Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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Agradecemos a Steve Finkbeiner e membros do laboratório Finkbeiner pelo pioneirismo microscopia robótica. Agradecemos também o Dan Peisach para a construção inicial do software necessário para o processamento de imagem e sobrevivência análise automatizada. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) R01-NS097542, Universidade de Michigan dobradura de proteína doença iniciativa e Ann Arbor ativo contra ALS.

Animal vertebrado todo o trabalho foi aprovado pelo Comité sobre o uso e cuidado dos animais, da Universidade de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos são cuidadosamente planejados para minimizar o número de animais sacrificados. Grávida fêmea tipo selvagem (WT), ratos de longa Evans não-transgênicos (Rattus norvegicus) são alojados individualmente em câmaras equipadas com enriquecimento ambiental e cuidadas pela unidade de medicina Animal de laboratório (ULAM) da Universidade de Michigan, e...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. 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Aqui, é apresentada a metodologia para monitorar diretamente a sobrevivência neuronal em uma base de célula única. Em contraste com os tradicionais ensaios para a morte celular que são limitados a pontos de tempo discreto e populações inteiras de células, este método permite a avaliação contínua de uma variedade de fatores tais como a morfologia celular, expressão da proteína ou localização, e pode determinar como cada fator influencia a sobrevivência celular de forma prospectiva.
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Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame1. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto2. Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas3, ou monitorando o aparecimento de específicos fosfolipídios da membrana plasmática,4,5,6 . Medições de componentes intracelulares ou metabolitos celulares lançados na mídia sob dissolução celular também podem ser usadas como proxies para célula morte7,8. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser aproximada por avaliar a atividade metabólica9,10. Embora esses métodos fornecem meios rápidos de avaliação de sobrevivência celular, eles não são sem ressalvas. Cada técnica observa a cultura como uma única população, tornando-se impossível distinguir entre células individuais e as suas taxas únicas de sobrevivência. Além disso, tais ensaios baseados em população são incapazes de medir fatores que podem ser importantes para a morte celular, incluindo a morfologia celular, expressão da proteína ou localização. Em muitos casos, estes ensaios são limitados a pontos de tempo discreto, em não permitem a observação contínua de células ao longo do tempo.
Em contraste, a microscopia de fluorescência longitudinal é uma metodologia altamente flexível que diretamente e continuamente monitora o risco de morte em uma única célula base11. Em breve, a microscopia de fluorescência longitudinal permite que milhares de células individuais a serem controladas em intervalos regulares durante longos períodos de tempo, permitindo que as determinações precisas de morte celular e os fatores que melhorar ou suprimem a morte celular. Em sua base, o método envolve a transfecção transiente ou transdução de células com vetores codificação de proteínas fluorescentes. Um fiduciário exclusivo é então estabelecido, e a posição de cada célula transfectada em relação a este marco permite que o usuário para a imagem e a faixa de células individuais ao longo de horas, dias ou semanas. Quando essas imagens são exibidas em sequência, morte celular é marcado por mudanças características em fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular, permitindo a atribuição de um tempo de morte para cada célula. A taxa calculada de morte, determinado pela função do perigo, pode então ser quantitativamente comparada entre condições ou relacionada para selecionar características celulares usando univariada ou de análise de riscos proporcionais de Cox multivariada12. Juntos, essas abordagens permitem a discriminação precisa e objectiva das taxas de morte celular em populações celulares e a identificação das variáveis que predizem significativamente a morte celular e/ou sobrevivência (Figura 1).
Embora esse método pode ser usado para monitorar a sobrevivência em qualquer tipo de célula pós mitóticas em uma variedade de formatos de chapeamento, este protocolo irá descrever condições para transfecting e imaging neurônios corticais de rato cultivados em uma placa de 96 poços.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Ensaios de citotoxicidade padrão, que exigem a coleção de lisados ou células fixas em vários pontos de tempo, limitaram a sensibilidade e a capacidade para avaliar os fatores que influenciam o destino neuronal. Estes ensaios exigem a observação de populações isoladas de células em pontos de tempo discreto. Como resultado, as células individuais não podem ser seguidas prospectivamente ao longo do tempo, limitando severamente a capacidade de discriminar se subcellular eventos, tais como formação de partitura ou mislocalization de proteína, são drivers patogênicos da doença, respostas homeostáticas, ou mera coincidência fenômenos. Microscopia de célula única longitudinal supera estas limitações, permitindo que o pesquisador determinar diferenças na sobrevivência entre populações e desenhar relações causais com sensibilidade melhorada. Este guia de vídeo irá delinear um fluxo de trabalho representativo para experimentos de medição única célula sobrevivência de neurônios corticais preliminares rato, expressando uma proteína fluorescente. O espectador vai aprender a alcançar alta eficiência transfections, coletar e processar imagens, permitindo o acompanhamento prospectivo de células individuais e comparar a sobrevivência relativa das populações neuronais usando análise de riscos proporcionais de Cox.

Usando o procedimento de transfeccao descrito aqui, DIV4 neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. A partir do pós-transfection 24 h, células foram fotografadas por microscopia de fluorescência cada 24 h durante 10 dias consecutivos. As imagens resultantes foram organizadas conforme indicado na Figura 2, em seguida, costuradas, empilhadas e marcou para a morte celular (<strong class="...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.

Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Este protocolo permite que os pesquisadores monitorem a sobrevivência em uma base unicelular e identifiquem variáveis que predizem significativamente a morte celular ou a sobrevivência. Ensaios convencionais de citotoxicidade avaliam populações de células e não têm a capacidade de discriminar células individuais. A microscopia longitudinal permite a atribuição do tempo de morte para cada célula em uma população.Esta técnica é adequada para avaliar novas terapias para doenças neurodegenerativas e outras condições. Este método tem se mostrado inestimável para explorar mecanismos de doença em condições neurodegenerativas, e poderia ser aplicado com igual eficácia para outros transtornos em que a morte celular é de interesse. Os pesquisadores podem ter dificuldade em alcançar eficiências de transfecção adequadas sem toxicidade indevida.A prática com o tubo multicanal e a familiaridade com o protocolo devem diminuir essas dificuldades ao longo do tempo. Microscopia é uma metodologia inerentemente visual. Portanto, a técnica pode ser mais facilmente compreendida observando além da leitura.Para começar, combine a quantidade apropriada de mídia séreo reduzida e reagente de transfecção em um tubo, e reduza a mídia sérico e o DNA em um tubo separado. Incuba-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.Use um tubo multicanal e calhas plásticas estéreis para lavar os neurônios corticais duas vezes com 100 microliters de mídia basal neural por poço. E armazene a mídia condicionada e outras mídias remanescentes a 37 graus Celsius. Substitua o NBM por 100 microliters de solução NBKY previamente preparada por poço.Após 20 minutos, pipet 50 microliters do reagente transfecção e mistura de DNA dropwise em cada poço. Incubar as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Enxágüe as células duas vezes com a solução NBKY.Em seguida, adicione 100 microliters de mídia condicionada e 100 microliters de solução NBC para os poços. Para começar a fotografar as células, coloque a placa 96 em um microscópio fluorescente. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura.Em seguida, navegue até áreas de interesse e regissuça suas coordenadas x e y em relação à marca. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura. Finalmente, concentre-se nas células transfeinadas expressando um rótulo fluorescente.Tire várias imagens em intervalos regularmente espaçados nos canais fluorescentes apropriados. Para começar com o processamento de imagens, clique duas vezes no ícone Fiji. Em seguida, clique e arraste a imagem sublinhando o processamento macro para a barra fiji para abrir a macro dentro de Fiji.Ajuste as linhas de duas a sete da macro de processamento de sublinhado da imagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, clique na costura e, em seguida, costura de grade/coleta. Ajuste as configurações dentro dos menus suspensos, digite e peça, até que uma imagem com precisão seja produzida.Ajuste as variáveis de tipo de grade e ordem de ponto nas linhas oito e nove de acordo com essas seleções. Em seguida, ajuste a linha 10 para especificar o número de imagens por poço e defina a opção de subtração de fundo na linha 14 para verdade, se necessário. Ajuste a linha 15 para definir o raio da bola rolando de acordo com o protocolo de texto e clique em Executar.Finalmente, abra as pilhas de imagens de saída e identifique manualmente os neurônios mortos de acordo com o protocolo de texto. Registo os dados em um arquivo de planilha. Para realizar análises estatísticas, clique duas vezes no ícone para sobreviver.R script. Destaque a linha dois e clique no botão executar para carregar a biblioteca de sobrevivência. Em seguida, altere o caminho na linha cinco para chamar a planilha de entrada e clique no botão executar.Destaque as linhas oito e nove e clique no botão executar para realizar a análise de riscos proporcionais de Cox. Linhas de destaque 12 a 16 e 19 a 24. Clique no botão executar para traçar o risco cumulativo de morte e os dados de sobrevivência como uma curva Kaplan-Meier.Neste estudo, os neurônios cortical de ratos foram transfectados a quatro dias após o revestimento com um plasmídeo codificando a proteína fluorescente M maçã. 24 horas após a transfecção, os neurônios foram imagens por microscopia de fluorescência a cada 24 horas por 10 dias consecutivos. Após a aquisição da imagem, as imagens foram processadas e examinadas sequencialmente para marcar a morte da célula.A hora da morte de cada célula foi determinada por mudanças na fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular. A análise de riscos proporcionais de Cox realizada nos dados de sobrevivência dos neurônios mutantes resultou em uma razão de risco de 2,2. Este resultado indicou uma taxa mais rápida de morte nos neurônios mutantes em comparação com a população do tipo selvagem.A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é pipetar cuidadosamente. Minimizar a exposição ao ar e evitar bolhas é fundamental para uma transfecção bem sucedida. Após a transfecção, a microscopia de fluorescência longitudinal pode ser usada para rastrear vários fatores que podem contribuir para a morte celular, incluindo localização de proteínas, rotatividade e nível de expressão, além da sobrevivência celular.No campo da neuro degeneração, a natureza dinâmica da microscopia longitudinal lançou luz sobre se a agregação de proteínas associadas à doença representa um evento tóxico ou protetor. Nenhum desses reagentes ou instrumentos são perigosos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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