Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet i en del af Commonwealth Universal forskning Enhancement tilskud fra Pennsylvania Department of Health til T.I.S.

Bemærk: Sikre, at de nødvendige materialer er tilgængelige og ordentligt forberedt (Se Tabel af materialer).
1. forberedelse
<ol><li>Mekanisk lyse vævsprøve (1-2 mg af væv i 100 µL af lysisbuffer, tabel 1) eller kulturperler celler (10 cm plade, der er 80-90% sammenflydende i 350 µL af lysisbuffer), med det mål er at samle alt 900 µL af prøven for eksperimentet. Bemærk, at denne diskenhed i lille overskud af hvad der kræves for eksperimentet bes...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Her, beskriver vi en relativt simpel biokemiske metode til at identificere substrater af protein kinase CK2 fra et komplekst biologisk prøve. De kritiske trin i denne protokol er baseret på de usædvanlige enzymatisk egenskaber af CK2 og omfatter CK2-afhængige thiophosphorylation af specifikke substrat proteiner ved hjælp af GTPγS og deres efterfølgende immunoprecipitation og identifikation. Med disse resultater, har vi bevist nytte og alsidighed af denne tilgang, som vi nu har anvendt denne strategi i bå...

Protein kinaser er vigtige komponenter i signaltransduktion cascades. Fosforylering af substrat proteiner af disse enzymer fremkalder biologiske svar, der regulerer kritiske begivenheder kontrollerer celledeling, stofskifte og differentiering, blandt andre. CK2 er en allestedsnærværende udtrykt, acidophilic Serin/Threonin kinase der er bevaret fra gær til mennesker og der spiller vigtige roller i mange cellulære processer lige fra transkriptionel regulering til cellecyklus progression til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer bestående af to katalytiske α (eller α') subunits og to lovgivningsmæssige β underenheder4. Ud over at være meget pleiotrope, udstiller CK2 to andre usædvanlige egenskaber at komplicerer sin analyse, nemlig konstitutiv aktivitet5 og dobbelt Co substrat specificitet6. Denne sidstnævnte egenskab forlener CK2 med mulighed for at bruge GTP samt ATP for fosforylering af substrat proteiner.
Genetiske sletning af de katalytiske eller administrative underenheder af CK2 i mus resultater i embryonale dødelighed viser, at det spiller afgørende roller i udviklingen og organogenesis7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer af kræft og dermed udgør en lovende terapeutiske mål9,10,11. Faktisk, specifikke hæmmere at mål CK2 kinase aktivitet er i øjeblikket under efterforskning for dette formål12,13,14. Mens hæmning af CK2 er en farbar vej, sin pleiotrope karakter, et alternativ og er måske mere rationel tilgang til at målrette kritiske CK2 substrater, der ligger til grund for progression af visse kræftformer. Derfor, omfattende identifikation og karakterisering af CK2 substrat proteiner ville være til betydelig gavn for belyse den specifikke funktioner af denne kinase inden for en bestemt væv eller tumor type.
Her, beskriver vi en alsidig biokemiske metode til at identificere CK2 substrater fra en komplekse biologiske prøve en celle eller væv lysate. Denne protokol udnytter dual Co substrat specificiteten af CK2 ved brug af GTP analog GTPγS (Guanosinmonofosfat 5'-[γ-thio]triphosphate), som andre endogene kinaser ikke kan bruge. Dette giver effektivt kinase at "mærke" sin substrater i denne prøve for efterfølgende isolation og identifikation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Studiet af kinase-substrat relationer er afgørende for at få en komplet forståelse af funktioner af disse enzymer og deres downstream mål i både fysiologiske og patologiske stater. CK2 er en evolutionært bevarede Serin/Threonin kinase med en voksende liste af hundredvis af substrater involveret i flere cellulære processer. På grund af sine pleiotrope egenskaber, identifikation og karakterisering af et omfattende sæt af CK2 substrater har været særligt udfordrende og forbliver en hurdle i studiet af dette vigtigt enzym. For at tage denne udfordring op, har vi udtænkt en alsidig eksperimentelle strategi, der muliggør målrettet berigelse og identifikation af formodede CK2 substrater. Denne protokol drager fordel af den unikke dual Co substrat specificitet af CK2 giver mulighed for specifikke thiophosphorylation sit underlag i en celle eller væv lysate. Disse substrat proteiner er efterfølgende alkylerede, immunoprecipitated, og identificeret af liquid chromatography/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidligere brugt denne tilgang til med held identificere CK2 substrater fra Drosophila æggestokke og her vi udvide anvendelsen af denne protokol på menneskelige glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne af denne metode til at undersøge de biologiske roller af denne kinase i forskellige modelorganismer og eksperimentelle systemer.

En skematisk diagram af forsøgsmetoden tilbydes i figur 1. Den underliggende grundlag af teknikken er CK2 usædvanlige evne til at bruge GTP for phosphoryl gruppe overførsel. Tilsætning af eksogene CK2 holoenzym sammen med GTP analog, GTPγS, at en celle lysate resultater i thiophosphorylation af endogene CK2 substrater. Efterfølgende behandling af de lysate med alkylating reagens p- nitrobenzyl mesylat (PNBM) genererer en thiophosphate ester gru...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Formålet med denne protokol er at mærke, berige og identificere substrater af protein kinase CK2 fra en kompleks biologisk prøve celle lysate f.eks væv homogenatet. Denne metode udnytter unikke aspekter af CK2 biologi til dette formål.

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Denne protokol giver mulighed for specifik mærkning og efterfølgende berigelse og identifikation af endogene CK2-substrater fra en kompleks biologisk prøve, f.eks. Denne metode kan anvendes på enhver celletype eller væv. Således lette, studiet af CK2 i forskellige biologiske sammenhænge.Demonstration af proceduren vil være John Chojnowski, en kandidat studerende fra mit laboratorium. Til at begynde, mekanisk lyse vævsprøven eller dyrkede celler som skitseret i tekstprotokollen til at indsamle i alt 900 mikroliter af prøven. Centrifuge ved 17, 500 gange tyngdekraften og ved fire grader celsius i tre minutter.Overfør derefter 270 mikroliter af supernatanten til hver af tre nye 1,7 milliliter mikrocentrifugerør. Fjern 40 mikroliter af den resterende supernatant, der skal bruges som input kontrol, og overføre det til et nyt rør. Læg alle prøverne på is.Først skal du mærke hvert af de tre prøverør som vist her. Til Kinase Reaction rør, tilsæt 2,7 mikroliter af CK2 og 2,7 mikroliter af 2,5 millimolar GTPgammaS. Svirp røret til at blande, og straks placere den på is.Til GTPgammas eneste rør, tilsæt 2,7 mikroliter af 2,5 millimolar GTPgammaS, og 2,7 mikroliter af Lysis Buffer. Svirp dette rør til at blande, og straks placere den på is. Til PNBM Only-røret tilsættes 5,4 mikroliter lysisbuffer.Svirp røret til at blande, og straks placere den på is. Inkuber alle tre rør i et vandbad ved 30 grader Celsius i et minut. Efter dette, tilsættes 13.5 mikroliter af PNBM på 12 milligram per milliliter til hvert rør.Inverter rørene for at blande prøverne og inkuber prøverne ved stuetemperatur i en time. Mens prøverne inkuberes, skal du mærke hver af kolonnerne for den prøve, der skal indlæses, som vist her. Forbered kolonnerne ved at vende hver kolonne flere gange for at resuspendere Sephadex G-25 harpiksen i lagerbufferen.Fastgør hver kolonne til en klemme stativ, og lad den sidde uforstyrret i cirka fem minutter for at lade harpiksen falde til ro. Dernæst skal du placere et rør under den nederste åbning af hver kolonne. Fjern hætter fra både toppen og bunden af hver kolonne, så opbevaring buffer til at løbe ind i rørene ved tyngdekraften.Når opbevaringsbufferen er opbrugt, tilsættes ca. 2,7 milliliter Lysis Buffer til hver kolonne for at bringe dem i ligevægt, og sørg for at indsamle og kassere strømmen igennem. Gentag denne proces med at tilføje Lysis Buffer og kassere flowet igennem, tre gange. For at begynde skal du indlæse hvert eksempel i den respektive kolonne.Opsaml og kassér strømmen igennem. Tilføj 420 mikroliter lysis buffer til hver kolonne for at vaske prøverne. Lad Lysis Buffer-filteret gennem kolonnen indsamle og kassere flowet igennem.Anbring derefter rørene på plads under hver kolonne til prøvesamling. Der tilsættes 500 mikroliter Lysis Buffer til hver kolonne for at få prøverne. Saml strømmen igennem, som nu indeholder en beriget population af thiophosphorylated og alkylerede CK2 substrater i kinase reaktion.GTPgammas eneste reaktion vil indeholde substrater thiophosphorylated og alkylerede af enhver endogen CK2 til stede. PNMB's eneste reaktion vil indeholde baggrundsallolaterede proteiner. Fjern 80 mikroliter fra hver Elution som en Elution Input Control prøve.Dernæst opdele hver prøve i to rør, der hver indeholder 200 mikroliter. Mærk hvert af rørene til at være enten anti-thiophosphat ester eller immunglobulin G, som vist her. Der tilsættes 2,8 mikrogram anti-thiophosphatesterantistof til hvert af anti-thiophosphatesterrørene.Der tilsættes 2,8 mikrogram Isotypekontrolantistof til hvert af IGG-rørene. Derefter placere rørene på en rotator ved fire grader Celsius i to timer. I løbet af de sidste 15 minutter af prøveinkubationen skal du bruge et rent barberblad til at skære enden af en P200-pipettespids for at øge målerstørrelsen.Umiddelbart før brug, kort vortex opbevaringsrøret indeholder agarose perler. Ved hjælp af den afskårne pipettespids overføres 100 mikroliter af perlerne gylle pr. immunudsættelse til et nyt 1,7 milliliter mikrocentrifugerør. Det er vigtigt at vortex perlerne før hver overførsel for at forhindre perler i at bosætte sig.Centrifuge rørene ved 17, 500 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i et minut. Fjern og kassér supernatanten. Resuspend perlerne ved at tilføje 200 mikroliter lysis buffer og kort vortexing at blande.Gentag denne proces med centrifugering og vask af perlerne tre gange. Efter den endelige vask, placere perlerne på isen, indtil klar til at fortsætte. Når prøverne er færdige med at inkubere, centrifugeres de ved 17, 500 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i tre minutter.Derefter overføres 200 mikroliter af hver prøve til rørene, der indeholder de vaskede perler. Placer rørene på en rotator ved fire grader Celsius i en time. Dernæst centrifuge rør på 17, 500 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i et minut.Fjern 40 mikroliter fra hver supernatant for at gemme som en udtyndingskontrol. Fjern og kassér resten af supernatanten, pas på ikke at forstyrre perlerne. Prøverne vaskes ved at tilsætte 200 mikroliter lysisbuffer til hver og vortexing kort.Centrifuge ved 17, 500 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i et minut, kassere supernatant. Gentag denne vask og centrifugering proces tre gange at passe på ikke forstyrre perlerne. Derefter tilsættes 50 mikroliter 2X prøvebuffer til hver prøve, der indeholder perler.For alle andre prøver, som omfatter inputkontrol, Elution-inputkontroller og udtømningskontroller, skal der tilføjes 8 mikroliter 6X-prøvebuffer. Pipette hvert rør op og ned for at blande med undtagelse af rør, der indeholder perler, og varme alle prøver ved 95 grader Celsius i fem minutter, før du fortsætter med SDS-PAGE. For at vurdere, om immunoprecipationen var vellykket, køres 25 til 30 mikroliter af hver prøve, der blev unddraget fra perler på en separat 12,5% polyacryamid gel.Plette hver gel med Coomassie Blue for at visualisere berigede proteiner fra forskellige stadier af forsøgsprotokollen. Ved hjælp af nye, rene barberblade, omhyggeligt punktafgifter eventuelle unikke bånd til stede i kinase reaktion anti-thiophosphat ester IP Lane samtidig gøre opmærksom på deres omtrentlige molekylære vægte. Der skal anvendes et nyt barberblad til hvert unikt bånd.Det underliggende grundlag for denne teknik er denne teknik er den usædvanlige evne til CK2 at bruge GTP til fosforyl gruppe overførsel. Tilsætning af eksogen CK2 holoenzym sammen med GTP analog, GTPgammaS, til en celle lysat, resulterer i en thiophosphorylation af endogene CK2 substrater. Efterfølgende behandling af lysatet med det alkylerende reagens p-Nitrobenzyl mesylat genererer thiophosphatester moiety på disse specifikke substratproteiner, som derefter kan immunudløseres ved hjælp af et anti-thiophosphatester-antistof og i sidste ende identificeres ved massespektrometri.I de repræsentative positive resultater vist her, CK2 afhængige, thiophosphorylation og efterfølgende alkylation var vellykket. Som forventet observeres der kun et forstærket anti-thiophosphat ester-signal fra western blotting i den vognbane, der indeholder den komplette kinasereaktion, og ikke kun i GTPgammaS- og PNMB-behandlede prøver. En Coomassie Blue farves gel af immunoprecipiterede og hentydede proteiner, også vise et positivt resultat.Da flere unikke bånd kun er tydelige i den anti-thiophosphate ester IP Lane, hvor lysatet blev inkuberet med eksogen CK2 og GTPgammaS. Det markerede bånd fjernes derefter fra gelen og indsendes til proteinidentifikation ved massespektrometri. Efter denne procedure skal formodede CK2-substrater, der er identificeret ved en massespektrometri, valideres ved hjælp af en yderligere fremgangsmåde, f.eks.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse Metode til High-throughput Identifikation af proteiner Samspil med en Nuclear Cofactor Brug LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...