Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie van de Commonwealth universele onderzoek verbetering van het ministerie van volksgezondheid van Pennsylvania naar T.I.S.

Opmerking: Zorg ervoor dat de benodigde materialen beschikbaar en goed voorbereid zijn (Zie Tabel van materialen).
1. voorbereiding
<ol><li>Mechanisch lyse weefsel monster (1-2 mg van weefsel in 100 µL van lysis buffer, tabel 1) of gekweekte cellen (10 cm plaat die is 80-90% heuvels in 350 µL van lysis-buffermengsel), met als doel om te verzamelen van een totaal van 900 µL van monster voor het experiment. Merk op dat dit volume in lichte overmaat is van w...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Hier beschrijven we een relatief eenvoudige biochemische methode voor het identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster. De kritische stappen van dit protocol zijn gebaseerd op de ongewone enzymatische eigenschappen van CK2 en bevatten CK2-afhankelijke thiophosphorylation van specifieke substraat eiwitten met behulp van GTPγS en hun latere immunoprecipitation en identificatie. Met deze resultaten hebben wij het nut en de veelzijdigheid van deze aanpak aangetoond zoa...

Eiwit kinases zijn belangrijke componenten voor signaaltransductie cascades. Fosforylering van substraat eiwitten door deze enzymen lokt biologische reacties die kritieke gebeurtenissen controleren celdeling, metabolisme en differentiatie, o.a. regelen. CK2 is een acidophilic, overal die zich uiten serine/threonine kinase dat is geconserveerd uit gist bij de mens en dat speelt belangrijke rol in veel cellulaire processen variërend van transcriptionele verordening tot celcyclus aan apoptosis1 ,2,3. Het enzym is een heterotetramer samengesteld uit twee katalytische α (of α') subeenheden en twee regelgevende β-subunits4. Naast het feit dat zeer pleiotropic, vertoont CK2 twee andere ongebruikelijke kenmerken die haar analyse bemoeilijken, namelijk constitutieve activiteit5 en dubbele co substraat specificiteit6. Deze laatste eigenschap schenkt CK2 met de mogelijkheid om gebruik van GTP evenals ATP voor fosforylering van eiwitten van het substraat.
Genetische schrapping van de katalytische of regelgevende subeenheden van CK2 in muizen resulteert in embryonale letaliteit die aangeeft dat het een cruciale rol tijdens het ontwikkelen en organogenese7,8 speelt. CK2 is ook overexpressie in verschillende soorten kanker en vormt aldus een veelbelovend therapeutisch doel9,10,11. Inderdaad, specifieke remmers dat doel CK2 kinaseactiviteit momenteel onderzochte voor dit doel12,13,14. Terwijl remming van CK2 een haalbare optie is, gezien het pleiotropic karakter, een alternatief en misschien meer rationele benadering zou moeten richten op kritische CK2 substraten die ten grondslag liggen aan de voortgang van bepaalde kankers. Daarom zou de uitvoerige identificatie en karakterisering van CK2 substraat eiwitten aanzienlijk voordeel voor het ophelderen van de specifieke functie (s) van deze kinase binnen een bepaald weefsel of tumor type.
Hier beschrijven we een veelzijdige biochemische methode voor het identificeren van CK2 substraten uit een complexe biologische monster zoals een cel of een weefsel lysate. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de dubbele co substraat van CK2 door gebruik van de GTP analoge GTPγS (calciumguanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) die andere endogene kinases niet kunnen gebruiken. Hierdoor kunnen effectief de kinase "label" haar substraten binnen dit voorbeeld voor latere isolatie en identificatie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

De studie van kinase-substraat relaties is essentieel voor een compleet begrip van de functies van deze enzymen en hun downstream doelen in zowel fysiologische en pathologische staten krijgen. CK2 is een evolutionair geconserveerde serine/threonine kinase met een groeiende lijst van honderden substraten die betrokken zijn bij meerdere cellulaire processen. Wegens zijn pleiotropic eigenschappen, is identificatie en karakterisering van een uitgebreide set van CK2 substraten bijzonder uitdagende en blijft een hindernis in de studie van dit belangrijke enzym. Om aan deze uitdaging, hebben we een veelzijdige experimentele strategie waarmee de gerichte verrijking en identificatie van vermeende CK2 substraten bedacht. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de unieke dual co substraat van CK2 rekening houdend met de specifieke thiophosphorylation van de substraten in een cel of een weefsel lysate. Vervolgens worden deze eiwitten substraat Gealkyleerde, immunoprecipitated, en geïdentificeerd door vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Wij hebben vroeger deze aanpak succesvol identificeren CK2 substraten van Drosophila eierstokken en hier verlengen we de toepassing van dit protocol aan menselijke glioblastoma cellen, ter illustratie van het aanpassingsvermogen van deze methode te onderzoeken de Biologische rol van deze kinase in verscheidene modelorganismen en experimentele systemen.

Een schematisch diagram van de experimentele procedure wordt gegeven in Figuur 1. De onderliggende basis van de techniek is het ongebruikelijk vermogen van CK2 GTP eigenschappenstijl gebondenkleurstof groep overdracht. Toevoeging van exogene CK2 holoenzyme samen met de GTP analoge, GTPγS, naar een cel lysate resulteert in thiophosphorylation van endogene CK2 substraten. Latere behandeling van de lysate met de alkylerend reagens p- nitrobenzyl mesyla...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de specifieke etikettering en daaropvolgende verrijking en identificatie van endogene CK2 substraten uit een complex biologisch monster zoals een cel of weefsellysaat. Deze methode kan worden toegepast op elk celtype of weefsel. Aldus het vergemakkelijken, de studie van CK2 in diverse biologische contexten.Het aantonen van de procedure zal John Chojnowski, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, mechanisch lyse het weefsel monster of gekweekte cellen zoals beschreven in het tekstprotocol om een totaal van 900 microliter van het monster te verzamelen. Centrifuge bij 17, 500 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende drie minuten.Breng vervolgens 270 microliter van de supernatant over naar elk van de drie nieuwe 1,7 milliliter microcentrifugebuizen. Verwijder 40 microliter van de resterende supernatant te worden gebruikt als een input control, en breng het naar een nieuwe buis. Leg alle monsters op ijs.Ten eerste, label elk van de drie monsterbuizen zoals hier getoond. Voeg aan de Kinase Reaction-buis 2,7 microliter CK2 en 2,7 microliter van 2,5 millimolar GTPgammaS toe. Veeg de buis te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs.Voeg aan de GTPgammaS-buis 2,7 microliter van 2,5 millimolar GTPgammaS en 2,7 microliter Lysis Buffer toe. Veeg deze buis om te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs. Voeg aan de PNBM Only tube 5,4 microliter Lysis Buffer toe.Veeg de buis te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs. Broed alle drie de buizen in een waterbad op 30 graden Celsius gedurende een minuut. Voeg hierna 13,5 microliter PNBM met 12 milligram per milliliter aan elke buis toe.Keer de buizen om de monsters te mengen en de monsters een uur lang op kamertemperatuur uit te broeden. Terwijl de monsters uitbroeden, labelt u elk van de kolommen voor het te laden monster, zoals hier wordt weergegeven. Bereid de kolommen voor door elke kolom meerdere keren om te keren om de Sephadex G-25-hars in de opslagbuffer opnieuw op te stellen.Bevestig elke kolom aan een klemstandaard en laat deze ongeveer vijf minuten ongestoord zitten om de hars te laten bezinken. Plaats vervolgens een buis onder de onderste opening van elke kolom. Verwijder de doppen van zowel de boven- als de onderkant van elke kolom, zodat de opslagbuffer door de zwaartekracht in de buizen kan uitlekken.Zodra de opslagbuffer is uitgeput, voegt u ongeveer 2,7 milliliter Lysis Buffer toe aan elke kolom om ze te equiliben, zodat u de stroom door verzamelt en weggooit. Herhaal dit proces van het toevoegen van Lysis Buffer en het verwijderen van de stroom door, drie keer. Laad om te beginnen elk monster in de respectievelijke kolom.Verzamel en gooi de stroom erdoor weg. Voeg 420 microliter lysebuffer toe aan elke kolom om de monsters te wassen. Laat de Lysis Buffer door de kolom filteren en verzamel en verwijder de stroom erdoorheen.Plaats vervolgens buizen in positie onder elke kolom voor monsterverzameling. Voeg 500 microliters lysisbuffer toe aan elke kolom om de monsters te ontlopen. Verzamel de stroom door, die nu een verrijkte populatie van thiophosforylated en alkylated CK2 substraten in de kinase reactie bevat.De gtpgammas enige reactie bevat substraatjes thiophoshorylated en alkylated door een endogene CK2 aanwezig. De PNMB enige reactie zal achtergrond alkylated eiwitten bevatten. Verwijder 80 microliter uit elke Elution als een Elution Input Control monster.Splits vervolgens elk monster in twee buizen die elk 200 microliters bevatten. Label elk van de buizen als anti-thiofofosfaat ester of immunoglobuline G, zoals hier getoond. Voeg 2,8 microgram anti-thiofofosfaat ester antilichaam toe aan elk van de anti-thiofofosfaat ester buizen.Voeg 2,8 microgram Isotype Control-antilichaam toe aan elk van de IGG-buizen. Plaats vervolgens de buizen op een rotator op vier graden Celsius gedurende twee uur. Gebruik tijdens de laatste 15 minuten van de monster incubatie een schoon scheermesje om het uiteinde van een P200 pipettip af te snijden om de maatgrootte te vergroten.Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, kort vortex de opslagbuis met de agarose kralen. Breng met behulp van de gesneden pipetpunt 100 microliter van de kralen slurry per immunoprecipitatie over naar een nieuwe 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Het is belangrijk om de kralen voor elke overdracht te laten bezinken.Centrifugeren de buizen op 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius voor een minuut. Verwijder en gooi de supernatant weg. Resuspend de kralen door het toevoegen van 200 microliters van Lysis Buffer en kort vortexing te mengen.Herhaal dit proces van centrifugeren en het wassen van de kralen drie keer. Na de laatste wasbeurt, plaats de kralen op ijs tot klaar om verder te gaan. Wanneer de monsters klaar zijn met uitbroeden, centrifugeren ze op 17, 500 keer de zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende drie minuten.Breng vervolgens 200 microliter van elk monster over naar de buizen met de gewassen kralen. Plaats de buizen op een rotator op vier graden Celsius gedurende een uur. Vervolgens centrifugeren de buizen op 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius voor een minuut.Verwijder 40 microliter uit elke supernatant om op te slaan als een uitputtingscontrole. Verwijder en gooi de rest van de supernatant weg, voorzichtig om de kralen niet te storen. Was de monsters door het toevoegen van 200 microliters van Lysis Buffer aan elk en vortexing kort.Centrifuge bij 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende een minuut, het weggooien van de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces drie keer en zorg ervoor dat de kralen niet storen. Voeg hierna 50 microliter 2x monsterbuffer toe aan elk monster met kralen.Voor alle andere monsters, waaronder het invoerbeheer, de Elution-invoerbesturingselementen en de uitputtingsbesturingselementen, voegt u 8 microliter 6x-voorbeeldbuffer toe. Pipette elke buis op en neer te mengen met uitzondering van buizen met kralen, en verwarm alle monsters op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten alvorens verder te gaan met SDS-PAGE. Om te beoordelen of de immunoprecipitatie succesvol was, voer 25 tot 30 microliter van elk monster dat werd ontweken van kralen op een aparte 12,5%polyacrylamide gel.Vlek elke gel met Coomassie Blue om verrijkte eiwitten uit verschillende stadia van het experimentele protocol te visualiseren. Met behulp van nieuwe, schone scheermesjes, zorgvuldig accijnzen alle unieke banden aanwezig in de kinase reactie anti-thiophosfaat ester IP Lane, terwijl het noteren van hun geschatte moleculaire gewichten. Voor elke unieke band moet een nieuw scheermesje worden gebruikt.De onderliggende basis van deze techniek is deze techniek is het ongebruikelijke vermogen van CK2 om GTP te gebruiken voor overdracht van fosforylgroepen. Toevoeging van exogene CK2 holo-enzym samen met de GTP analoge, GTPgammaS, om een cellysaat, resulteert in een thiophosphorylation van endogene CK2 substraten. Latere behandeling van het lysaat met het alkylating reagens p-Nitrobenzyl mesylaat genereert thiofosfaten ester moiety op deze specifieke substraateiwitten, die vervolgens kunnen worden gepubsmenteerd met behulp van een anti-thiofosfate esterantilichaam en uiteindelijk geïdentificeerd door Mass spectrometrie.In de representatieve positieve resultaten hier getoond, CK2 afhankelijk, thiophosphorylation en daaropvolgende alkylation waren succesvol. Zoals verwacht, een verbeterde anti-thiofosfate ester signaal door westerse blotting wordt waargenomen alleen in de baan met de volledige kinase reactie, en niet in de GTPgammaS alleen en PNMB alleen behandeld monsters. Een Coomassie Blue gekleurde gel van de immuunprecipiteerde en gezinspeelde eiwitten, tonen ook een positief resultaat.Zoals meerdere unieke banden zijn alleen zichtbaar in de anti-thiofosfaten ester IP Lane, waarin het lysaat werd geïncubeerd met exogene CK2 en GTPgammaS. De gemarkeerde band wordt vervolgens uit de gel verwijderd en door massaspectrometrie voor eiwitidentificatie ingediend. Volgens deze procedure moeten vermeende CK2-substraten die door een massaspectrometrie zijn geïdentificeerd, worden gevalideerd met behulp van een aanvullende benadering, zoals door CK2-afhankelijke fosforylatie in een standaard in vitro kinasetest.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...