Name: monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Steve Finkbeiner ve üyeleri Finkbeiner lab robot mikroskobu öncü için teşekkür ederim. Biz de ilk yazılım görüntü işleme için gerekli ve sağkalım Analizi otomatik bina için Dan Peisach teşekkür ederim. Bu eser nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) R01-NS097542, Michigan Üniversitesi'nde Protein katlanır hastalığı girişimi ve Ann Arbor etkin ALS karşı için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Tüm omurgalı hayvan iş kullanımı ve bakımı hayvanlar Michigan Üniversitesi (iletişim kuralı # PRO00007096) Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyleri dikkatle hayvanlar kurban sayısını en aza indirmek için planlanmaktadır. Hamile kadın vahşi tipi (WT), transgenik olmayan uzun Evans fareler (Rattus norvegicus) ev sahipliği yaptığı tek başına çevre zenginleştirme ile donatılmış ve Michigan Üniversitesi'nde Laboratuvar hayvan Tıp (ULAM) için birimi tarafından yapılan bakım odalar...

<ol>
	<li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+health+and+disease.">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li><li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+assays+for+drug+discovery.">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li><li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death:+a+common+mechanism+in+necrosis,+apoptosis+and+autophagy.">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible,+ischemic+liver+cell+injury.">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li><li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells.">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li><li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage.">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li><li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death.">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li><li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival.">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li><li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate.">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li><li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+survival+analysis+using+Cox&#8217;s+regression+model.">Multivariate survival analysis using Cox&#8217;s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li><li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization.">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia.">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606 (2018).</li><li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response.">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005 (2017).</li><li>Park, S. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis.">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proline/Arginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome.">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li><li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy.">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li></ol>

Burada, doğrudan tek hücre olarak nöronal hayatta kalma izlemek için metodoloji sunulur. Ayrık zaman puan ve hücre tüm nüfus için sınırlı olan geleneksel deneyleri aksine hücre ölümü için çeşitli faktörlere hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme, gibi sürekli değerlendirilmesi için bu yöntem sağlar ve nasıl her faktörü hücresel hayatta kalma ileriye dönük bir şekilde etkilediği belirleyebilirsiniz.
Bu metodoloji deneysel ihtiyaçlarını geniş ...

Anormal hücre ölümü kanser, ateş ve kontur1de dahil olmak üzere birçok hastalığın sürüş bir faktördür. Hücre ölümü için güçlü ve hassas deneyleri genişleterek veya daraltarak hücresel hayatta kalmak için bu bozuklukların karakterizasyonu yanı sıra tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gereklidir. Şu anda hücre ölümü, doğrudan veya vekil işaretleri2Ölçme teknikleri düzinelerce vardır. Örneğin, hücre ölümü görsel yardımıyla seçerek ölü veya canlı hücre3leke hayati boyalar veya plazma zarı4,5,6 belirli fosfolipitler görünümünü izleme tarafından tespit edilebilir . Hücre içi bileşenleri veya hücresel metabolitleri hücresel dağılması üzerine medya içine serbest ölçülerini, hücre ölüm7,8için proxy olarak da kullanılabilir. Alternatif olarak, hücre canlılığı metabolik aktivite9,10değerlendirmek tarafından yaklaşık. Bu yöntemleri hücre survival değerlendirirken bir hızlı yol sağlar rağmen onlar uyarılar değildir. Her teknik kültürü tek tek hücreler ve hayatta kalma kendi benzersiz oranları arasında ayırt etmek imkansız rendering tek bir nüfus olarak gözlemler. Ayrıca, bu tür nüfus tabanlı deneyleri hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme dahil olmak üzere hücre ölümü için önemli olabilir faktörler ölçmek mümkün değildir. Birçok durumda, bu deneyleri ayrık zaman puan için sınırlıdır ve hücreler sürekli gözlem altında zaman içinde izin vermez.
Buna ek olarak, boyuna floresans mikroskobu doğrudan ve sürekli olarak bir tek hücre olarak11ölüm riski izler son derece esnek bir metodoloji var. Kısacası, boyuna floresans mikroskobu düzenli aralıklarla uzun bir süre hücre ölümü ve geliştirmek veya hücre ölümü bastırmak faktörler kesin tespitler izin, için izlenmesi gereken tek tek hücreleri binlerce sağlar. Kaidesi Yöntem geçici transfection veya hücre iletim flüoresan protein kodlama vektörleri ile içerir. Benzersiz yediemin ardından kurulan ve bu simgesel yapı ile ilgili olarak transfected her hücrenin konumu görüntü ve tek tek hücreler saat, gün veya hafta boyunca izlemek Kullanıcı sağlar. Bu görüntüleri ardışık olarak görüntülendiğinde, hücre ölümü floresan, Morfoloji ve parçalanma her hücre için ölüm zamanını atanması olanaklı kılmak hücre vücudun karakteristik değişiklikler tarafından işaretlenir. Hazard fonksiyonu tarafından belirlenen ölüm, hesaplanan oranı daha sonra nicelik arasında koşulları karşılaştırıldığında veya tekdeğişirli veya çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler analiz12kullanarak hücresel özellikleri seçmek için ilgili. Birlikte, bu yaklaşımların oranları hücresel popülasyonlar arasında hücre ölümü ve hücre ölümü ve/veya hayatta kalma (Şekil 1) önemli ölçüde tahmin değişkenleri tanımlaması doğru ve objektif ayrımcılık etkinleştirin.
Bu yöntem her sonrası Mitotik hücre tür biçimleri kaplama çeşitli ve hayatta kalma izlemek için kullanılabilmesine rağmen bu iletişim kuralını transfecting ve fare kortikal nöronlar kültürlü bir 96-şey tabak içinde görüntüleme için koşullar anlatacağız.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Acid Hydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>0876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neuronal survival via longitudinal fluorescence microscopy

Lysates veya birden fazla zaman noktalarda sabit hücreler topluluğu gerektiren standart sitotoksisite deneyleri, duyarlılık ve nöronal kaderini etkileyen faktörleri değerlendirmek için kapasitesi sınırlıdır. Bu deneyleri hücre ayrık zaman noktalarda ayrı nüfus gözlenmesi gerekir. Sonuç olarak, tek tek hücreleri prospektif ciddi puncta oluşumu veya protein mislocalization, gibi hücre altı olaylar hastalığın patojenik sürücüleri homeostatik yanıt olup ayrımcılık yeteneği sınırlı zaman içinde izlenemiyor, ya da sadece tesadüfi olaylar. Tek hücreli boyuna mikroskobu araştırmacı hayatta kalma nüfus arasındaki farklılıkları belirlemek ve nedensel ilişkileri gelişmiş hassasiyeti ile çizmek izin bu sınırlamalar üstesinden gelir. Bu video rehber tek hücreli hayatta kalma bir floresan protein marker ifade sıçan birincil kortikal nöronların ölçme deneyleri için temsil edici bir iş akışı açıklayacağım. Görüntüleyiciyi yüksek verimli transfections elde etmek, toplamak ve tek tek hücreler potansiyel izlemeyi etkinleştirme görüntüleri işlemek nasıl öğrenin ve nöron popülasyonları Cox orantılı tehlikeler analizi kullanarak göreli yaşama karşılaştırın.

Burada açıklanan transfection yordamı kullanarak, DIV4 sıçan kortikal nöronlar floresan protein mApple kodlama bir plazmid ile transfected. 24 saat sonrası transfection başlayarak, hücreleri floresan mikroskopi her 24 h 10 gün üst üste görüntüsü. Sonuç görüntüleri Şekil 2' de gösterildiği gibi düzenlenen sonra dikişli, yığılmış ve hücre ölümü (Şekil 1) attı. Şekil 3</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Bu protokol, araştırmacıların hayatta kalma larını tek hücrebazında izlemelerine ve hücre ölümünü veya hayatta kalmayı önemli ölçüde öngören değişkenleri belirlemelerine olanak tanır. Konvansiyonel sitotoksisite tahlilleri hücre popülasyonlarını değerlendirmek ve bireysel hücreleri ayırt etme yeteneği eksikliği. Boylamsal mikroskopi, popülasyondaki her hücre için ölüm zamanının atanmasını sağlar.Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar ve diğer durumlar için yeni tedavilerin değerlendirilmesi için uygundur. Bu yöntem nörodejeneratif koşullarda hastalık mekanizmaları keşfetmek için paha biçilmez kanıtlanmıştır, ve hücre ölümü ilgi olduğu diğer bozukluklara karşı eşit etkinlik ile uygulanabilir. Araştırmacılar gereksiz toksisite olmadan yeterli transfeksiyon verimliliği elde ile mücadele edebilir.Çok kanallı pipet ile pratik ve protokol aşinalık zaman içinde bu zorluk azalmalıdır. Mikroskopi doğal olarak görsel bir metodolojidir. Bu nedenle, tekniği okuma nın yanı sıra izleyerek daha kolay anlaşılabilir.Başlamak için, bir tüpte uygun miktarda azaltılmış serum media ve transfeksiyon reaktifini ve serum media ve DNA'yı ayrı bir tüpte birleştirin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında hem tüpler ve kuluçka içeriğini birleştirin.Kortikal nöronları her kuyuda 100 mikrolitre nöral bazal ortamla iki kez yıkamak için çok kanallı pipet ve steril plastik çukurlar kullanın. Ve şartlı medya ve diğer kalan ortamları 37 santigrat derecede saklayın. NBM'yi her kuyuda önceden hazırlanmış 100 mikrolitre NBKY çözeltisi ile değiştirin.20 dakika sonra, transfeksiyon reaktifi ve DNA karışımı nın 50 mikrolitrepipet her kuyuya damlacık. Hücreleri 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri NBKY çözeltisi ile iki kez durulayın.Daha sonra kuyulara 100 mikrolitre klimalı ortam ve 100 mikrolitre NBC çözeltisi ekleyin. Hücreleri görüntülemeye başlamak için, 96 kuyu plakasını floresan mikroskoba yerleştirin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin.Ardından, ilgi alanlarına gidin ve işarete göre x ve y koordinatlarını kaydedin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin. Son olarak, floresan etiketi ifade transfected hücreleri odaklanmak.Uygun floresan kanallarda düzenli aralıklarla birden fazla görüntü alın. Görüntü işleme ile başlamak için, Fiji simgesine çift tıklayın. Ardından, Fiji içindeki makroyu açmak için görüntünün alt çiziş makrosunu Fiji çubuğuna sürükleyin.Görüntünün iki ila yedi satırLarını metin protokolüne göre işleme makrosunu alt üst edin. Sonra, dikiş tıklayın ve sonra ızgara / toplama dikiş. Doğru dikişli bir görüntü üretilene kadar açılır menüler, tür ve sipariş teki ayarları ayarlayın.Bu seçimlere göre sekiz ve dokuzuncu satırlarda ızgara türü ve dikiş sırası değişkenlerini ayarlayın. Ardından, kuyu başına görüntü sayısını belirtmek için satır 10'u ayarlayın ve gerekirse arka plan çıkarma seçeneğini satır 14'e doğru ayarlayın. Yuvarlanan top yarıçapını metin protokolüne göre ayarlamak için satır 15'i ayarlayın ve Çalıştır'ı tıklatın.Son olarak, çıktı görüntü yığınlarını açın ve metin protokolüne göre ölü nöronları el ile tanımlayın. Verileri elektronik tablo dosyasına kaydedin. İstatistiksel analiz yapmak için, hayatta kalmak için simgeye çift tıklayın.R komut dosyası. İkinci satırı vurgulayın ve hayatta kalma kitaplığını yüklemek için çalıştır düğmesini tıklatın. Ardından, giriş elektronik tablosunu aramak için beşinci satırdaki yolu değiştirin ve çalıştır düğmesini tıklatın.Sekiz ve dokuz daki satırları vurgulayın ve Cox orantılı tehlike çözümlemesi gerçekleştirmek için çalıştır düğmesini tıklatın. 12-16 ve 19-24 arası satırları vurgulayın. Kümülatif ölüm riskini ve hayatta kalma verilerini Kaplan-Meier eğrisi olarak çizmek için çalıştır düğmesini tıklatın.Bu çalışmada, sıçan kortikal nöronlar floresan protein M elma kodlama bir plazmid ile dört gün sonrası kaplama transfected edildi. Transfeksiyon sonrası 24 saat, nöronlar floresan mikroskopi ile 10 gün üst üste her 24 saatte bir görüntülendi. Görüntü edinimi nin ardından görüntüler işlendi ve hücre ölümünü işaretlemek için sırayla incelendi.Her hücre için ölüm zamanı floresan, morfoloji ve hücre gövdesinin parçalanması değişiklikleri ile belirlendi. Mutant nöronların sağkalım verileri üzerinde yapılan cox orantılı tehlike analizi 2.2 tehlike oranı ile sonuçlandı. Bu sonuç, vahşi tip popülasyona kıyasla mutant nöronlarda daha hızlı bir ölüm oranı gösterdi.Bu yordamı çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, dikkatli bir şekilde borulamaktır. Hava maruziyetini en aza indirmek ve kabarcıklardan kaçınmak başarılı bir transfeksiyon için çok önemlidir. Transfeksiyondan sonra, uzunlamasına floresan mikroskobu hücre sağkalım ek olarak, protein lokalizasyonu, ciro ve ifade düzeyi de dahil olmak üzere hücre ölümüne katkıda bulunabilir çeşitli faktörlerin izlenmesi için kullanılabilir.Nöro dejenerasyon alanında, uzunlamasına mikroskopinin dinamik doğası, hastalıkla ilişkili proteinlerin toplanmasının toksik veya koruyucu bir olayı temsil edip etmediğine ışık tutmuştur. Bu reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri tehlikeli değildir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

Trakeostomi Ile İntra-Arteriyel Kan Basıncı İzleme ve Ventilasyon Kullanan Farelerde Beyin Ölümü İndüksiyonu

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...