Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

ونحن نشكر ستيف فينكبينر وأعضاء في مختبر فينكبينر للرائد مجهرية الروبوتية. ونشكر أيضا دان بيساتش لبناء البرمجيات الأولية اللازمة لمعالجة الصور والآلي تحليل البقاء على قيد الحياة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية و "السكتة الدماغية" (NINDS) R01-NS097542، جامعة ميشيغان البروتين للطي المرض المبادرة، وأن أربور نشطة ضد المرض.

وأقر جميع أعمال الحيوانات الفقارية اللجنة المتعلقة باستخدام ورعاية الحيوانات في جامعة ميشيغان (بروتوكول # PRO00007096). التجارب هي التخطيط بعناية التقليل من عدد الحيوانات التضحية. يتم إيواء الحوامل الإناث البرية من نوع (WT)، غير المعدلة وراثيا "إيفانز طويلة" الفئران (الجرذ النرويجي) منفردة ?...

<ol>
	<li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+health+and+disease.">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li><li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+assays+for+drug+discovery.">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li><li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death:+a+common+mechanism+in+necrosis,+apoptosis+and+autophagy.">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible,+ischemic+liver+cell+injury.">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li><li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells.">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li><li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage.">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li><li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death.">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li><li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival.">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+survival+analysis+using+Cox&#8217;s+regression+model.">Multivariate survival analysis using Cox&#8217;s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization.">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606 (2018).</li><li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

ويرد هنا، منهجية لرصد مباشرة بقاء الخلايا العصبية على أساس خلية واحدة. على عكس الاختبارات التقليدية لموت الخلايا التي تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة ومجموعات سكانية بأكملها من الخلايا، يسمح هذا الأسلوب للتقييم المستمر لمجموعة متنوعة من العوامل مثل مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروت...

موت الخلايا غير طبيعية عامل قيادة في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان، نيوروديجينيريشن، والسكتة الدماغية1. فحوصات قوية وحساسة لموت الخلية ضرورية لتوصيف هذه الاضطرابات، فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية لتمديد أو تقليص الخلوية البقاء على قيد الحياة. لا يوجد حاليا عشرات من أساليب لقياس موت الخلية، أما مباشرة أو من خلال علامات البديل2. على سبيل المثال، يمكن تقييم موت الخلية بصريا مع المساعدة من الأصباغ الحيوية التي وصمة بشكل انتقائي خلايا ميتة أو حية3، أو عن طريق رصد مظهر فوسفوليبيدات محددة على غشاء البلازما4،5،6 . يمكن أيضا استخدام القياسات للمكونات داخل الخلايا أو نواتج الأيض الخلوية تسربها إلى وسائل الإعلام عند انحلال الخلوية كوكلاء للخلية وفاة7،8. وبدلاً من ذلك، يمكن تقريبها صلاحية الخلوية بتقييم النشاط الأيضي9،10. على الرغم من أن هذه الأساليب توفير وسائل سريعة لتقييم بقاء الخلية، فليست دون محاذير. ويلاحظ كل تقنية الثقافة السكان واحدة، مما يجعل من المستحيل التمييز بين خلايا فردية وفريدة من نوعها معدلات البقاء على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك، هذه الاختبارات المستندة إلى السكان غير قادر على قياس العوامل التي قد تكون هامة لموت الخلايا، بما في ذلك مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروتين أو التعريب. في كثير من الحالات، هذه فحوصات تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة، ولا تسمح للمراقبة المستمرة للخلايا على مر الزمن.
وفي المقابل، مجهرية الفلورية الطولية هو منهجية مرنة للغاية التي ترصد مباشرة واستمرار خطر الوفاة على أساس خلية واحدة11. وباختصار، مجهرية الفلورية الطولية تمكن آلاف خلايا الفردية لتعقب على فترات منتظمة لفترات طويلة من الزمن، والسماح بتحديدات دقيقة لموت الخلايا والعوامل التي تعزز أو منع موت الخلايا. عند قاعدته، ينطوي الأسلوب تعداء عابرة أو توصيل الخلايا مع ناقلات ترميز البروتينات الفلورية. ثم ينشأ من fiduciary فريدة من نوعها، وموضع كل الخلية transfected فيما يتعلق بهذا المعلم يسمح للمستخدم بالصورة، وتعقب الخلايا الفردية على مدى ساعات أو أيام أو أسابيع. عندما ينظر إلى هذه الصور تسلسلياً، موت الخلية يتسم بالتغيرات المميزة في الأسفار ومورفولوجيا وتجزؤ الجسم الخلية، مما يتيح تخصيص وقت الوفاة لكل خلية. معدل الوفيات، تحدد بواسطة الدالة المخاطر المحسوبة يمكن ثم كمياً مقارنة بين الشروط، أو تتصل بتحديد الخصائص الخلوية باستخدام وحيد المتغير أو المتغيرات تحليل المخاطر النسبية كوكس12. معا، تمكين هذه النهج بالتمييز دقيقة وموضوعية لمعدلات موت الخلية بين السكان الخلوية، وتحديد المتغيرات التي تنبئ بشكل ملحوظ موت الخلية و/أو البقاء على قيد الحياة (الشكل 1).
على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لرصد البقاء على قيد الحياة في أي نوع الخلية بعد الانقسامية في مجموعة متنوعة من تنسيقات الطلاء، سيصف هذا البروتوكول شروط ترانسفيكتينج وتصوير الخلايا العصبية القشرية الفئران مثقف في صفيحة 96-جيدا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

فحوصات سيتوتوكسيسيتي القياسية، التي تتطلب جمع ليساتيس أو الخلايا الثابتة في نقاط زمنية متعددة، حدت من الحساسية والقدرة على تقييم العوامل التي تؤثر على مصير الخلايا العصبية. وتتطلب هذه الاختبارات مراقبة السكان منفصلة من الخلايا عند نقاط زمنية منفصلة. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن يتبع الخلايا الفردية مستقبلي مع مرور الوقت، الحد من شدة القدرة على تميز ما إذا كانت الأحداث سوبسيلولار، مثل تشكيل بونكتا أو ميسلوكاليزيشن البروتين، السائقين المسببة للمرض، وردود التماثل الساكن، أو الظواهر مجرد مصادفة. خلية واحدة طولية الفحص المجهري يتغلب على هذه القيود، يسمح للباحث تحديد الاختلافات في البقاء على قيد الحياة بين السكان ورسم العلاقات السببية مع زيادة حساسية. وسيتناول هذا الفيديو دليل سير عمل ممثل لتجارب قياس بقاء خلية واحدة من الفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية معربا عن علامة نيون بروتين. المشاهد سوف تعلم كيفية تحقيق ترانسفيكشنز ذات الكفاءة العالية، وجمع ومعالجة الصور يتيح تتبع المحتملين من خلايا فردية، وقارن النسبي بقاء السكان الخلايا العصبية باستخدام تحليل المخاطر النسبية كوكس.

استخدام الإجراء تعداء الموصوفة هنا، DIV4 الفئران الخلايا العصبية القشرية تم transfected مع بلازميد ترميز mApple البروتين الفلورسنت. بدءاً من تعداء بعد 24 ساعة، تم تصويرها الخلايا بالميكروسكوب الأسفار كل 24 ساعة لمدة 10 أيام متتالية. الصور الناتجة كانت نظمت كما هو مبين في ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

نقدم هنا، بروتوكولا لرصد البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي كثيرا التنبؤ بموت الخلايا.

رصد بقاء الخلايا العصبية عن طريق الفحص المجهري Fluorescence طولية

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

يمكّن هذا البروتوكول الباحثين من مراقبة البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي تتنبأ بشكل كبير بموت الخلية أو بقائها. تقيّم مقايسات السمية الخلوية التقليدية مجموعات الخلايا وتفتقر إلى القدرة على التمييز بين الخلايا الفردية. يسمح المجهر الطولي بتخصيص وقت الوفاة لكل خلية في السكان.هذه التقنية مناسبة تماما لتقييم العلاجات الجديدة للأمراض العصبية وغيرها من الحالات. وقد ثبت أن هذه الطريقة لا تقدر بثمن لاستكشاف آليات المرض في الظروف العصبية التنكسية، ويمكن تطبيقها مع نفس الفعالية تجاه الاضطرابات الأخرى التي موت الخلايا هو من الفائدة. وقد يكافح الباحثون من أجل تحقيق كفاءات كافية في عملية نقل النفايات دون سمية لا داعي لها.وينبغي أن الممارسة مع pipet متعدد القنوات والإلمام مع بروتوكول يقلل من هذه الصعوبة مع مرور الوقت. المجهر هو منهجية بصرية بطبيعتها. لذلك، قد يكون من السهل فهم هذه التقنية من خلال مشاهدة بالإضافة إلى القراءة.للبدء، والجمع بين كمية مناسبة من وسائل الإعلام المصل انخفاض ومبيد transfection في أنبوب واحد، وانخفاض وسائل الإعلام في المصل والحمض النووي في أنبوب منفصل. احتضانهم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، والجمع بين محتويات كل من أنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.استخدام الأنابيب متعددة القنوات وأحواض بلاستيكية معقمة لغسل الخلايا العصبية القشرية مرتين مع 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام القاعدية العصبية في البئر. وتخزين وسائل الإعلام مكيفة وغيرها من وسائل الإعلام المتبقية في 37 درجة مئوية. استبدل NBM بـ 100 ميكرولترات من محلول NBKY المعد مسبقًا في البئر.بعد 20 دقيقة، pipet 50 ميكرولترات من كاشف transfection وخليط الحمض النووي قطرة في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شطف الخلايا مرتين مع حل NBKY.ثم إضافة 100 ميكروليتر من وسائل الإعلام مكيفة و 100 ميكرولترات من حل ان بي سي إلى الآبار. لبدء تصوير الخلايا، ضع لوحة 96 بئرًا على مجهر فلوري. استخدم علامة ائتمانية فريدة لكل لوحة كمرجع للمحاذاة المستقبلية، واحفظ صورة كمرجع مستقبلي.ثم انتقل إلى المناطق ذات الاهتمام وسجل إحداثيات س و ص الخاصة بهم بالنسبة إلى العلامة. استخدم علامة ائتمانية فريدة لكل لوحة كمرجع للمحاذاة المستقبلية، واحفظ صورة كمرجع مستقبلي. وأخيراً، ركز على الخلايا المصابة عبر الثانية التي تعبر عن ملصق فلوري.التقاط صور متعددة على فترات متباعدة بانتظام في القنوات الفلورية المناسبة. لتبدأ مع معالجة الصور، انقر نقرا مزدوجا على رمز فيجي. ثم انقر ثم اسحب ماكرو معالجة تسطير أسفل السطر إلى شريط فيجي لفتح الماكرو داخل فيجي.ضبط الأسطر من اثنين إلى سبعة من الصورة تسطير أسفل السطر معالجة الماكرو وفقا لبروتوكول النص. ثم، انقر على خياطة، ومن ثم خياطة الشبكة / جمع. اضبط الإعدادات داخل القوائم المنسدلة، واكتبها، ثم اطلبها، حتى يتم إنتاج صورة مخيط بدقة.ضبط نوع الشبكة ومتغيرات ترتيب الخيوط في السطور ثمانية وتسعة وفقاً لهذه التحديدات. ثم، ضبط خط 10 لتحديد عدد الصور في البئر وتعيين خيار طرح الخلفية في سطر 14 إلى true، إذا لزم الأمر. قم بضبط الخط 15 لتعيين نصف قطر الكرة المتداولة وفقاً لبروتوكول النص، ثم انقر فوق تشغيل.وأخيرا، فتح كومة صورة الإخراج والتعرف يدويا الخلايا العصبية الميتة وفقا لبروتوكول النص. تسجيل البيانات في ملف جدول بيانات. لإجراء التحليل الإحصائي، انقر نقراً مزدوجاً على أيقونة البقاء على قيد الحياة.R النصي. تمييز السطر الثاني وانقر فوق زر التشغيل لتحميل مكتبة البقاء على قيد الحياة. ثم قم بتغيير المسار في السطر الخامس لاستدعاء جدول بيانات الإدخال ثم انقر فوق زر التشغيل.تمييز الخطين الثامن و التاسع، وانقر على زر التشغيل لإجراء تحليل المخاطر النسبية في كوكس. تمييز الخطوط 12 إلى 16 و 19 إلى 24. انقر فوق زر التشغيل لرسم الخطر التراكمي للموت وبيانات البقاء على قيد الحياة كمنحنى كابلان ماير.في هذه الدراسة، تم إصابة الخلايا العصبية القشرية الفئران في أربعة أيام بعد الطلاء مع ترميز البلازميد البروتين الفلورسنت M التفاح. 24 ساعة بعد transfection، تم تصوير الخلايا العصبية عن طريق المجهر الفلوريسنس كل 24 ساعة لمدة 10 أيام متتالية. بعد الحصول على الصور، تمت معالجة الصور وفحصها بالتتابع للاحتفال بموت الخلية.تم تحديد وقت الوفاة لكل خلية من خلال التغيرات في الفلور، مورفولوجيا، وتفتيت جسم الخلية. كوكس تحليل المخاطر النسبية التي أجريت على بيانات البقاء على قيد الحياة من الخلايا العصبية متحولة أدى إلى نسبة خطر 2.2. وأشارت هذه النتيجة إلى معدل أسرع من الوفيات في الخلايا العصبية متحولة بالمقارنة مع السكان من النوع البرية.أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو pipet بعناية. إن تقليل التعرض للهواء وتجنب الفقاعات أمر بالغ الأهمية لنجاح عملية نقل الهواء. بعد التنمّر، يمكن استخدام المجهر الفلوري الطولي لتتبع العوامل المختلفة التي قد تساهم في موت الخلايا، بما في ذلك توطين البروتين، ودوران، ومستوى التعبير، بالإضافة إلى بقاء الخلية.وفي مجال الانحطاط العصبي، ألقت الطبيعة الديناميكية للمجهر الطولي الضوء على ما إذا كان تجميع البروتينات المرتبطة بالأمراض يمثل حدثاً ساماً أو وقائياً. ولا تشكل أي من هذه الكواشف أو الأدوات خطرا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

في فيفو رصد للتعبير الجيني الإيقاعية على مدار الساعة في نواة Suprachiasmatic الماوس استخدام الصحفيين الأسفار

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

البقاء علي قيد الحياة خليه purkinje في الثقافات شريحة المخيخ الوراثية

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

تحريض الموت الدماغي في الفئران باستخدام مراقبة ضغط الدم داخل الشرايين والتهوية عبر القصبة الهوائية

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...