Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
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Agradecemos a Steve Finkbeiner y miembros del laboratorio de Finkbeiner pionera en microscopía robotizada. También agradecemos a Dan Peisach edificio el software inicial había requerida para el procesamiento de imágenes y había automatizado de análisis de supervivencia. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y Stroke (NINDS) R01-NS097542, la Universidad de Michigan proteína plegable enfermedad la iniciativa y activa contra ALS de Ann Arbor.

Animal vertebrado todo el trabajo fue aprobado por el Comité sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos se planean cuidadosamente para reducir al mínimo el número de animales sacrificados. Embarazadas mujer tipo salvaje (WT), ratas de largo Evans no transgénicas (Rattus norvegicus) se encuentran solo en cámaras equipadas con enriquecimiento ambiental y atendida por la unidad de medicina Animal laboratorio (ULAM) en la Universidad de Michigan, en ...

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Aquí, se presenta la metodología para monitorear directamente la supervivencia neuronal en forma unicelular. En contraste con los ensayos tradicionales de muerte celular que se limitan a puntos de tiempo discretos y poblaciones enteras de las células, este método permite la evaluación continua de una variedad de factores como la morfología celular, expresión de la proteína o localización, y puede determinar cómo cada factor influye en la supervivencia celular en forma prospectiva.
Es...

Muerte celular anormal es un factor de conducción en muchas enfermedades, incluyendo cáncer, neurodegeneración y tiempos1. Robustos y sensibles análisis de muerte celular son esenciales para la caracterización de estos trastornos, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas para ampliar o reducir la supervivencia celular. Actualmente existen decenas de técnicas para la medición de muerte celular, ya sea directamente o a través de sustituto marcadores2. Por ejemplo, la muerte celular puede ser evaluada visualmente con la ayuda de colorantes vitales que tiñe selectivamente las células muertas o vivas3, o mediante el control de la aparición de fosfolípidos específicos en la membrana plasmática4,5,6 . Mediciones de componentes intracelulares o metabolitos celulares liberados en los medios de comunicación sobre disolución celular también pueden ser utilizadas como sustitutos célula muerte7,8. Por otra parte, viabilidad celular se puede aproximar mediante la evaluación de la actividad metabólica9,10. Aunque estos métodos proporcionan medios rápidos de evaluar la supervivencia de la célula, no son sin salvedades. Cada técnica observa la cultura como una sola población, haciendo imposible distinguir entre las células individuales y su ritmo único de supervivencia. Además, estos ensayos poblacionales son incapaces de medir factores que pueden ser importantes para la muerte celular, incluyendo localización, morfología celular y expresión de la proteína. En muchos casos, estos ensayos están limitados a puntos de tiempo discretos y no permiten la observación continua de las células con el tiempo.
En cambio, la microscopía de fluorescencia longitudinal es una metodología altamente flexible que directamente y continuamente monitorea el riesgo de muerte en una sola célula base11. En Resumen, microscopía de fluorescencia longitudinal permite miles de células individuales para realizar un seguimiento a intervalos regulares durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite determinaciones precisas de la muerte de las células y los factores que mejoran o inhiben la muerte celular. En su base, el método implica la transfección transitoria o transducción de células con vectores que codifican las proteínas fluorescentes. Luego se establece un único Fiduciario, y la posición de cada célula transfected en relación con este monumento permite al usuario de la imagen y seguir las células individuales en el transcurso de horas, días o semanas. Cuando estas imágenes se ven secuencialmente, la muerte celular se caracteriza por cambios característicos en la fluorescencia, la morfología y la fragmentación del cuerpo de la célula, permitiendo la asignación de un tiempo de la muerte para cada celda. La tasa calculada de la muerte, determinada por la función de riesgo, puede entonces ser cuantitativamente en comparación entre condiciones, o relacionados con seleccionar características celulares usando univariantes o multivariantes de análisis de riesgos proporcionales Cox12. Juntos, estos métodos permiten la discriminación precisa y objetiva de las tasas de muerte celular en poblaciones celulares y la identificación de las variables que predicen significativamente la muerte celular o supervivencia (figura 1).
Aunque este método puede utilizarse para monitorear la supervivencia en cualquier tipo de poste-mitotic de la célula en una variedad de formatos de la galjanoplastia, este protocolo describe las condiciones de transferencia y proyección de imagen las neuronas corticales de rata cultivadas en una placa de 96 pocillos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Ensayos de citotoxicidad estándar, que requieren la colección de lisados o células fijas en varios puntos del tiempo, han limitado la sensibilidad y la capacidad para evaluar los factores que influyen en la suerte neuronal. Estos ensayos requieren la observación de diferentes poblaciones de células en los puntos de tiempo discretos. Como resultado, las células individuales no pueden seguirse prospectivamente con el tiempo, limitando seriamente la capacidad de discriminar si eventos subcelulares, tales como formación de puncta o mislocalization proteína, son patogénicos de enfermedad, respuestas homeostáticas, o fenómenos meramente coincidentes. Sola célula longitudinal microscopia supera estas limitaciones, permitiendo al investigador determinar las diferencias en la supervivencia entre las poblaciones y las relaciones causales con mayor sensibilidad. Esta video guía describirá un flujo de trabajo representativa para los experimentos de medición unicelular supervivencia de neuronas corticales primarias de rata expresan un marcador de proteína fluorescente. El visor se aprende a lograr alta eficiencia transfecciones, recoger y procesar imágenes permitiendo el seguimiento prospectivo de células individuales y comparar la supervivencia relativa de poblaciones neuronales utilizando el análisis de riesgos proporcionales de Cox.

Utilizando el procedimiento de transfección descrito aquí, DIV4 neuronas corticales de rata fueron transfectadas con un plásmido de codificación de la proteína fluorescente mApple. A partir de transfección después de 24 h, las células fueron reflejadas por microscopía de fluorescencia cada 24 h por 10 días consecutivos. Las imágenes resultantes fueron organizadas como se indica en la figura 2, luego cosidas apiladas y anotó para la muerte celular ...

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Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Aquí, presentamos un protocolo de seguimiento de sobrevivencia de forma unicelular e identificar variables que predicen significativamente la muerte celular.

Monitoreo de la supervivencia Neuronal a través de microscopía de fluorescencia Longitudinal

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Este protocolo permite a los investigadores monitorear la supervivencia en una sola célula e identificar variables que predicen significativamente la muerte o supervivencia celular. Los ensayos convencionales de citotoxicidad evalúan las poblaciones de células y carecen de la capacidad de discriminar las células individuales. La microscopía longitudinal permite la asignación del tiempo de muerte para cada célula en una población.Esta técnica es adecuada para evaluar nuevas terapias para enfermedades neurodegenerativas y otras condiciones. Este método ha demostrado ser invaluable para explorar los mecanismos de la enfermedad en condiciones neurodegenerativas, y podría aplicarse con la misma eficacia hacia otros trastornos en los que la muerte celular es de interés. Los investigadores pueden tener problemas para lograr eficiencias de transfección adecuadas sin toxicidad indebida.La práctica con la pipeta multicanal y la familiaridad con el protocolo deben disminuir estas dificultades con el tiempo. La microscopía es una metodología inherentemente visual. Por lo tanto, la técnica puede ser más fácil de entender observando además de la lectura.Para comenzar, combine la cantidad adecuada de medios séricos reducidos y reactivo de transfección en un tubo, y reducir los medios séricos y el ADN en un tubo separado. Incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, combine el contenido de ambos tubos e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.Utilice una pipeta multicanal y vaguadoras de plástico esterilizado para lavar las neuronas corticales dos veces con 100 microlitros de medios basales neuronales por pozo. Y almacene los medios acondicionados y otros medios restantes a 37 grados centígrados. Sustituya el NBM por 100 microlitros de la solución NBKY previamente preparada por pozo.Después de 20 minutos, pipetear 50 microlitros del reactivo de transfección y la mezcla de ADN gota a gota en cada pocólite. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Enjuague las células dos veces con la solución NBKY.A continuación, agregue 100 microlitros de medios acondicionados y 100 microlitros de la solución NBC a los pozos. Para comenzar a tomar imágenes de las células, coloque la placa de 96 pozos en un microscopio fluorescente. Utilice una marca fiduciaria única para cada placa como referencia para la alineación futura y guarde una imagen para futuras referencias.A continuación, vaya a las áreas de interés y registre sus coordenadas x e y en relación con la marca. Utilice una marca fiduciaria única para cada placa como referencia para la alineación futura y guarde una imagen para futuras referencias. Por último, concéntrese en las células trans infectadas que expresan una etiqueta fluorescente.Tome varias imágenes a intervalos espaciados regularmente en los canales fluorescentes apropiados. Para comenzar con el procesamiento de imágenes, haga doble clic en el icono de Fiji. A continuación, haga clic y arrastre la macro de procesamiento de subrayado de la imagen a la barra de Fiji para abrir la macro dentro de Fiji.Ajuste las líneas dos a siete de la macro de procesamiento de subrayado de la imagen de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, haga clic en la costura y, a continuación, en la costura de rejilla/colección. Ajuste los ajustes dentro de los menús desplegables, escriba y orden, hasta que se produzca una imagen cosida con precisión.Ajuste el tipo de rejilla y las variables de orden de puntada en las líneas ocho y nueve de acuerdo con estas selecciones. A continuación, ajuste la línea 10 para especificar el número de imágenes por pozo y establezca la opción de resta de fondo en la línea 14 en true, si es necesario. Ajuste la línea 15 para establecer el radio de la bola rodante de acuerdo con el protocolo de texto y haga clic en Ejecutar.Por último, abra las pilas de imágenes de salida e identifique manualmente las neuronas muertas de acuerdo con el protocolo de texto. Registre los datos en un archivo de hoja de cálculo. Para realizar análisis estadísticos, haga doble clic en el icono para la supervivencia.Guión R. Resalte la línea dos y haga clic en el botón Ejecutar para cargar la biblioteca de supervivencia. A continuación, cambie la ruta en la línea cinco para llamar a la hoja de cálculo de entrada y haga clic en el botón Ejecutar.Resalte las líneas ocho y nueve y haga clic en el botón Ejecutar para realizar el análisis de peligros proporcionales de Cox. Resalte las líneas 12 a 16 y 19 a 24. Haga clic en el botón Ejecutar para trazar el riesgo acumulado de muerte y los datos de supervivencia como una curva Kaplan-Meier.En este estudio, las neuronas corticales de rata fueron transfectados a los cuatro días después del enchapado con un plásmido que codifica la proteína fluorescente M manzana. 24 horas después de la transfección, las neuronas fueron imágenes por microscopía de fluorescencia cada 24 horas durante 10 días consecutivos. Después de la adquisición de la imagen, las imágenes fueron procesadas y examinadas secuencialmente para marcar la muerte celular.La hora de muerte de cada célula fue determinada por cambios en la fluorescencia, morfología y fragmentación del cuerpo celular. El análisis proporcional de riesgos de Cox realizado en los datos de supervivencia de las neuronas mutantes dio lugar a una relación de peligro de 2,2. Este resultado indica una tasa más rápida de muerte en las neuronas mutantes en comparación con la población de tipo salvaje.Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es pipetear cuidadosamente. Minimizar la exposición al aire y evitar las burbujas es fundamental para una transfección exitosa. Después de la transfección, la microscopía longitudinal de fluorescencia se puede utilizar para rastrear varios factores que pueden contribuir a la muerte celular, incluyendo la localización de proteínas, la rotación y el nivel de expresión, además de la supervivencia celular.Dentro del campo de la neuro degeneración, la naturaleza dinámica de la microscopía longitudinal ha arrojado luz sobre si la agregación de proteínas asociadas a la enfermedad representa un evento tóxico o protector. Ninguno de estos reactivos o instrumentos son peligrosos.

Research

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