Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de valorisation de recherche universelle du Commonwealth depuis le ministère de la santé de Pennsylvanie à sit

Remarque : Assurez-vous que le matériel requis est disponibles et correctement préparé (voir Table des matières).
1. préparation
<ol><li>Lyse mécaniquement échantillon de tissu (1-2 mg de tissu dans 100 µL de tampon de lyse, tableau 1) ou cultivé des cellules (plaque de 10 cm qui est confluente de 80 à 90 % dans 350 µL de tampon de lyse), l’objectif étant de recueillir un total de 900 µL de l’échantillon pour l’expérience. Notez que ce ...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode relativement simple et biochimique pour l’identification des substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex. Les étapes critiques du présent protocole sont basées sur les propriétés enzymatiques inhabituelles de CK2 et comprennent thiophosphorylation CK2 dépendant des protéines substrat spécifique à l’aide de GTPγS et leurs immunoprécipitation ultérieure et identification. Avec ces résultats, nous avons démontré l’utilité...

Protéines kinases sont des éléments clés des cascades de transduction de signal. La phosphorylation des protéines substrat de ces enzymes suscite des réactions biologiques qui régissent les événements critiques contrôlant la division cellulaire, métabolisme et la différenciation, entre autres. CK2 est une exprimée de façon ubiquitaire, acidophiles sérine/thréonine kinase qui est conservé de la levure à l’homme et qui joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, allant de la régulation transcriptionnelle de progression du cycle cellulaire à l’apoptose1 ,2,3. L’enzyme est un hétérotétramère composé de deux α catalytique (ou α') sous-unités et deux de sous-unités β réglementaire4. En plus d’être hautement pléiotrope, CK2 présente deux autres caractéristiques inhabituelles qui compliquent l’analyse, à savoir l’activité constitutive5 et co-substrat double spécificité6. Cette dernière propriété CK2, dote de la capacité d’utiliser GTP comme ATP pour la phosphorylation de protéines substrats.
Délétion génétique des sous-unités catalytiques ou réglementaires de CK2 chez la souris entraîne la létalité embryonnaire indiquant qu’elle joue un rôle crucial lors du développement et de l’organogénèse7,8. CK2 est également surexprimé dans plusieurs types de cancer et représente donc un prometteur cible thérapeutique9,10,11. En effet, des inhibiteurs spécifiques cette activité cible de la kinase CK2 sont actuellement sous enquête pour ce but12,13,14. Alors que l’inhibition de la CK2 est une option viable, étant donnée sa nature pléiotropique, alternative et peut-être une approche plus rationnelle consisterait à cibler des substrats CK2 critiques qui sous-tendent la progression de certains cancers. Par conséquent, l’identification complète et la caractérisation de protéines substrats CK2 serait un bénéfice notable pour élucider l’ou les fonctions spécifique de cette kinase dans un type particulier de tissu ou une tumeur.
Nous décrivons ici une méthode biochimique polyvalente pour l’identification des substrats CK2 auprès d’un échantillon biologique complex comme une cellule ou un tissu lysat. Ce protocole tire parti de la spécificité du double co-substrat de CK2 par utilisation de l’analogue de GTP GTPγS (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) qui ne peuvent pas utiliser les autres kinases endogènes. Cela permet effectivement de la kinase à « étiqueter » ses substrats au sein de cet échantillon subséquentes d’isolement et d’identification.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

L’étude des relations de kinase-substrat est essentielle pour avoir une compréhension complète des fonctions de ces enzymes et leurs cibles en aval dans les États physiologiques et pathologiques. CK2 est une kinase de sérine/thréonine évolutivement conservés avec une liste croissante de centaines de substrats impliqués dans plusieurs processus cellulaires. En raison de ses propriétés pléiotropes, identifier et caractériser un ensemble complet de substrats CK2 a été particulièrement difficile et reste un obstacle à l’étude de cette enzyme importante. Pour relever ce défi, nous avons élaboré une stratégie expérimentale polyvalente qui permet l’enrichissement ciblée et identification des substrats de CK2 putatifs. Ce protocole tire parti de la spécificité unique double co-substrat de CK2 permettant thiophosphorylation spécifique de ses substrats dans une cellule ou un tissu lysat. Ces substrats protéiques sont ensuite alkylées, immunoprécipitée et identifié par liquide chromatography/tandem la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Nous avons déjà utilisé cette approche pour identifier avec succès des substrats CK2 de Drosophila ovaires et ici nous étendre l’application du présent protocole aux cellules de glioblastome humain, illustrant la capacité d’adaptation de cette méthode pour étudier la rôles biologiques de cette kinase dans divers organismes modèles et systèmes expérimentaux.

Un diagramme schématique de la procédure expérimentale est fourni à la Figure 1. Fondement de la technique est la capacité inhabituelle de CK2 utiliser GTP pour le transfert du groupe phosphoryle. Addition d’exogène CK2 holoenzyme avec l’analogue de GTP, GTPγS, d’un lysat cellulaire conduit à thiophosphorylation de substrats endogènes de CK2. Traitement ultérieur du lysat avec l’alkylants réactif p- nitrobenzyle mésylate (PNBM) g?...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

L’objectif de ce protocole est à étiqueter, enrichir et identifier les substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex tel qu’un lysat cellulaire ou l’homogénat tissulaire. Cette méthode s’appuie sur des aspects uniques de la CK2 biologie à cet effet.

Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ce protocole permet l’étiquetage spécifique et l’enrichissement et l’identification ultérieurs des substrats endogènes CK2 à partir d’un échantillon biologique complexe tel qu’un lysate cellulaire ou tissulaire. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule ou tissu. Facilitant ainsi l’étude du CK2 dans divers contextes biologiques.John Chojnowski, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, lyse mécaniquement l’échantillon de tissu ou les cellules de culture comme décrit dans le protocole de texte pour recueillir un total de 900 microlitres de l’échantillon. Centrifugeuse à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, transférez 270 microlitres du supernatant à chacun des trois nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Retirez 40 microlitres du supernatant restant à utiliser comme contrôle d’entrée et transférez-les dans un nouveau tube. Placez tous les échantillons sur la glace.Tout d’abord, étiquetez chacun des trois tubes d’échantillon comme indiqué ici. Au tube de réaction Kinase, ajouter 2,7 microlitres de CK2 et 2,7 microlitres de GTPgammaS de 2,5 millimlaires. Feuilleter le tube pour le mélanger et le placer immédiatement sur la glace.Pour le tube GTPgammaS seulement, ajouter 2,7 microlitres de 2,5 millimolar GTPgammaS, et 2,7 microlitres de Lysis Buffer. Feuilletez ce tube pour le mélanger et placez-le immédiatement sur la glace. Au tube PNBM Only ajouter 5,4 microlitres de Lysis Buffer.Feuilleter le tube pour le mélanger et le placer immédiatement sur la glace. Incuber les trois tubes dans un bain d’eau à 30 degrés Celsius pendant une minute. Après cela, ajouter 13,5 microlitres de PNBM à 12 milligrammes par millilitre à chaque tube.Inverser les tubes pour mélanger les échantillons et incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure. Pendant que les échantillons couvent, étiquetez chacune des colonnes pour que l’échantillon soit chargé, comme indiqué ici. Préparez les colonnes en inversant chaque colonne plusieurs fois pour résuspendre la résine Sephadex G-25 dans le tampon de stockage.Attachez chaque colonne à un support de pince, et laissez-la reposer intacte pendant environ cinq minutes pour laisser la résine se déposer. Ensuite, placez un tube sous l’ouverture inférieure de chaque colonne. Retirez les bouchons du haut et du bas de chaque colonne, pour permettre au tampon de stockage de s’écouler dans les tubes par gravité.Une fois le tampon de stockage épuisé, ajoutez environ 2,7 millilitres de tampon de lyse à chaque colonne pour les équilibrer, en vous assurant de recueillir et de jeter le flux à travers. Répétez ce processus d’ajout de tampon de lyse et de rejet du flux à travers, trois fois. Pour commencer, chargez chaque échantillon dans sa colonne respective.Recueillir et jeter le flux à travers. Ajouter 420 microlitres de tampon de lyse à chaque colonne pour laver les échantillons. Laissez le tampon de lyse filtrer à travers la colonne, et de recueillir et de jeter le flux à travers.Ensuite, placez les tubes en position sous chaque colonne pour la collecte d’échantillons. Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse à chaque colonne pour élucider les échantillons. Recueillir le flux à travers, qui contient maintenant une population enrichie de substrats CK2 thiophosphorylatés et alcalinés dans la réaction de kinase.La réaction GTPgammaS seulement contiendra des substrats thiophosphorylatés et aldyllés par n’importe quel CK2 endogène présent. La seule réaction du PNMB contiendra des protéines alcalinées de fond. Retirez 80 microlitres de chaque Elution sous forme d’échantillon de contrôle d’entrée Elution.Ensuite, divisez chaque échantillon en deux tubes qui contiennent chacun 200 microlitres. Étiquetez chacun des tubes comme étant soit anti-thiophosphate ester ou immunoglobuline G, comme indiqué ici. Ajouter 2,8 microgrammes d’anticorps anti thiophosphate ester à chacun des tubes d’ester anti thiophosphate.Ajouter 2,8 microgrammes d’anticorps Isotype Control à chacun des tubes IGG. Placez ensuite les tubes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Au cours des 15 dernières minutes de l’incubation de l’échantillon, utilisez une lame de rasoir propre pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette P200 pour augmenter la taille de la jauge.Immédiatement avant l’utilisation, vortex brièvement le tube de stockage contenant les perles d’agarose. À l’aide de la pointe de pipette coupée, transférer 100 microlitres de boue de perles par immunoprécipitation vers un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Il est important de vortex les perles avant chaque transfert pour empêcher les perles de s’installer.Centrifuger les tubes à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer et jeter le surnatant. Resuspendez les perles en ajoutant 200 microlitres de Lysis Buffer et en vortexant brièvement pour mélanger.Répétez ce processus de centrifugeuse et de lavage des perles trois fois. Après le lavage final, déposer les perles sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à aller de l’avant. Lorsque les échantillons ont fini d’être incubés, centrifugez-les à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans les tubes contenant les perles lavées. Placez les tubes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifuger les tubes à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute.Retirez 40 microlitres de chaque supernatant pour économiser comme un contrôle d’épuisement. Retirer et jeter le reste du supernatant, en prenant soin de ne pas déranger les perles. Lavez les échantillons en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse à chacun et vortexing brièvement.Centrifugeuse à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute, rejetant le surnatant. Répétez ce processus de lavage et de centrifugation trois fois en prenant soin de ne pas déranger les perles. Après cela, ajouter 50 microlitres de tampon échantillon 2X à chaque échantillon contenant des perles.Pour tous les autres échantillons, qui incluent le contrôle des entrées, les contrôles d’entrée Elution et les contrôles d’épuisement, ajoutez 8 microlitres de tampon d’échantillon 6X. Pipette chaque tube de haut en bas pour mélanger à l’exception des tubes contenant des perles, et chauffer tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de procéder à SDS-PAGE. Pour évaluer si l’immunoprécipitation a été réussie, exécutez 25 à 30 microlitres de chaque échantillon qui ont été échappés des perles sur un gel distinct de polyacrylamide de 12,5%.Tacher chaque gel avec Coomassie Blue pour visualiser les protéines enrichies à partir de différentes étapes du protocole expérimental. À l’aide de nouvelles lames de rasoir propres, excisez soigneusement toutes les bandes uniques présentes dans la réaction kinase anti-thiophosphate ester IP Lane tout en prenant note de leur poids moléculaire approximatif. Une nouvelle lame de rasoir doit être utilisée pour chaque bande unique.La base sous-jacente de cette technique est cette technique est la capacité inhabituelle de CK2 d’utiliser GTP pour le transfert de groupe de phosphoryl. L’ajout de l’holoenzyme exogène de CK2 avec l’analogue de GTP, GTPgammaS, à un lysate de cellules, a comme conséquence une thiophosphorylation des substrats endogènes de CK2. Le traitement ultérieur du lysate avec le mésylate alkylating de réagent p-Nitrobenzyl génère l’ester moiety de thiophosphate sur ces protéines spécifiques de substrat, qui peuvent alors être immunopréciées utilisant un anticorps d’ester d’anti thiophosphate et finalement identifiés par spectrométrie de masse.Dans les résultats positifs représentatifs montrés ici, CK2 dépendant, thiophosphorylation et alkylation suivante ont été réussis. Comme prévu, un signal anti thiophosphate amélioré par ballonnement occidental n’est observé que dans la voie contenant la réaction complète de kinase, et non dans le GTPgammaS seulement et le PNMB n’a traité que des échantillons. Un gel taché bleu coomassie des protéines immunoprécipitées et faites allusion, démontrent également un résultat positif.Comme plusieurs bandes uniques ne sont évidentes que dans l’ester anti-thiophosphate IP Lane, dans lequel le lysate a été incubé avec CK2 exogène et GTPgammaS. La bande marquée est ensuite excisée du gel et soumise à l’identification des protéines par spectrométrie de masse. À la suite de cette procédure, les substrats CK2 putatifs identifiés par une spectrométrie de masse doivent être validés à l’aide d’une approche supplémentaire, par exemple par phosphorylation dépendante CK2 dans un essai standard de kinase in vitro.

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