Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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スティーブ Finkbeiner とロボットの顕微鏡を先駆 Finkbeiner 研究室のメンバーに感謝します我々 はまた、初期のソフトウェア画像処理に必要なし、生存時間解析を自動化された建物のダン Peisach を感謝します。この作品は、神経疾患と脳卒中 (NINDS) R01 NS097542、ミシガン大学タンパク質フォールディング病イニシアティブ、アナーバー アクティブに対して ALS の国立研究所によって賄われていた。

すべての脊椎動物の仕事は、使用し、ミシガン大学 (プロトコル # PRO00007096) ケアの動物の委員会によって承認されました。実験は慎重に犠牲になる動物の数を最小限に抑える予定です。妊娠女性野生型 (WT)、非組み換えの長いエバンス ラット (ドブネズミ) は、チャンバー環境エンリッチメントを装備しユニット、ミシガン大学の実験動物医学 (ウラム) の世話に単独で収容されてNIH サ?...

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

ここでは、単一セルごとに神経細胞の生存を直接観察する方法が表示されます。離散時間とセルの全体の人口に制限されている細胞死の伝統的なアッセイと対照をなしてこの手法によりさまざまな細胞形態、蛋白質の表現、またはローカリゼーションなどの要因の継続的な評価とそれぞれの因子が将来的に細胞の生存をどのように影響するかを判断できます。
この方法?...

異常な細胞死は、多くの病気、がん、神経変性、ストローク1などの要因です。細胞死の堅牢かつ敏感な試金は、治療戦略の開発と同様に、これらの疾患の特性に拡張または縮小細胞の生存に不可欠です。現在、直接またはサロゲート マーカー2を介して細胞死の測定方法の数十があります。たとえば、細胞死を選択的に染色死んでいるか生きている細胞3、重要な染料または特定リン脂質膜4,報5,6 の出現を監視することによって助けを借りて、視覚的に評価できます。.細胞内コンポーネントまたは細胞内代謝細胞溶解時にメディアに放出の測定は、細胞死7,8のプロキシとして使用できます。また、細胞は代謝活性9,10を評価することにより近似できます。これらのメソッドは、細胞生存率を評価するための迅速な手段を提供する、けれども注意事項なしではないです。それぞれの手法は、単一の人口、それは個々 の細胞の生存率は、そのユニークなとを区別することは不可能レンダリングとして文化を観察します。また、そのような人口に基づく試金は細胞死、細胞形態、蛋白質の表現、ローカライズなどの重要となる要因を測定することではありません。多くの場合、これらの試金は離散時間ポイントに限定され、時間の経過とともに細胞の連続観測を可能にしません。
対照的に、縦の蛍光顕微鏡は直接かつ継続的に単一セル単位11死のリスクを監視する柔軟性の高い手法です。簡単に言えば、縦蛍光顕微鏡により細胞死とその強化したり、細胞死を抑制する要因の正確な決定を可能にする時間の長期間にわたって定期的に追跡する個々 の細胞の何千も、できます。メソッドは、そのベースで蛍光蛋白質を符号化するベクトルで、トランスフェクションした細胞の情報伝達を伴います。ユニークな受託者を設立し、このランドマークに関連して各 transfected セルの位置はイメージを作成し、時間、日数、または週のコース上の個々 のセルを追跡できます。これらの画像を順番に表示、蛍光、形態、および各セルの死の時間の割り当てを有効にする、細胞体の断片化の特性変化による細胞死がマークされます。死、ハザード関数によって決定の計算されたレート、定量的条件、比較したり関連の一変量あるいは多変量 Cox 比例ハザード解析12を使用して携帯電話の特性を選択できます。一緒に、これらのアプローチは、細胞集団の細胞死亡率と細胞死および/または生存 (図 1) を大幅予測変数の識別の正確かつ客観的差別を有効にします。
このメソッドを使用して、多彩なフォーマットをめっき後有糸分裂細胞の種類で生存を監視できますが、このプロトコルは株とイメージングの 96 ウェル プレートで培養ラット大脳皮質ニューロンのための条件を説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Lysates または時間の複数のポイントで固定セルのコレクションを必要とする標準的な細胞毒性の試金は、感度と神経細胞の運命に影響を与える要因を評価する能力に限られています。これらのアッセイは、離散時間で細胞の個別集団の観察を必要とします。その結果、個々 の細胞は涙点形成やタンパク質サッカード定位誤りなど、細胞内のイベントが恒常性維持反応病の病原性ドライバーかどうかを判別する能力を厳しく制限すること、時間をかけて前向き後ことはできません。または単なる偶然の一致現象。単一セルの縦の顕微鏡は、個体群間の生存率の差を判断して強化された感度との因果関係を描く研究をできるように、これらの制限を克服します。このビデオ ガイドは蛍光タンパク質マーカーを表現するラット一次皮質ニューロンの単一細胞生存率を測定する実験のための代表的なワークフローの概要を説明します。ビューアーは高効率 transfections を達成するため、収集し、個々 のセルの将来の追跡を有効にする画像を処理する方法について説明し、Cox 比例ハザード解析を用いた神経細胞群の相対生存率を比較します。

ここでトランスフェクションの手順を使用して、DIV4 ラット大脳皮質ニューロンが蛍光タンパク質マップルをエンコーディング プラスミドを導入させた。24 h 後トランスフェクションを初め、細胞を蛍光顕微鏡によるすべての 24 h 連続 10 日間をイメージしました。画像いた編成図 2で示されているように、ステッチ、積み上げ、細胞死 (<strong clas...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

ここでは、単一セルごとに生存率を監視し、細胞死を有意に予測変数を識別するプロトコルを提案します。

縦の蛍光顕微鏡による神経細胞の生存を監視

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

このプロトコルにより、研究者は単一細胞ベースで生存を監視し、細胞死または生存を有意に予測する変数を同定することができます。従来の細胞傷害性アッセイは、細胞の集団を評価し、個々の細胞を識別する能力を欠いている。縦方向顕微鏡検査では、集団の各細胞に対して死亡時間を割り当てることができる。この技術は、神経変性疾患および他の条件に対する新しい治療法の評価に適しています。この方法は、神経変性疾患の疾患メカニズムを探求するのに非常に貴重であることが証明されており、細胞死が関心のある他の障害に対して同等の有効性を持って適用することができる。研究者は、過度の毒性なしに適切なトランスフェクション効率を達成することに苦労する可能性があります。マルチチャンネルのパイプを使った練習とプロトコルの使い方は、時間の経過とともにこれらの難易度を減少させるはずです。顕微鏡は本質的に視覚的な方法論です。したがって、この技術は、読み取りに加えて見ることによってより容易に理解され得る。まず、適切な量の減らされた血清培地とトランスフェクション試薬を1つのチューブに組み合わせ、別のチューブに減らされた血清培地とDNAを組み合わせます。室温で5分間インキュベートします。次いで、両チューブの内容物を組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。マルチチャンネルピペットと滅菌プラスチックトラフを使用して、井戸あたり100マイクロリットルの神経基底メディアで皮質ニューロンを2回洗浄します。そして、条件付きのメディアや他の残りのメディアを摂氏37度で保管してください。NBMを、以前に調製したNBKY溶液を井戸ごとに100マイクロリットルに交換してください。20分後、トランスフェクション試薬とDNA混合物の50マイクロリットルを各ウェルに滴下する。20分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。NBKY溶液で細胞を2回リンスします。その後、100マイクロリットルのコンディションされたメディアと100マイクロリットルのNBC溶液を井戸に加えます。細胞のイメージングを開始するには、96ウェルプレートを蛍光顕微鏡の上に置きます。将来の位置合わせの基準として、各プレートに固有の受託者マークを使用し、将来の参照のために画像を保存します。次に、対象の領域に移動し、マークに対する相対位置の x 座標と y 座標を記録します。将来の位置合わせの基準として、各プレートに固有の受託者マークを使用し、将来の参照のために画像を保存します。最後に、蛍光標識を発現するトランスフェクト細胞に注目する。適切な蛍光チャネルで、定期的に間隔を空けた間隔で複数の画像を撮影します。画像処理を開始するには、フィジーのアイコンをダブルクリックします。次に、画像アンダースコア処理マクロをフィジーバーにドラッグして、フィジー内でマクロを開きます。テキストプロトコルに従って、画像アンダースコア処理マクロの2行から7行目を調整します。次に、ステッチをクリックし、グリッド/コレクションステッチをクリックします。正確にステッチされた画像が生成されるまで、ドロップダウンメニュー内の設定、タイプ、順序を調整します。これらの選択に従って、8 行目と 9 行目のグリッドタイプとステッチ順序の変数を調整します。次に、10 行目を調整してウェルあたりの画像数を指定し、必要に応じて 14 行目の背景減算オプションを true に設定します。テキストプロトコルに従ってローリングボールの半径を設定するには、15行目を調整し、[実行]をクリックします。最後に、出力イメージ スタックを開き、テキスト プロトコルに従って死んだニューロンを手動で識別します。スプレッドシート ファイルにデータを記録します。統計解析を実行するには、生存のアイコンをダブルクリックします。R スクリプト。2 行目をハイライト表示し、実行ボタンをクリックしてサバイバルライブラリをロードします。次に、5 行目のパスを変更して入力スプレッドシートを呼び出し、[実行] ボタンをクリックします。8 行目と 9 行目をハイライト表示し、実行ボタンをクリックして Cox 比例ハザード分析を実行します。12 から 16、19 から 24 をハイライトします。実行ボタンをクリックして、死亡の累積リスクと生存データをカプラン・マイヤー曲線としてプロットします。本研究では、ラット皮質ニューロンを、蛍光タンパク質Mリンゴをコードするプラスミドをめっき後4日間でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間、ニューロンを10日間連続して24時間毎に蛍光顕微鏡で画像化した。画像取得後、画像を処理し、細胞死を示すために順次検査した。各細胞の死亡時間は、蛍光、形態、および細胞体の断片化の変化によって決定された。突然変異ニューロンの生存データに対して行われたCox比例ハザード分析は、ハザード比2.2をもたらした。この結果は、野生型集団と比較して変異ニューロンにおける死亡率が速い。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、慎重にパイプ処理することです。空気暴露を最小限に抑え、気泡を避けることは、トランスフェクションを成功させるために重要です。トランスフェクション後、縦方向蛍光顕微鏡法を使用して、細胞の生存に加えて、タンパク質の局在化、ターンオーバー、発現量など、細胞死に寄与する可能性のあるさまざまな因子を追跡することができます。神経変性の分野では、縦手方向顕微鏡の動的性質は、疾患関連タンパク質の凝集が有毒または保護事象を表すかどうかについて光を当てています。これらの試薬や器具はどれも危険ではありません。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

オルガ鼻記小脳スライス培養におけるプルキンジェ細胞生存

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

動脈内血圧モニタリングと気管切開による換気を用いたマウスの脳死誘導

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...