Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها جزئيا منحة "رابطة تعزيز البحوث العالمية" من "وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا" إلى T.I.S.

ملاحظة: تأكد من أن المواد المطلوبة متاحة ومعدة بشكل صحيح (انظر الجدول للمواد).
1-إعداد
<ol><li>ميكانيكيا عينة الأنسجة (1-2 مغ أنسجة في 100 ميليلتر من تحلل العازلة، الجدول 1) أو استزراع الخلايا (10 سم اللوحة التي روافد 80-90 ٪ في 350 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت)، مع أن ا...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية بسيط نسبيا لتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة. تستند إلى الخصائص غير عادية الانزيمية CK2 الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول وتشمل ثيوفوسفوريليشن CK2-تعتمد على البروتينات الركازة محددة باستخدام غتبγS وإيمونوبريسيبيتيشن اللاحقة وتحديد ...

مؤنزم البروتين هي المكونات الرئيسية لتوصيل إشارة الشلالات. يتسبب الفسفرة من الركازة البروتينات بهذه الإنزيمات الاستجابات البيولوجية التي تنظم الأحداث الحرجة التحكم في انقسام الخلايا والايض والتمايز، بين أمور أخرى. CK2 كيناز acidophilic، وأعربت عن أوبيكويتوسلي سيرين/ثريونين التي حفظت من الخميرة للبشر والتي تلعب أدواراً هامة في العديد من العمليات الخلوية التي تتراوح بين تنظيم النسخي تقدم دورة الخلية للمبرمج1 ،،من23. الإنزيم هيتيروتيترامير يتألف من اثنين α حفاز (أو α ') مفارز واثنين من مفارز β التنظيمية4. بالإضافة إلى كونها شديدة بليوتروبيك، يسلك CK2 اثنين غير عادية الخصائص الأخرى التي تؤدي إلى تعقيد تحليله، هما النشاط التأسيسي5 والركيزة المشارك المزدوج خصوصية6. هذه الخاصية الأخيرة يمنح CK2 مع القدرة على استخدام غتب فضلا عن ATP الفسفرة بروتينات الركازة.
يؤدي حذف الوراثية لمفارز حفاز أو تنظيمية من CK2 في الفئران الجنينية الفتك مشيراً إلى أنها تلعب أدواراً حاسمة خلال التنمية و7،أورجانوجينيسيس8. CK2 هو أوفيريكسبريسيد أيضا في عدة أنواع من السرطان، ومما يمثل10،9،11هدف علاجية واعدة. وفي الواقع، مثبطات محددة هذا النشاط كيناز CK2 المستهدف حاليا قيد التحقيق لهذا الغرض12،،من1314. وفي حين يتم تثبيط CK2 خياراً قابلاً للتطبيق، نظراً لطبيعته بليوتروبيك، بديل وربما سيكون نهج أكثر عقلانية لاستهداف ركائز CK2 الهامة التي تكمن وراء التقدم لأنواع معينة من السرطان. ولذلك، ستكون شاملة تحديد وتوصيف CK2 الركازة البروتينات ذات فائدة كبيرة لتوضيح الدالة محددة من هذا كيناز داخل نوع معين من الأنسجة أو الورم.
هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية تنوعاً لتحديد ركائز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية أو نسيج ليساتي. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية الركازة المشارك المزدوج CK2 باستخدام التناظرية غتب GTPγS (جانسين 5'-[γ-thio]triphosphate) التي لا يمكن استخدام مؤنزم الذاتية الأخرى. يسمح هذا فعالية كيناز "تسمية" ركائز لها داخل هذه العينة لعزل اللاحقة وتحديد الهوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

من الضروري دراسة العلاقات كيناز-الركيزة للحصول على فهم كامل لوظائف هذه الإنزيمات وأهدافها النهائية في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. CK2 كيناز تقحم مصانة سيرين/ثريونين مع قائمة متزايدة من مئات ركائز المتورطين في العمليات الخلوية متعددة. بسبب خصائصه بليوتروبيك، تحديد ووصف مجموعة شاملة من ركائز CK2 كان يشكل تحديا كبيرا ولا يزال عقبة في دراسة هذا الإنزيم هام. ولمواجهة هذا التحدي، وضعنا استراتيجية تجريبية متعددة الاستخدامات التي تمكن من إثراء المستهدفة وتحديد ركائز CK2 المفترضة. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية فريدة الركازة المشارك المزدوج CK2 السماح ثيوفوسفوريليشن محددة من ركائز لها في خلية أو نسيج ليستي. هذه البروتينات الركازة يتم في وقت لاحق يؤلكل، إيمونوبريسيبيتاتيد، وحددها السائل اللوني/جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS). وقد استخدمنا سابقا هذا النهج بنجاح تحديد ركائز CK2 من المبايض المورفولوجية وهنا نعرب عن تطبيق هذا البروتوكول على خلايا جليوبلاستوما البشرية، التي توضح قدرة التكيف مع هذا الأسلوب للتحقيق الأدوار البيولوجية لهذا كيناز في نموذج الكائنات ونظم تجريبية مختلفة.

ويرد رسم تخطيطي للإجراءات التجريبية في الشكل 1. الأساس الكامنة وراء هذا الأسلوب هو القدرة غير عادية CK2 لاستخدام أنشئ لنقل الفريق فوسفوريل. ويؤدي إضافة خارجية holoenzyme CK2 جنبا إلى جنب مع التناظرية غتب، GTPγS، إلى خلية ليستي ثيوفوسفوريليشن ركائز CK2 الذاتية. المعا...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

والهدف من هذا البروتوكول هو التسمية، وإثراء، وتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية ليستي أو هوموجيناتي الأنسجة. هذا الأسلوب روافع الجوانب الفريدة للبيولوجيا CK2 لهذا الغرض.

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

ويسمح هذا البروتوكول بتسمية مركّب محدد وإثراء لاحق وتحديد ركائز CK2 الذاتية من عينة بيولوجية معقدة مثل الخلية أو الأنسجة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع الخلية أو الأنسجة. وبالتالي تسهيل، ودراسة CK2 في سياقات بيولوجية مختلفة.إثبات الإجراء سيكون جون تشوينوفسكي، طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء ، ميكانيكيا عينة الأنسجة أو الخلايا المستزرعة كما هو مبين في بروتوكول النص لجمع ما مجموعه 900 ميكرولترات من العينة. جهاز طرد مركزي في 17، 500 مرة الجاذبية و4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.ثم، نقل 270 ميكرولترات من عظمى إلى كل من ثلاثة أنابيب 1.7 ملليلتر microcentuge جديدة. إزالة 40 ميكرولترات من كبرى المتبقية لاستخدامها كتحكم في المدخلات، ونقلها إلى أنبوب جديد. ضع كل العينات على الجليد.أولاً، تسمية كل من الأنابيب عينة ثلاثة كما هو موضح هنا. إلى أنبوب رد فعل كيناز، إضافة 2.7 ميكرولترات من CK2 و 2.7 ميكرولترات من 2.5 ميللي ميللي GTPgammaS. نفض الغبار الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد.إلى أنبوب GTPgammas فقط، إضافة 2.7 ميكرولترات من 2.5 ملليمولار GTPgammaS، و 2.7 ميكرولترات من Lysis العازلة. نفض الغبار هذا الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد. إلى أنبوب PNBM فقط إضافة 5.4 ميكرولترات من Lysis العازلة.نفض الغبار الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد. احتضان جميع الأنابيب الثلاثة في حمام مائي في 30 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد هذا، إضافة 13.5 ميكرولترات من PNBM في 12 ملليغرام لكل ملليلتر إلى كل أنبوب.عكس الأنابيب لخلط العينات، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أثناء أخذ العينات، تسمية كل من الأعمدة للعينة ليتم تحميلها، كما هو موضح هنا. إعداد الأعمدة عن طريق عكس كل عمود عدة مرات لإعادة تعليق الراتنج سيخاديكس G-25 في المخزن العازلة.نعلق كل عمود إلى موقف المشبك، والسماح لها الجلوس دون عائق لمدة خمس دقائق تقريبا للسماح للراتنج تسوية. بعد ذلك، ضع أنبوبًا أسفل الفتح السفلي لكل عمود. إزالة القبعات من كل من أعلى وأسفل كل عمود، للسماح المخزن العازلة لاستنزاف في الأنابيب عن طريق الجاذبية.بمجرد استنفاد المخزن المؤقت، إضافة حوالي 2.7 ملليلتر من Lysis المخزن المؤقت إلى كل عمود لتكبيل لهم، مع التأكد من جمع وتجاهل تدفق من خلال. كرر هذه العملية لإضافة Lysis Buffer وتجاهل التدفق من خلال ثلاث مرات. للبدء، قم بتحميل كل عينة في عمودها الخاص.جمع والتخلص من تدفق من خلال. إضافة 420 ميكرولترات من Lysis العازلة إلى كل عمود لغسل العينات. السماح لتصفية Lysis المخزن المؤقت خلال العمود، وجمع وتجاهل تدفق من خلال.ثم، ضع الأنابيب في موضع تحت كل عمود لجمع العينات. إضافة 500 ميكرولترات من Lysis العازلة لكل عمود ل elute العينات. جمع من خلال تدفق، والذي يحتوي الآن على عدد من السكان المخصب من thiophosphorylated و CKKYLATed ركائز في رد فعل كيناز.وGGTPgammas رد الفعل فقط سوف تحتوي على ركائز thiophosphorylated و alkylated من قبل أي CK2 الحالية الذاتية. فإن رد فعل PNMB فقط تحتوي على البروتينات الألكيلية الخلفية. إزالة 80 ميكروليترس من كل Elution كعينة التحكم الإدخال Elution.بعد ذلك، تقسيم كل عينة إلى أنبوبين يحتوي كل منها على 200 ميكرولترات. تسمية كل من أنابيب لتكون إما المضادة للثيوفوسفات استر أو المناعية G، كما هو مبين هنا. إضافة 2.8 ميكروغرام من الأجسام المضادة استر المضادة ثوفوسفات إلى كل من أنابيب استر المضادة للثيوفوسفات.أضف 2.8 ميكروغرام من الأجسام المضادة Isotype Control إلى كل من أنابيب IGG. ثم ضع الأنابيب على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. خلال آخر 15 دقيقة من الحضانة العينة، واستخدام شفرة حلاقة نظيفة لقطع نهاية من طرف ماصة P200 لزيادة حجم قياس.مباشرة قبل الاستخدام، دوامة لفترة وجيزة أنبوب التخزين التي تحتوي على الخرز agarose. باستخدام تلميح المقصوص ، نقل 100 ميكرولترات من الخرز الطين في المناعة أنبوب جديد 1.7 ملليلتر microcentrifuge. من المهم أن دوامة الخرز قبل كل نقل لمنع الخرز من الاستقرار.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 17، 500 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة وتجاهل ناظر. Resuspend الخرز عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من Lysis العازلة ودوامة لفترة وجيزة لخلط.كرر هذه العملية من الطرد المركزي وغسل الخرز ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي، ضع الخرز على الجليد حتى تصبح جاهزة للشروع. وعندما تنتهي العينات من الاحتضان، فإن الطرد المركزي بها عند الجاذبية 17500 مرة وعند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.ثم، نقل 200 ميكرولترات من كل عينة إلى الأنابيب التي تحتوي على الخرز غسلها. ضع الأنابيب على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 17، 500 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.إزالة 40 ميكرولترات من كل عظمى لحفظها كتحكم في الاستنفاد. إزالة وتجاهل ما تبقى من عظمى، مع الحرص على عدم إزعاج الخرز. غسل العينات عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من Lysis العازلة لكل ودوامة لفترة وجيزة.جهاز طرد مركزي في 17، 500 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من فائقة. كرر هذه عملية الغسل والطرد المركزي ثلاث مرات مع الحرص على عدم إزعاج الخرز. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من 2X عينة العازلة إلى كل عينة تحتوي على الخرز.بالنسبة لكافة العينات الأخرى، والتي تتضمن عنصر تحكم الإدخال و عناصر التحكم في الإدخال Elution و عناصر التحكم في الاستنفاد، أضف 8 ميكرولترات من المخزن المؤقت 6X Sample. الماصات كل أنبوب صعودا وهبوطا لخلط باستثناء أنابيب تحتوي على الخرز، وتسخين جميع العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل الشروع في SDS-PAGE. لتقييم ما إذا كان المناعة ناجحة، تشغيل 25 إلى 30 ميكرولترات من كل عينة التي تم الاستعفاء من الخرز على هلام بولياكريلاميد منفصلة 12.5٪.وصمة عار كل هلام مع Coomassie الأزرق لتصور البروتينات المخصب من مراحل مختلفة من البروتوكول التجريبي. باستخدام جديدة، شفرات الحلاقة نظيفة، استخراج بعناية أي عصابات فريدة من نوعها موجودة في رد فعل كيناز المضادة للثيوفوسفات استر IP لين مع جعل علما الأوزان الجزيئية التقريبية. وينبغي استخدام شفرة حلاقة جديدة لكل فرقة فريدة من نوعها.والأساس الكامن في هذه التقنية هو أن هذه التقنية هي القدرة غير العادية لـ CK2 على استخدام GTP لنقل مجموعة الفوسفوريل. إضافة CK2 هولوينزيم خارجي جنبا إلى جنب مع GTP التناظرية, GTPgammaS, إلى lysate الخلية, النتائج في thiophosphorylation من ركائز CK2 الذاتية. العلاج اللاحق للlysate مع الكهلات كاشف ع-Nitrobenzyl mesylate يولد thiophosphate استر مويتي على هذه البروتينات الركيزة محددة، التي يمكن بعد ذلك أن تكون مناعية باستخدام المضادة استر ثيوفوسفات وتحديدها في نهاية المطاف من قبل قياس الطيف الشامل.في النتائج الإيجابية التمثيلية الموضحة هنا، نجحت CK2 التابعة، وثيوفوسفوريليشن والألكيل اللاحقة. كما هو متوقع، يتم ملاحظة إشارة استر مضادة للثيوفوسفات المعززة بواسطة النشاف الغربي فقط في الممر الذي يحتوي على رد فعل كيناز الكامل، وليس في GTPgammas فقط وPNMB العينات المعالجة فقط. هلام Coomassie الأزرق الملون من البروتينات المثبطة للمناعة والملمحة ، كما تثبت نتيجة إيجابية.كما العصابات الفريدة متعددة واضحة فقط في المضادة للثيوفوسفات استر IP لين, التي كان محتضنة lysate مع CK2 exogenous و GTPgammas. ثم يتم استئصال النطاق المميز من الجل وتقديمه لتحديد البروتين بواسطة قياس الطيف الكتلي. بعد هذا الإجراء، يجب التحقق من صحة ركائز CK2 المفترضة التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي باستخدام نهج إضافي، مثل الفسفور المعتمد CK2 في قياس كيناز في المختبر القياسي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...