Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Wij danken Steve Finkbeiner en leden van de lab Finkbeiner voor baanbrekende robotic microscopie. Wij danken ook Dan Peisach voor gebouw de eerste software vereist voor beeldverwerking en geautomatiseerde survival analyse. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en Stroke (NINDS) R01-NS097542, de Universiteit van Michigan Protein Folding ziekte initiatief en Ann Arbor actief tegen ALS.

Alle gewervelde dieren werk werd goedgekeurd door de Commissie op het gebruik en de verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan (protocol # PRO00007096). Experimenten zijn zorgvuldig gepland om te minimaliseren van het aantal dieren geofferd. Zwangere vrouwen wild-type (WT), niet-transgene lange Evans ratten (Rattus norvegicus) zijn afzonderlijk ondergebracht in kamers uitgerust met milieu verrijking en verzorgd door de eenheid voor laboratorium dier geneeskunde (ULAM) aan de Universiteit van Michigan...

<ol>
	<li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+health+and+disease.">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li><li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+assays+for+drug+discovery.">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li><li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death:+a+common+mechanism+in+necrosis,+apoptosis+and+autophagy.">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible,+ischemic+liver+cell+injury.">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li><li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells.">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li><li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage.">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li><li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death.">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li><li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival.">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+survival+analysis+using+Cox&#8217;s+regression+model.">Multivariate survival analysis using Cox&#8217;s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization.">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606 (2018).</li><li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

Hier, wordt methodologie rechtstreeks volgen neuronale overleven op basis van de eencellige gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele testen voor celdood die beperkt tot discrete tijd punten en de hele bevolking van cellen zijn, deze methode die geschikt is voor de continue beoordeling van een aantal factoren, zoals cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie, en kunt bepalen hoe elke factor cellulaire overleving in een prospectieve wijze beïnvloedt.
Deze methode kan worden a...

Abnormale celdood is een drijvende factor in vele ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratie en lijn1. Robuust en gevoelige testen voor de dood van de cel zijn essentieel voor de karakterisatie van deze aandoeningen, evenals de ontwikkeling van therapeutische strategieën tot verlenging of vermindering van de cellulaire overleven. Er zijn momenteel tientallen technieken voor het meten van celdood, ofwel rechtstreeks ofwel via surrogaat markeringen2. Bijvoorbeeld, kan celdood visueel worden beoordeeld met behulp van vitale kleurstoffen die selectief vlek dode of levende cellen3, of door de controle van het uiterlijk van specifieke fosfolipiden op het plasmamembraan4,5,6 . Metingen van intracellulaire componenten of cellulaire metabolieten vrijkomen van de media bij cellulaire ontbinding kunnen ook worden gebruikt als proxy's voor7,8van de dood van de cel. U kunt ook kan cellulaire levensvatbaarheid worden benaderd door metabole activiteit9,10te beoordelen. Al deze methoden snelle middel om de beoordeling overleving van de cel bieden, zijn zij niet zonder voorbehoud. Elke techniek merkt de cultuur als een enkele populatie, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden tussen afzonderlijke cellen en hun unieke tarieven van overleving. Bovendien zijn deze gehaltebepalingen bevolking gebaseerde kunnen factoren die belangrijk voor de dood van de cel zijn kunnen, met inbegrip van cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie gemeten. In veel gevallen, deze tests zijn beperkt tot discrete tijd punten, en sta niet voor de continue waarneming van cellen na verloop van tijd.
In tegenstelling, is longitudinale fluorescentie microscopie een zeer flexibele methodologie die rechtstreeks en continu het risico van overlijden op een eencellige basis11 monitoren. Kortom, kunt longitudinale fluorescentie microscopie duizenden afzonderlijke cellen worden bijgehouden op regelmatige tijdstippen gedurende langere perioden van tijd, waardoor nauwkeurige metingen van celdood en de factoren die het versterken of onderdrukken van celdood. Aan de basis wordt bij deze methode de voorbijgaande transfectie of signaaltransductie van cellen met vectoren codering van fluorescente proteïnen. Een unieke fiduciaire is dan vastgesteld en de positie van elke transfected cel met betrekking tot deze mijlpaal kan de gebruiker image & bijhouden van afzonderlijke cellen in de loop van uren, dagen of weken. Als deze beelden opeenvolgend worden weergegeven, wordt celdood gekenmerkt door karakteristieke wijzigingen in fluorescentie, morfologie en versnippering van het lichaam van de cel, waardoor de toewijzing van een moment van overlijden voor elke cel. Het berekende percentage van de dood, bepaald door de gevaar-functie, kan vervolgens worden kwantitatief vergeleken tussen voorwaarden, of aan het selecteren van cellulaire kenmerken met behulp van univariate of multivariate Cox proportionele gevaren analyse12gerelateerde. Deze benaderingen kunnen samen de correcte en objectieve discriminatie van tarieven van celdood onder mobiele bevolkingsgroepen, en de identificatie van variabelen die aanzienlijk celdood en/of survival (Figuur 1 voorspellen).
Hoewel deze methode kan worden gebruikt om te overleven in een post mitotische celtype in een verscheidenheid van formaten plating controleren, zal dit protocol voorwaarden voor transfecting en corticale neuronen rat gekweekt in een 96-wells-plaat imaging beschrijven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Standaard cytotoxiciteit testen, waarvoor de collectie lysates of vaste cellen op meerdere tijdstippen, hebben beperkte gevoeligheid en capaciteit te beoordelen factoren die van invloed zijn neuronale lot. Deze tests vereisen de waarneming van afzonderlijke populaties van cellen in discrete tijd punten. Dientengevolge, kunnen niet afzonderlijke cellen prospectief na verloop van tijd ernstig beperken het vermogen om te discrimineren of subcellular gebeurtenissen, zoals de vorming van de puncta of eiwit mislocalization, pathogene bestuurders van ziekte, homeostatische reacties, worden gevolgd of louter toeval verschijnselen. Eencellige longitudinale microscopie overwint deze beperkingen, waardoor de onderzoeker om te bepalen van verschillen in overleving tussen populaties en tekenen van causale relaties met verbeterde gevoeligheid. Deze video-gids zal schetsen een representatieve workflow voor experimenten eencellige voortbestaan van rat primaire corticale neuronen uitdrukken van een fluorescente proteïne marker te meten. De kijker leert hoe bereiken hoogrenderende transfections, verzamelen en verwerken van beelden, waardoor de potentiële tracking van afzonderlijke cellen en vergelijken van de relatieve overleving van neuronale populaties met behulp van Cox proportionele gevaren analyse.

Volgens de procedure van de transfectie hier, waren DIV4 rat corticale neuronen transfected met een plasmide codering van de fluorescente proteïne mApple. Begin 24u na transfectie, werden cellen beeld door fluorescentie microscopie elke 24u voor 10 opeenvolgende dagen. De resulterende afbeeldingen werden georganiseerd zoals aangegeven in Figuur 2, dan gestikt, gestapeld en scoorde voor de dood van de cel (Figuur 1). <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Hier presenteren we een protocol om te controleren van de overleving op basis van de eencellige en identificeren van variabelen die aanzienlijk celdood voorspellen.

Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de overleving te controleren op een eencellige basis en identificeren variabelen die aanzienlijk voorspellen celdood of overleving. Conventionele cytotoxiciteitstesten beoordelen populaties cellen en missen het vermogen om individuele cellen te discrimineren. Longitudinale microscopie maakt de toewijzing van het tijdstip van overlijden voor elke cel in een populatie mogelijk.Deze techniek is zeer geschikt voor het evalueren van nieuwe therapieën voor neurodegeneratieve ziekten en andere aandoeningen. Deze methode heeft bewezen van onschatbare waarde voor het verkennen van ziektemechanismen in neurodegeneratieve aandoeningen, en kan worden toegepast met gelijke werkzaamheid ten opzichte van andere aandoeningen waarin celdood is van belang. Onderzoekers kunnen worstelen met het bereiken van adequate transfectie efficiëntie zonder onnodige toxiciteit.De praktijk met de multichannel pipet en vertrouwdheid met het protocol moet verminderen deze moeilijkheidsgraad na verloop van tijd. Microscopie is een inherent visuele methodologie. Daarom kan de techniek gemakkelijker worden begrepen door te kijken in aanvulling op het lezen.Om te beginnen, combineren de juiste hoeveelheid verminderde serum media en transfectie reagens in een buis, en verminderde serum media en DNA in een aparte buis. Broed ze vijf minuten op kamertemperatuur. Combineer vervolgens de inhoud van beide buizen en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Gebruik een multichannel pipet en steriele plastic troggen om de corticale neuronen twee keer te wassen met 100 microliters neurale basale media per put. En bewaar de geconditioneerde media en andere resterende media op 37 graden Celsius. Vervang de NBM door 100 microliters van eerder voorbereide NBKY oplossing per goed.Na 20 minuten, pipet 50 microliters van de transfectie reagens en DNA-mengsel dropwise in elke put. Broed de cellen 20 minuten in op 37 graden Celsius. Spoel de cellen twee keer af met nbky-oplossing.Voeg vervolgens 100 microliter geconditioneerde media en 100 microliter nbc-oplossingen toe aan de putten. Om te beginnen met het beeldvorming van de cellen, plaats de 96 goed plaat op een fluorescerende microscoop. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie.Navigeer vervolgens naar interessegebieden en noteer hun x- en y-coördinaten ten opzichte van het merk. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie. Tot slot, focus op de doorgetransfecteerde cellen uitdrukken van een fluorescerend label.Maak meerdere foto's met regelmatig gesprede intervallen in de juiste tl-kanalen. Om te beginnen met het verwerken van afbeeldingen, dubbelklikt u op het Fiji-pictogram. Klik vervolgens op en sleep de afbeelding onder de verwerkingsmacro naar de Fiji-balk om de macro binnen Fiji te openen.Lijn twee tot en met zeven van de afbeelding aanpassen, wordt de verwerkingsmacro volgens het tekstprotocol weergegeven. Klik vervolgens op stiksels en vervolgens op het raster/de verzameling stiksels. Pas de instellingen in de vervolgkeuzemenu's, het type en de volgorde aan totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.Pas rastertype en steekvolgordevariabelen in lijnen acht en negen aan volgens deze selecties. Pas vervolgens regel 10 aan om het aantal afbeeldingen per put op te geven en stel de optie achtergrondaftrekking in lijn 14 in op true, indien nodig. Pas regel 15 aan om de straal van de rollende bal in te stellen volgens het tekstprotocol en klik op Uitvoeren.Ten slotte, open de uitvoer afbeelding stapels en handmatig identificeren van de dode neuronen volgens het tekstprotocol. Neem de gegevens op in een spreadsheetbestand. Als u statistische analyses wilt uitvoeren, dubbelklikt u op het pictogram voor het overleven.R-script. Markeer regel twee en klik op de run-knop om de overlevingsbibliotheek te laden. Wijzig vervolgens het pad in regel vijf om de invoerspreadsheet aan te roepen en klik op de knop Uitvoeren.Markeer lijnen acht en negen en klik op de run-knop om de cox proportionele gevarenanalyse uit te voeren. Markeer de lijnen 12 tot en met 16 en 19 tot en met 24. Klik op de run-knop om het cumulatieve risico op overlijden en de overlevingsgegevens als een Kaplan-Meier-curve in kaart te brengen.In deze studie, rat corticale neuronen werden doorgesch doorgesch doorgeschat op vier dagen na beplating met een plasmide codering van het fluorescerende eiwit M appel. 24 uur na de transfectie, neuronen werden afgebeeld door fluorescentie microscopie elke 24 uur voor 10 opeenvolgende dagen. Na het verwerven van afbeeldingen werden beelden verwerkt en achtereenvolgens onderzocht om de celdood te markeren.Het tijdstip van overlijden voor elke cel werd bepaald door veranderingen in fluorescentie, morfologie en fragmentatie van het cellichaam. Cox proportionele gevaren analyse uitgevoerd op de overlevingsgegevens van de mutant neuronen resulteerde in een hazard ratio van 2.2. Dit resultaat wees op een sneller sterftepercentage in de gemuteerde neuronen in vergelijking met de wilde typepopulatie.Het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure is om voorzichtig pipet. Het minimaliseren van blootstelling aan lucht en het vermijden van bellen is van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie. Na transfectie kan longitudinale fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om verschillende factoren bij te houden die kunnen bijdragen aan celdood, waaronder eiwitlokalisatie, omzet en expressieniveau, naast celoverleving.Op het gebied van neurodegeneratie heeft de dynamische aard van longitudinale microscopie licht geworpen op de vraag of de aggregatie van ziekte-geassocieerde eiwitten een toxische of beschermende gebeurtenis vertegenwoordigt. Geen van deze reagentia of instrumenten zijn gevaarlijk.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

Brain Death Inductie bij muizen met behulp van intra-arteriële bloeddruk monitoring en ventilatie via tracheostomie

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...