Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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우리 스티브 Finkbeiner 및 로봇 현미경 선구적인 Finkbeiner 연구소의 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 초기 소프트웨어 이미지 처리에 필요한 및 생존 분석 자동화를 구축 하기 위한 댄 Peisach 감사 합니다. 이 작품은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS) R01-NS097542, 미시간 대학 단백질 폴딩 질병 이니셔티브, 및 앤아버 활성에 대 한 ALS를 위한 국립 연구소에 의해 투자 되었다.

모든 척추 동물 작업 사용 및 미시간 대학 (프로토콜 # PRO00007096)에서 관리 동물에 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 동물 희생의 수를 최소화 하기 위해 신중 하 게 계획 된다. 임신 여성 야생-타입 (WT), 유전자 변형 비 긴 에반스 쥐 (Rattus norvegicus)는 실 환경 풍부 및에 단위에 대 한 실험 동물 의학 (ULAM) 미시간 대학에 의해를 걱정에서 홀로 지 내게 따라 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 게 N...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. 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여기, 직접 단일 셀 기준 신경 생존을 모니터링 하는 방법론을 제시 합니다. 이 방법은 다양 한 세포 형태학, 단백질 표정, 지역화 등 요인의 지속적인 평가 대 한 수 있는 전통적인 분석 실험 세포 죽음에 대 한 개별 시간 포인트 및 셀의 전체 인구는, 달리 고 어떻게 각 요소 잠재 방식으로 세포 생존에 영향을 확인할 수 있습니다.
이 방법론은 다양 한 실험적인 요구에 맞게 수...

비정상적인 세포 죽음은 암, 뇌졸중1, neurodegeneration, 등 많은 질병에 영향을 미치는. 세포 죽음에 대 한 강력 하 고 중요 한 분석 확장 하거나 세포 생존을 감소 시키기 위한 치료 전략의 개발으로 서 이러한 장애의 특성에 필수적입니다. 현재 직접 또는 대리 마커2세포 죽음을 측정 하기 위한 기법의 수십 있습니다. 예를 들어 세포 죽음 평가 될 수 있다 시각적으로 또는 특정 인지질 원형질 막4,5,6의 모습을 모니터링 하 여 중요 한 염료를 선택적으로 죽 었 거 나 살아있는 세포3, 얼룩의 도움으로 . 측정 세포내 구성 요소 또는 셀룰러 산시 미디어로 출시 세포 대사 산물의 세포 죽음7,8에 대 한 프록시 사용할 수 있습니다. 또는, 세포 생존 수 수 직선 근사 줄 대사 활동9,10를 평가 하 여. 비록 이러한 방법을 세포 생존 평가의 빠른 수단을 제공, 그들은 경고 없이 되지 않습니다. 각 기술은 단일 인구, 개별 셀 및 생존의 그들의 독특한 속도 사이의 구별을 불가능 렌더링으로 문화를 관찰 합니다. 또한, 이러한 인구 기반 분석 실험 세포 형태학, 단백질 표정, 또는 지역화를 포함 하 여 세포의 죽음에 대 한 중요 한 될 수 있는 요소를 측정할 수 없습니다. 대부분의 경우에서 이러한 분석 개별 시간 포인트 제한 되며 시간이 지남에 셀의 연속 관측에 대 한 허용 하지 않습니다.
대조적으로, 경도 형광 현미경 검사 법은 직접 그리고 지속적으로 단일 셀 기준11에 죽음의 위험을 모니터링 하는 매우 유연한 방법입니다. 간단히, 경도 형광 현미경 세포 죽음 및 강화 하거나 세포 죽음 억제 하는 요인의 정확한 결심을 허용 하는 시간의 연장된 기간에 대 한 정기적 추적을 개별 셀의 수천 수 있습니다. 그것의 기초에는 방법은 형광 단백질을 인코딩 벡터와 과도 transfection 또는 셀의 변환 포함 한다. 고유한 신탁 설립 다음 하며이 랜드마크에 관하여 각 transfected 세포의 위치 이미지를 시간, 일, 또는 주에 걸쳐 개별 셀을 추적 하는 사용자 보면 이러한 이미지는 순차적으로, 형광, 형태학, 및 각 셀에 대 한 죽음의 시간 할당을 사용 하면 세포 체의 분열에서 세포 죽음 특성 변화에 의해 표시 됩니다. 죽음, 위험 함수에 의해 결정의 계산된 속도 수 있습니다 다음 양적 조건 사이의 비교 또는 일변량 또는 복수 콕스 비례 위험 분석12를 사용 하 여 셀룰러 특징 선택 관련. 함께, 이러한 접근 세포 인구 가운데 세포 죽음의 비율 그리고 크게 세포 죽음 및 생존 (그림 1)를 예측 하는 변수 식별의 정확 하 고 객관적인 차별 가능
이 메서드는 형식 도금의 다양 한 모든 포스트 mitotic 세포 종류에 생존을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만이 프로토콜 transfecting 및 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 96 잘 접시에 배양 이미징에 대 한 조건을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

표준 세포 독성 분석 실험, 여러 시간 점에서 고정된 세포 lysates의 필요, 감도 및 신경 운명에 영향을 주는 요소를 평가 하는 능력을 제한 했다. 이 분석 실험 개별 시간 포인트에서 세포의 별도 인구의 관찰을 해야합니다. 그 결과, 개별 셀 지켜질 수 없다 prospectively subcellular 이벤트, puncta 형성 등 단백질 mislocalization, 질병, 병원 성 드라이버 homeostatic 응답 인지를 구별할 수 있는 능력을 가혹 하 게 제한 하는 시간이 지남에 또는 단순히 우연 현상입니다. 단일 셀 경도 현미경 연구원 인구 사이 생존에 차이 확인 하 여 향상 된 감도와 인과 관계를 그릴 수 있도록 이러한 한계를 극복 한다. 이 비디오 가이드는 형광 단백질 마커를 표현 하는 쥐 주 대뇌 피 질의 뉴런의 단일 세포 생존을 측정 하는 실험에 대 한 대표적인 워크플로 개요 것입니다. 뷰어는 transfections 높은 효율을 달성, 수집 및 개별 셀의 예비 추적을 사용 하면 이미지를 처리 하는 방법을 배울 것 이다 고 신경 인구 콕스 비례 위험 분석을 사용 하 여의 상대 생존 됩니다.

여기 설명 된 transfection 절차를 사용 하 여, DIV4 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 했다 몇 군데 형광 현미경 검사 법 모든 24 h에 의해 10 일 연속. 결과 이미지 다음 그림 2에 표시 된 대로 구성 했다 물 렸 다, 스택, 및 세포 죽음 (그림 1)에 대 한 득점. <strong class=...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

여기, 선물이 단일 셀 기준 생존을 모니터링 하 고 크게 세포 죽음을 예측 하는 변수를 식별 하는 프로토콜.

경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

이 프로토콜은 연구원이 1 세포 기초에 생존을 감시하고 세포 죽음 또는 생존을 현저하게 예측하는 변수를 확인하는 것을 가능하게 합니다. 기존의 세포 독성 연구는 세포의 인구를 평가하고 개별 세포를 구별 할 수있는 능력이 부족합니다. 세로 현미경 검사는 인구에 있는 각 세포에 대한 죽음의 시간의 할당을 허용합니다.이 기술은 신경 퇴행성 질환 및 기타 조건에 대한 새로운 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 조건에서 질병 메커니즘을 탐구하는 데 매우 귀중한 것으로 입증되었으며 세포 사망이 관심있는 다른 장애로 동일한 효능을 적용 할 수 있습니다. 연구원은 과도한 독성없이 적절한 형질 전환 효율성을 달성하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.멀티채널 파이프와 프로토콜에 대한 친숙함으로 연습하면 시간이 지남에 따라 이러한 어려움이 줄어듭니다. 현미경 검사는 본질적으로 시각적 방법론입니다. 따라서, 이 기술은 독서 이외에 시청함으로써 보다 쉽게 이해될 수 있다.시작하려면, 한 튜브에 감소 된 혈청 매체 및 경질 시약의 적절한 양을 결합하고, 별도의 튜브에 혈청 매체와 DNA를 감소. 실온에서 5분간 배양하세요. 그런 다음, 두 튜브의 내용을 결합하고 20 분 동안 실온에서 배양.멀티채널 파이프와 멸균 플라스틱 쓰루를 사용하여 웰당 100마이크로리터의 신경기질 매체로 피질 뉴런을 두 번 세척합니다. 그리고 조건부 미디어 및 기타 나머지 미디어를 섭씨 37도에 저장합니다. NBM을 이전에 준비된 NBKY 솔루션 의 100 마이크로리터로 잘 교체하십시오.20 분 후, 파이프 50 마이크로 리터의 트랜스페션 시약 및 DNA 혼합물은 각 우물로 떨어집니다. 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. NBKY 용액으로 세포를 두 번 헹구는 다.그런 다음 100 마이크로리터의 조건부 미디어와 100개의 NBC 솔루션 마이크로리터를 우물에 추가합니다. 세포를 화상 진찰을 시작하려면 형광 현미경에 96 개의 우물 판을 놓습니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다.그런 다음 관심 영역으로 이동하여 마크에 비해 x 및 y 좌표를 기록합니다. 각 플레이트고유의 신탁 마크를 향후 정렬에 대한 참조로 사용하고 향후 참조를 위한 이미지를 저장합니다. 마지막으로, 형광 라벨을 표현하는 전감염된 세포에 초점을 맞춥니다.적절한 형광 채널에서 정기적으로 간격이 있는 간격으로 여러 이미지를 가져 가라. 이미지 처리로 시작하려면 피지 아이콘을 두 번 클릭합니다. 그런 다음 이미지를 클릭하고 피지 바에 처리 매크로를 드래그하여 피지 내에서 매크로를 엽니다.텍스트 프로토콜에 따라 이미지의 2~7개의 선을 조정하여 매크로 처리를 강조합니다. 그런 다음 스티치를 클릭한 다음 그리드/컬렉션 스티치를 클릭합니다. 정확하게 스티치된 이미지가 생성될 때까지 드롭다운 메뉴, 유형 및 순서 내에서 설정을 조정합니다.이러한 선택에 따라 그리드 유형 및 스티치 순서 변수를 8선과 9번 라인에서 조정합니다. 그런 다음 라인(10)을 조정하여 웰당 이미지 수를 지정하고 필요한 경우 14줄의 배경 빼기 옵션을 true로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 롤링 볼 반경을 설정하려면 선 15를 조정하고 실행을 클릭합니다.마지막으로, 출력 이미지 스택을 열고 텍스트 프로토콜에 따라 죽은 뉴런을 수동으로 식별합니다. 스프레드시트 파일에 데이터를 기록합니다. 통계 분석을 수행하려면 생존아이콘을 두 번 클릭합니다.R 스크립트. 두 줄을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 생존 라이브러리를 로드합니다. 그런 다음 5줄의 경로를 변경하여 입력 스프레드시트를 호출하고 실행 단추를 클릭합니다.8줄과 9선을 강조 표시하고 실행 버튼을 클릭하여 Cox 비례 위험 분석을 수행합니다. 12~16번 선과 19~24번선을 강조 표시합니다. 실행 버튼을 클릭하여 누적 사망 위험과 생존 데이터를 카플란 마이어 곡선으로 플롯합니다.이 연구에서는, 쥐 피질 뉴런은 형광 단백질 M 사과를 인코딩하는 도금으로 4 일 후에 도금에 감염되었다. 24 시간 후 형질 전환 후, 뉴런은 10 일 연속 24 시간마다 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 이미지 수집 후, 이미지가 처리되고 세포 사망을 표시하기 위해 순차적으로 검사되었다.각 세포에 대한 죽음의 시간은 세포 체의 형광, 형태 및 단편화의 변화에 의해 결정되었다. 돌연변이 뉴런의 생존 데이터에 대해 수행된 Cox 비례 위험 분석은 2.2의 위험 비율을 초래하였다. 이 결과는 야생 모형 인구에 비해 돌연변이 뉴런에 있는 죽음의 더 빠른 비율을 표시했습니다.이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 신중하게 파이프하는 것입니다. 공기 노출을 최소화하고 거품을 피하는 것은 성공적인 트랜스페트에 매우 중요합니다. 경외형 의 다음, 종방향 형광 현미경 검사는 세포 생존 외에도 단백질 국소화, 회전율 및 발현 수준을 포함하여 세포 사멸에 기여할 수 있는 다양한 요인을 추적하는 데 사용될 수 있다.신경 변성의 분야 내에서, 경도 현미경 검사법의 동적 본질은 질병 관련 단백질의 집합이 독성 또는 보호 사건을 나타내는지에 빛을 비추고 있습니다. 이러한 시약이나 계측기는 위험하지 않습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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연구

신경과학

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Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

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신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

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The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

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