Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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Wir danken Steve Finkbeiner und Mitglieder des Finkbeiner Lab für zukunftsweisende Robotik Mikroskopie. Wir danken auch Dan Peisach für Gebäude, die die ursprüngliche Software für Bildverarbeitung und automatisiert Überlebensanalyse. Diese Arbeit wurde durch das nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) R01-NS097542, der University of Michigan Protein Folding Disease Initiative und Ann Arbor aktiv gegen ALS finanziert.

Alle Wirbeltiere tierische Arbeit wurde vom Ausschuss für die Nutzung und Pflege von Tieren an der University of Michigan (Protokoll # PRO00007096) genehmigt. Experimente sind sorgfältig geplant, um die Anzahl der Tiere geopfert zu minimieren. Schwangere Frauen-Wildtyp (WT), nicht-transgenen lange Evans Ratten (Rattus Norvegicus) sind einzeln untergebracht, in Kammern mit Umweltanreicherung ausgestattet und betreut vom Referat für Labor Tier Medizin (ULAM) an der University of Michigan, in Übereinstimmung mi...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

Hier präsentiert Methodik neuronaler überleben auf einer Single-Cell-Basis direkt zu überwachen. Diese Methode erlaubt im Gegensatz zur traditionellen Assays für Zelltod, die zu diskreten Zeitpunkten und ganze Bevölkerungen der Zellen beschränkt sind, für die kontinuierliche Bewertung einer Vielzahl von Faktoren wie zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung, und können Sie bestimmen, wie jeder Faktor zellulare überleben in einer prospektiven Weise beeinflusst.
Dies...

Abnorme Zellen der Tod ist ein treibender Faktor in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Neurodegeneration und Takt1. Robust und sensibel Assays für Zelltod sind unerlässlich, um die Charakterisierung dieser Störungen sowie die Entwicklung von therapeutischen Strategien zur Erweiterung oder Reduzierung der zellulären überleben. Derzeit gibt es Dutzende von Techniken zur Messung der Zelltod, entweder direkt oder durch Surrogat-Marker-2. Zum Beispiel kann Zelltod visuell beurteilt werden mit Hilfe der lebenswichtige Farbstoffe, die tote oder lebende Zellen3selektiv beflecken oder durch das Auftreten von bestimmten Phospholipide auf der Plasmamembran4,5,6 Überwachung . Messungen von intrazellulären Komponenten oder zellulären Metaboliten in den Medien auf zelluläre Auflösung freigegeben dient auch als Proxys für Zelle Tod7,8. Alternativ kann zelluläre Lebensfähigkeit angenähert werden, durch die Beurteilung der Stoffwechselaktivität9,10. Obwohl diese Methoden schnelle Mittel zur Bewertung der Zelle überleben bieten, sind sie nicht ohne Vorbehalte. Jede Technik beobachtet die Kultur als eine einzelne Population, wodurch es unmöglich, zwischen den einzelnen Zellen und ihre einzigartige Preise des Überlebens zu unterscheiden. Darüber hinaus können solche bevölkerungsbezogene Assays Faktoren messen, die für Zelltod, einschließlich zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung wichtig sein können. In vielen Fällen diese Tests beschränken sich auf diskreten Zeitpunkten, und erlauben nicht die kontinuierliche Beobachtung von Zellen im Laufe der Zeit.
Im Gegensatz dazu ist längs Fluoreszenzmikroskopie eine hochflexible Methodik, die direkt und kontinuierlich das Risiko des Todes auf eine einzelne Zelle Basis11 überwacht. In Kürze kann längs Fluoreszenzmikroskopie Tausende von einzelnen Zellen verfolgt werden in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum hinweg, ermöglicht die präzise Bestimmung der Zelltod und die Faktoren, die zu verbessern oder zu unterdrücken, Zelltod. An der Basis umfasst der Methode die transiente Transfektion oder Transduktion von Zellen mit Vektoren fluoreszierende Proteine codieren. Eine einzigartige Treuhänder ist dann hergestellt, und die Position der einzelnen transfizierten Zellen in Bezug auf dieses Merkmal ermöglicht dem Benutzer, Bild und verfolgen Sie einzelne Zellen im Verlauf von Stunden, Tagen oder Wochen. Wenn diese Bilder nacheinander angezeigt werden, zeichnet sich Zelltod durch charakteristische Veränderungen in Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung der Zellkörper, ermöglicht die Zuordnung von einer Zeit der Tod für jede Zelle. Die errechnete Rate des Todes, bestimmt durch die Hazard-Funktion kann dann quantitativ im Vergleich zwischen den Bedingungen oder im Zusammenhang mit zelluläre Eigenschaften mit univariaten und multivariaten Cox proportional Gefahren Analyse12auswählen. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die genaue und objektive Diskriminierung der Preise des Zelltods bei der zellularen Bevölkerung sowie die Ermittlung der Variablen, die deutlich Zelltod und/oder überleben (Abbildung 1 Vorhersagen).
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, zu überleben in jeder Post-mitotische Zelle Art in einer Vielzahl von Formaten Plattieren zu überwachen, wird dieses Protokoll Bedingungen für transfecting und imaging-Ratte kortikale Neuronen in einer 96-Well-Platte kultiviert beschreiben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Standard Zytotoxizität Assays, die die Sammlung von Lysates oder festen Zellen zu mehreren Zeitpunkten erfordern, haben nur begrenzte Empfindlichkeit und Fähigkeit zur Bewertung von Faktoren, die Einfluss auf neuronale Schicksal. Diese Tests erfordern die Beobachtung der getrennten Populationen von Zellen zu diskreten Zeitpunkten. Infolgedessen darf nicht einzelne Zellen prospektiv folgen im Laufe der Zeit die Fähigkeit zur Unterscheidung, ob subzelluläre Ereignisse, z. B. Puncta Entstehung oder Protein Mislocalization, pathogenen Treiber von Krankheit, homöostatische Reaktionen stark einschränken, oder rein zufällig Phänomene. Einzellige längs Mikroskopie überwindet diese Einschränkungen, so dass des Forschers um Unterschiede im Überleben zwischen Populationen bestimmen und zeichnen Sie kausale Zusammenhänge mit verbesserte Empfindlichkeit. Dieser video-Anleitung skizziere einen repräsentativen Workflow für Experimente Messung Einzeller Überleben der Ratte primären kortikalen Neuronen einen fluoreszierendes Protein-Marker zum Ausdruck zu bringen. Der Betrachter wird lernen, wie man Hocheffizienz Transfektionen erreichen, sammeln und verarbeiten Bilder ermöglichen die zukünftige Verfolgung einzelner Zellen und das relative Überleben der neuronalen Populationen mit Cox proportional Gefahrenanalyse zu vergleichen.

Mit Hilfe der Transfektion beschriebene hier waren DIV4 Ratte kortikale Neuronen mit einem Plasmid Codierung der fluoreszierenden Proteins mApple transfiziert. Ab 24 h nach Transfektion, wurden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie alle 24 h für 10 aufeinanderfolgende Tage abgebildet. Die resultierenden Bilder wurden organisiert, wie in Abbildung 2gezeigt dann genäht, gestapelt und erzielte für Zelltod (Abbildung 1). <strong cla...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zum Überleben auf eine einzelne Zelle Basis überwachen und Variablen, die deutlich Zelltod Vorhersagen zu identifizieren.

Überwachung der neuronalen Überleben über längs-Fluoreszenz-Mikroskopie

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, das Überleben auf einzelzelliger Basis zu überwachen und Variablen zu identifizieren, die den Zelltod oder das Überleben signifikant vorhersagen. Herkömmliche Zytotoxizitätstests bewerten Populationen von Zellen und sind nicht in der Lage, einzelne Zellen zu diskriminieren. Die Längsmikroskopie ermöglicht die Zuordnung des Todeszeitpunkts für jede Zelle in einer Population.Diese Technik eignet sich gut für die Bewertung neuer Therapien für neurodegenerative Erkrankungen und andere Erkrankungen. Diese Methode hat sich als von unschätzbarem Wert für die Erforschung von Krankheitsmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen erwiesen und könnte mit gleicher Wirksamkeit auf andere Erkrankungen angewendet werden, bei denen der Zelltod von Interesse ist. Forscher können mit der Erreichung angemessener Transfezeffizienzohne übermäßige Toxizität kämpfen.Das Üben mit der Mehrkanalpipetten und die Vertrautheit mit dem Protokoll sollte diese Schwierigkeiten im Laufe der Zeit verringern. Mikroskopie ist eine von Natur aus visuelle Methode. Daher kann die Technik leichter verstanden werden, indem man zusätzlich zum Lesen zuschaut.Kombinieren Sie zunächst die entsprechende Menge an reduzierten Serummedien und Transfektionsreagenz in einem Rohr und reduzierte Serummedien und DNA in einem separaten Rohr. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten.Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten und sterile Kunststofftröge, um die kortikalen Neuronen zweimal mit 100 Mikrolitern neuronalen Basalmedien pro Brunnen zu waschen. Und die konditionierten Medien und andere verbleibende Medien bei 37 Grad Celsius aufbewahren. Ersetzen Sie die NBM durch 100 Mikroliter zuvor vorbereitete NBKY-Lösung pro Brunnen.Nach 20 Minuten fallen 50 Mikroliter des Transfektionsreagenzes und der DNA-Mischung in jeden Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Spülen Sie die Zellen zweimal mit NBKY-Lösung.Dann fügen Sie 100 Mikroliter konditionierte Medien und 100 Mikroliter NBC-Lösung in die Brunnen. Um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen.Navigieren Sie dann zu Interessenbereichen und zeichnen ihre x- und y-Koordinaten relativ zur Markierung auf. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen. Konzentrieren Sie sich schließlich auf die transfizierten Zellen, die ein fluoreszierendes Etikett ausdrücken.Nehmen Sie mehrere Bilder in regelmäßigen Abständen in den entsprechenden fluoreszierenden Kanälen auf. Um mit der Bildverarbeitung zu beginnen, doppelklicken Sie auf das Fidschi-Symbol. Klicken Sie dann auf das Bild unterund auf das Fidschi-Makro, um das Makro in Fidschi zu öffnen.Passen Sie die Zeilen zwei bis sieben des Bildunterstrichs des Verarbeitungsmakros entsprechend dem Textprotokoll an. Klicken Sie dann auf die Nähte und dann auf raster-/sammlungsnähte. Passen Sie die Einstellungen in den Dropdownmenüs, den Typ und die Reihenfolge an, bis ein genau genähtes Bild erstellt wird.Passen Sie Rastertyp- und Stichreihenfolgevariablen in den Zeilen acht und neun entsprechend dieser Auswahl an. Passen Sie dann Zeile 10 an, um die Anzahl der Bilder pro Bohrung anzugeben, und legen Sie die Option für die Hintergrundsubtraktion in Zeile 14 bei Bedarf auf true fest. Passen Sie Zeile 15 an, um den Rollenkugelradius entsprechend dem Textprotokoll festzulegen, und klicken Sie auf Ausführen.Öffnen Sie schließlich die Ausgabebildstapel und identifizieren Sie die toten Neuronen manuell gemäß dem Textprotokoll. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei auf. Um eine statistische Analyse durchzuführen, doppelklicken Sie auf das Symbol für das Überleben.R-Skript. Markieren Sie Zeile zwei, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Überlebensbibliothek zu laden. Ändern Sie dann den Pfad in Zeile 5, um die Eingabetabelle aufzurufen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen.Markieren Sie die Zeilen acht und neun, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Analyse der proportionalen Gefahren von Cox durchzuführen. Markieren Sie die Linien 12 bis 16 und 19 bis 24. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um das kumulative Sterberisiko und die Überlebensdaten als Kaplan-Meier-Kurve darzustellen.In dieser Studie wurden kortikale Neuronen von Ratten vier Tage nach der Beschichtung mit einem Plasmid transfiziert, das für das fluoreszierende Protein M-Apfel kodiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Neuronen alle 24 Stunden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Nach der Bildaufnahme wurden Die Bilder verarbeitet und sequenziell untersucht, um den Zelltod zu markieren.Die Todeszeit für jede Zelle wurde durch Veränderungen der Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung des Zellkörpers bestimmt. Die Analyse der Cox-Proportionalgefahren an den Überlebensdaten der mutierten Neuronen ergab ein Hazard Ratio von 2,2. Dieses Ergebnis deutete auf eine schnellere Sterblichkeitsrate in den mutierten Neuronen im Vergleich zur Wildtyppopulation hin.Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, sorgfältig zu pfeifen. Die Minimierung der Luftexposition und die Vermeidung von Blasen ist entscheidend für eine erfolgreiche Transfektion. Nach der Transfektion kann die Längsfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um verschiedene Faktoren zu verfolgen, die zum Zelltod beitragen können, einschließlich Proteinlokalisierung, Umsatz und Expressionsniveau, zusätzlich zum Zellüberleben.Im Bereich der Neurodegeneration hat die Dynamik der Längsmikroskopie Aufschluss darüber geben, ob die Aggregation von krankheitsassoziierten Proteinen ein toxisches oder schützendes Ereignis darstellt. Keines dieser Reagenzien oder Instrumente ist gefährlich.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

Hirntodinduktion bei Mäusen mit intraarterieller Blutdrucküberwachung und -beatmung mittels Tracheostomie

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