para temperatura ambiente, transfira para frascos de autosampler GC-MS.Proceda à análise e processamento de dados do GC-MS conforme descrito no protocolo de texto. Para se preparar para a análise de RMR de estado líquido, diluir o restante dos extratos de água em 10% com um padrão interno DSS de cinco mililitros. Transfira a mistura para um tubo NMR de vidro de três milímetros de diâmetro externo de três milímetros.Proceda à análise de RMN e ao processamento de dados conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a análise lipidomica LC-MS, injete 10 microliters de cada extrato em um sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho, acoplado a um espectrômetro de massa Orbitrap usando uma coluna híbrida de superfície carregada de fase invertida. Defina um gradiente de 34 minutos conforme listado no protocolo de texto a uma taxa de fluxo de 250 microliters por minuto.Use modos de ionização negativos e positivos com maior dissociação de colisão de energia e dissociação induzida por colisão. Para realizar a análise da proteômica, primeiro extrair proteínas de acordo com o protocolo MPLEx para o restante da fase do metanol, conforme descrito no protocolo de texto. Peat foi comparado com a profundidade no pântano S1 no Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments ou SPRUCE site em Minnesota, EUA.3.312 enzimas foram identificadas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimárias com profundidade revela que o número de enzimas diminui acentuadamente entre 15 centímetros e 45 centímetros no Pântano SPRUCE. Para mostrar como os locais podem variar em atividades metabólitos e enzimas, os resultados do SPRUCE são comparados aos de um Permafrost Bog e Fen no norte da Suécia.Ao todo foram identificados 67.040 metabólitos em todas as amostras de Turfa SPRUCE a partir da combinação de análises FTICR-MS, NMR, GC-MS e LC-MS. Mostrada aqui é a fração relativa de diferentes classes químicas identificadas através de várias técnicas nas diferentes profundidades. Enquanto aminoácidos e açúcares diminuem com profundidade, isso não é observado para lipídios.Ao validar metabólitos cruzados identificados em todas as análises contra o Banco de Dados KEGG foi determinado que os compostos identificados estão envolvidos em vias metabólicas comuns, como ciclo de ácido tricarboxílico, glicolise e metabolismo de açúcar. Ao longo deste procedimento é fundamental estar atento às possíveis fontes de contaminação. A partir da coleta de amostras por meio da análise, as amostras não devem entrar em contato com plásticos atrelados que podem afetar negativamente a ionização.Muitos dos solventes utilizados durante o procedimento de extração são perigosos ou inflamáveis. Use sempre EPI apropriado para evitar o contato com a pele e o contato visual, bem como para evitar contaminar amostras.

Research

JoVE Journal

Environment

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Ambiente

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Avaliação da lábil carbono orgânico no solo usando procedimentos seqüenciais Fumigação de incubação

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Understanding Dissolved Organic Matter Biogeochemistry Through In Situ Nutrient Manipulations in Stream Ecosystems

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Compreender orgânico dissolvido Matéria Biogeoquímica Através<em&gt; In Situ</em&gt; Nutrientes Manipulações no córrego Ecossistemas

Dissolved organic matter (DOM) is a highly diverse mixture of molecules providing one of the largest sources of energy and nutrients to stream ecosystems. ...

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

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Automatizado, de alta resolução Sistema de Coleta Móvel para a análise de azoto isotópica de NO<sub&gt; x</sub

Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in a Flow Tube Reactor

Produção e medição de partículas orgânicas em um reator de tubo de fluxo

Organic particulate matter (PM) is increasingly recognized as important to the Earth's climate system as well as public health in urban regions, and the ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

Produção e medição de partículas orgânicas na câmara ambiental de Harvard

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

Improving Infrared Spectroscopy Characterization of Soil Organic Matter with Spectral Subtractions

Melhorando a espectroscopia de infravermelho de caracterização da matéria orgânica do solo com subtrações espectrais

Soil organic matter (SOM) underlies numerous soil processes and functions. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy detects infrared-active organic ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolamento do conteúdo do reservatório glândula Mandibular de Bornean ' explodindo das formigas (Formicidae) para Volatilome análise por GC-MS e MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Avaliar as habilidades de remoção de partículas de árvore folhas

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Characterizing Microbiome Dynamics ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...