Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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Ringraziamo Steve Finkbeiner e membri del laboratorio Finkbeiner per pionieristico microscopia robotica. Ringraziamo anche Dan Peisach per costruzione il software iniziale necessaria per elaborazione di immagini e analisi di sopravvivenza automatizzata. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto nazionale per i disordini neurologici e colpo (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding malattia iniziativa e Ann Arbor attivo contro ALS.

Tutto il lavoro degli animali vertebrato è stato approvato dal Comitato per l'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan (protocollo n # PRO00007096). Gli esperimenti vengono pianificati attentamente per ridurre al minimo il numero di animali sacrificati. Incinta femmina wild-type (WT), non transgenica ratti lungo Evans (Rattus norvegicus) sono alloggiati singolarmente in camere dotate di arricchimento ambientale e curato dall'unità per laboratorio animale medicina (ULAM) presso l'Universit?...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. 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Qui, è presentata una metodologia per monitorare direttamente la sopravvivenza di un neurone su base cella singola. Contrariamente ai tradizionali saggi per la morte delle cellule che sono limitati a intervalli di tempo discreti e intere popolazioni delle cellule, questo metodo consente la valutazione continua di una varietà di fattori quali la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione, e possibile determinare come ciascun fattore influenza la sopravvivenza cellulare in modo prospettico.
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Morte delle cellule anormali è un fattore trainante in molte malattie, compreso cancro, neurodegenerazione e corsa1. Saggi di robuste e sensibile per la morte delle cellule sono essenziali per la caratterizzazione di questi disordini, come pure lo sviluppo di strategie terapeutiche per estendere o ridurre la sopravvivenza cellulare. Attualmente esistono decine di tecniche per la misurazione di morte delle cellule, direttamente o tramite surrogati marcatori2. Ad esempio, morte delle cellule può essere valutata visivamente con l'ausilio di coloranti vitali che macchia selettivamente cellule morte o vita3, o controllando l'aspetto dei fosfolipidi specifici sulla membrana plasmatica4,5,6 . Misure di componenti intracellulari o di metaboliti cellulari rilasciati in media dopo la dissoluzione cellulare utilizzabile anche come proxy per cellule morte7,8. In alternativa, la vitalità cellulare può essere approssimata valutando attività metabolica9,10. Anche se questi metodi forniscono mezzi rapidi di valutare la sopravvivenza delle cellule, non sono senza avvertimenti. Ogni tecnica osserva la cultura come un'unica popolazione, rendendo impossibile distinguere tra le singole celle e loro unici tassi di sopravvivenza. Inoltre, tali dosaggi basati sulla popolazione sono in grado di misurare i fattori che possono essere importanti per la morte delle cellule, compreso la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione. In molti casi, queste analisi sono limitate ai punti di tempo discreto e non consentono l'osservazione continua delle cellule nel corso del tempo.
Al contrario, microscopia a fluorescenza longitudinale è una metodologia altamente flessibile che direttamente e continuamente controlla il rischio di morte su una singola cellula base11. In breve, microscopia a fluorescenza longitudinale consente a migliaia di singole celle per essere monitorati ad intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, consentendo precise determinazioni di morte delle cellule e dei fattori che migliorano o sopprimono la morte delle cellule. Alla sua base, il metodo prevede la trasfezione transiente o trasduzione delle cellule con vettori codificanti proteine fluorescenti. Un unico fiduciario viene quindi stabilito, e la posizione di ogni cellule transfettate in relazione a questa pietra miliare consente all'utente di immagine e tenere traccia di singole cellule nel corso di ore, giorni o settimane. Quando queste immagini vengono visualizzate in sequenza, la morte delle cellule è contrassegnata da cambiamenti caratteristici in fluorescenza, la morfologia e la frammentazione del corpo cellulare, consentendo l'assegnazione di un tempo di morte per ogni cella. Il tasso di morte, determinata dalla funzione di rischio, calcolato può quindi essere quantitativamente rispetto tra le condizioni, o correlato per selezionare caratteristiche cellulari utilizzando monovariante o analisi multivariata rischi proporzionali di Cox12. Insieme, questi approcci consentono la discriminazione accurata e obiettiva dei tassi di morte delle cellule fra popolazioni cellulari e l'identificazione delle variabili che significativamente predicono la morte delle cellule e/o sopravvivenza (Figura 1).
Anche se questo metodo può essere utilizzato per monitorare la sopravvivenza in qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche in una varietà di formati di placcatura, questo protocollo descriverà le condizioni per trasfezione e imaging neuroni corticali del ratto coltivati in una piastra a 96 pozzetti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Saggi di citotossicità standard, che richiedono la raccolta di lisati o celle fisse a più punti di tempo, hanno limitato la sensibilità e la capacità di valutare i fattori che influenzano il destino di un neurone. Queste analisi richiedono l'osservazione di popolazioni separate delle cellule a intervalli di tempo discreti. Di conseguenza, le singole celle non possono essere seguite prospetticamente nel tempo, limitando gravemente la capacità di discriminare se subcellulari eventi, ad esempio puncta formazione o mislocalization di proteine, sono driver patogeni della malattia, le risposte omeostatiche, o fenomeni puramente coincidenti. Cella singola longitudinale microscopia supera queste limitazioni, che permette al ricercatore di determinare le differenze nella sopravvivenza tra popolazioni e disegnare relazioni causali con maggiore sensibilità. Questa video guida illustrerà un flusso di lavoro rappresentativo per gli esperimenti di sopravvivenza unicellulari di primaria neuroni corticali del ratto, che esprime un proteina fluorescente indicatore di misura. Lo spettatore sarà imparare a raggiungere ad alta efficienza transfezioni, raccogliere ed elaborare immagini consentendo il monitoraggio prospettico delle singole celle e confrontare la relativa sopravvivenza di popolazioni neuronali utilizzando analisi rischi proporzionali di Cox.

Utilizzando la procedura di trasfezione descritta qui, neuroni corticali del ratto di DIV4 transfected con un plasmide che codifica la proteina fluorescente mApple. A partire dal post-transfezione 24h, cellule erano imaged da microscopia di fluorescenza ogni 24 h per 10 giorni consecutivi. Le immagini risultanti sono state organizzate come indicato in Figura 2, poi cucite, impilate e ha segnate per la morte delle cellule (Figura 1</strong...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.

Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di monitorare la sopravvivenza su una singola cellula e identificare variabili che predicono significativamente la morte o la sopravvivenza cellulare. I test di citotossicità convenzionali valutano le popolazioni di cellule e mancano della capacità di discriminare le singole cellule. La microscopia longitudinale consente l'assegnazione del tempo di morte per ogni cellula in una popolazione.Questa tecnica è adatta per valutare nuove terapie per malattie neurodegenerative e altre condizioni. Questo metodo si è dimostrato prezioso per esplorare i meccanismi della malattia in condizioni neurodegenerative e potrebbe essere applicato con uguale efficacia verso altri disturbi in cui la morte cellulare è di interesse. I ricercatori possono avere difficoltà a raggiungere adeguate efficienze di trasfezione senza tossicità indebita.La pratica con la pipetta multicanale e la familiarità con il protocollo dovrebbero diminuire queste difficoltà nel tempo. La microscopia è una metodologia intrinsecamente visiva. Pertanto, la tecnica può essere più facilmente compresa guardando oltre alla lettura.Per iniziare, combinare la quantità appropriata di mezzi siere ridotti e reagente di trasfezione in un unico tubo e ridurre i mezzi siere e il DNA in un tubo separato. Incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.Utilizzare una pipetta multicanale e trogoli di plastica steril per lavare i neuroni corticali due volte con 100 microlitri di mezzi basali neurali per pozzo. E conservare i supporti condizionati e altri supporti rimanenti a 37 gradi Celsius. Sostituire l'NBM con 100 microlitri di soluzione NBKY precedentemente preparata per pozzo.Dopo 20 minuti, pipettare 50 microlitri del reagente di trasfezione e miscela di DNA dropwise in ogni pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Risciacquare le cellule due volte con la soluzione NBKY.Quindi aggiungere 100 microlitri di supporti condizionati e 100 microlitri di soluzione NBC ai pozzi. Per iniziare a immaginare le cellule, posizionare la piastra del pozzo 96 su un microscopio fluorescente. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro.Quindi, passare alle aree di interesse e registrare le coordinate x e y relative al segno. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro. Infine, concentrati sulle cellule trasfette che esprimono un'etichetta fluorescente.Scatta più immagini a intervalli regolarmente distanziati nei canali fluorescenti appropriati. Per iniziare con l'elaborazione delle immagini, fai doppio clic sull'icona delle Fiji. Quindi, fare clic e trascinare la macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine sulla barra delle Fiji per aprire la macro all'interno delle Figi.Regolare le righe da due a sette della macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine in base al protocollo di testo. Quindi, fare clic su cuciture, quindi griglia / cuciture di raccolta. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa, digitare e ordinare, fino a produrre un'immagine cucita con precisione.Regolare il tipo di griglia e le variabili dell'ordine di punto nelle righe otto e nove in base a queste selezioni. Quindi, regola la riga 10 per specificare il numero di immagini per pozzo e imposta l'opzione di sottrazione di sfondo nella riga 14 su true, se necessario. Regolare la riga 15 per impostare il raggio della palla rotolante in base al protocollo di testo e fare clic su Esegui.Infine, aprire gli stack di immagini di output e identificare manualmente i neuroni morti in base al protocollo di testo. Registrare i dati in un file di foglio di calcolo. Per eseguire analisi statistiche, fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza.R script. Evidenziare la linea due e fare clic sul pulsante esegui per caricare la libreria di sopravvivenza. Quindi, modificare il percorso nella riga cinque per chiamare il foglio di calcolo di input e fare clic sul pulsante esegui.Evidenziare le linee otto e nove e fare clic sul pulsante esegui per eseguire l'analisi dei pericoli proporzionali Cox. Evidenziare le linee da 12 a 16 e da 19 a 24. Fare clic sul pulsante esegui per tracciare il rischio cumulativo di morte e i dati di sopravvivenza come curva kaplan-meier.In questo studio, i neuroni corticali del ratto sono stati trasfettato a quattro giorni dopo la placcatura con un plasmide che codifica per la proteina fluorescente M mela. 24 ore dopo la trasfezione, i neuroni sono stati imageati dalla microscopia a fluorescenza ogni 24 ore per 10 giorni consecutivi. A seguito dell'acquisizione dell'immagine, le immagini sono state elaborate e sono state esaminate in sequenza per celebrare la morte cellulare.Il tempo di morte per ogni cellula era determinato da cambiamenti nella fluorescenza, morfologia e frammentazione del corpo cellulare. L'analisi dei pericoli proporzionali cox eseguita sui dati di sopravvivenza dei neuroni mutanti ha portato ad un rapporto di pericolo di 2,2. Questo risultato ha indicato un tasso di morte più veloce nei neuroni mutanti rispetto alla popolazione di tipo selvaggio.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è quella di pipet con attenzione. Ridurre al minimo l'esposizione all'aria ed evitare le bolle è fondamentale per una trasfezione di successo. Dopo la trasfezione, la microscopia a fluorescenza longitudinale può essere utilizzata per tenere traccia di vari fattori che possono contribuire alla morte cellulare, tra cui localizzazione proteica, turnover e livello di espressione, oltre alla sopravvivenza cellulare.Nel campo della neurodegenerazione, la natura dinamica della microscopia longitudinale ha fatto luce sul fatto che l'aggregazione di proteine associate alla malattia rappresenti un evento tossico o protettivo. Nessuno di questi reagenti o strumenti è pericoloso.

Research

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