Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

אנו מודים סטיב Finkbeiner וחברי המעבדה Finkbeiner על חלוצית מיקרוסקופ רובוטית. אנו מודים גם דן Peisach לבניה הראשונית התוכנה הדרושות עבור עיבוד תמונה, אוטומטית ניתוח הישרדות. עבודה זו מומן על ידי המכון הלאומי עבור הפרעות נוירולוגיות R01 שבץ (NINDS)-NS097542, אוניברסיטת מישיגן חלבון מתקפלות המחלה יוזמה לבין אן ארבור פעיל נגד ALS.

כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ'יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלי?...

<ol>
	<li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+health+and+disease.">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li><li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+assays+for+drug+discovery.">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li><li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death:+a+common+mechanism+in+necrosis,+apoptosis+and+autophagy.">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible,+ischemic+liver+cell+injury.">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li><li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells.">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li><li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage.">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li><li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death.">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li><li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival.">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+survival+analysis+using+Cox&#8217;s+regression+model.">Multivariate survival analysis using Cox&#8217;s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization.">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606 (2018).</li><li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפ?...

מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו1. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני2. לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים3צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.
לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס11. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח12. יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).
אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים... מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.

DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצו...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הישרדות על בסיס תא יחיד ולזהות משתנים המנבאים באופן משמעותי מוות או הישרדות של תאים. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות מעריכות אוכלוסיות של תאים וחסרות יכולת להפלות תאים בודדים. מיקרוסקופ אורך מאפשר את המשימה של זמן המוות עבור כל תא באוכלוסייה.טכניקה זו מתאימה היטב להערכת טיפולים חדשים למחלות ניווניות ולתנאים אחרים. שיטה זו הוכיחה לא יסולא בפז לחקר מנגנוני המחלה בתנאים ניווניים, והוא יכול להיות מיושם ביעילות שווה כלפי הפרעות אחרות שבהן מוות תאי הוא עניין. חוקרים עשויים להיאבק בהשגת יעילות transfection נאותה ללא רעילות מופרזת.תרגול עם צינור רב ערוצי והיכרות עם הפרוטוקול צריך להפחית קושי אלה לאורך זמן. מיקרוסקופיה היא מתודולוגיה חזותית מטבעה. לכן, הטכניקה עשויה להיות מובנת בקלות רבה יותר על ידי צפייה בנוסף לקריאה.כדי להתחיל, לשלב את הכמות המתאימה של מדיה סרום מופחתת reagent transfection בצינור אחד, ו מדיה סרום מופחת DNA בצינור נפרד. דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לשלב את התוכן של שני צינורות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.השתמש צינור רב ערוצי שוקת פלסטיק מעקר לשטוף את הנוירונים קליפת המוח פעמיים עם 100 microliters של מדיה בזלית עצבית לכל באר. ולאחסן את המדיה המותנה ומדיות אחרות שנותרו ב37 מעלות צלזיוס. החלף את ה- NBM ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון NBKY שהוכן בעבר לבא.לאחר 20 דקות, pipet 50 microliters של reagent transfection ותערובת DNA dropwise לתוך כל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות פתרון NBKY.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיה מותנה ו-100 מיקרוליטרים של פתרון NBC ל בארות. כדי להתחיל להדמיין את התאים, מניחים את צלחת 96 באר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד.לאחר מכן, נווט לאזורי עניין והתאם את קואורדינטות ה- x וה- y שלהם ביחס לסימני הסימן. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד. לבסוף, התמקדו בתאים המהונפים המבטאים תווית פלואורסצנטית.לצלם תמונות מרובות במרווחים במרווחים קבועים בערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים. כדי להתחיל בעיבוד תמונה, לחץ פעמיים על סמל פיג'י. לאחר מכן, לחץ וגרור את מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה אל סרגל פיג'י כדי לפתוח את המאקרו בתוך פיג'י.התאם שורות 2 עד 7 של מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לחץ על תפירה ולאחר מכן רשת / אוסף תפירה. התאימו את הקצויים בתפריטים הנפתחים, הקלקו והסדר, עד להפקת תמונה תפורה במדויק.התאם משתני סוג רשת וסדר תפר בשורות שמונה ותשע בהתאם לבחירה זו. לאחר מכן, התאימו את קו 10 כדי לציין את מספר התמונות ל באר והגדירו את אפשרות חיסור הרקע בשורה 14 כ- true, במידת הצורך. התאם את קו 15 כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל בהתאם לפרוטוקול הטקסט ולחץ על הפעל.לבסוף, פתח את ערימות תמונת הפלט וזהה באופן ידני את הנוירונים המתים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. רשום את הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי, לחץ פעמיים על הסמל להישרדות.R תסריט. סמן את קו 2 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לטעון את ספריית ההישרדות. לאחר מכן, שנה את הנתיב בשורה חמש כדי לקרוא לגיליון האלקטרוני של הקלט ולחץ על לחצן ההפעלה.סמן את קווים 8 ו- 9 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לבצע את ניתוח הסיכונים היחסיים של Cox. סמן קווים 12 עד 16 ו- 19 עד 24. לחץ על לחצן הריצה כדי להתוות את הסיכון המצטבר למוות ואת נתוני ההישרדות כעיקול קפלן-מאייר.במחקר זה, נוירונים קליפת המוח חולדה הונפו בארבעה ימים לאחר ציפוי עם פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי M תפוח. 24 שעות לאחר transfection, נוירונים דימוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 24 שעות במשך 10 ימים רצופים. לאחר רכישת התמונה, תמונות עובדו ונבדקו ברצף כדי לסמן את מות התא.זמן המוות של כל תא נקבע על ידי שינויים ב פלואורסצנטיות, מורפולוגיה ופיצול של גוף התא. ניתוח סכנות פרופורציונלי קוקס שבוצע על נתוני ההישרדות של נוירונים מוטנטים הביא יחס סיכון של 2.2. תוצאה זו הצביעה על קצב מוות מהיר יותר בנוירונים המוטנטים בהשוואה לאוכלוסיית סוגי הבר.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא צינור בזהירות. מזעור החשיפה לאוויר והימנעות מבועות הוא קריטי לתפנית מוצלחת. לאחר ההשתנות, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אורך כדי לעקוב אחר גורמים שונים שעשויים לתרום למוות של תאים, כולל לוקליזציה של חלבונים, מחזור ורמת ביטוי, בנוסף להישרדות התאים.בתחום ניוון עצבי, האופי הדינמי של מיקרוסקופיה אורך שפך אור על האם הצבירה של חלבונים הקשורים למחלות מייצג אירוע רעיל או מגן. אף אחד מהריגנסים או המכשירים האלה לא מסוכן.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

מוות המוח אינדוקציה עכברים באמצעות לחץ דם פנים עורקים ניטור ואוורור באמצעות קנה מאוזן

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...