Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss der Commonwealth Universal Forschung Verbesserung von Pennsylvania Department of Health, T.I.S unterstützt

Hinweis: Sicherstellen, dass die benötigten Materialien zur Verfügung und richtig vorbereitet sind (siehe Tabelle der Materialien).
1. Vorbereitung
<ol><li>Mechanisch lösen Gewebeprobe (1-2 mg Gewebe in 100 µL der Lyse Puffer, Tabelle 1) oder kultivierten Zellen (10 cm-Platte, die 80-90 % Zusammenfluss in 350 µL Lyse Puffer ist), mit dem Ziel, insgesamt 900 µL Probe für das Experiment zu sammeln. Beachten Sie, dass dieses Volumen in leichten Überschu...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine relativ einfache biochemische Methode zur Identifizierung Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe. Die entscheidenden Schritte dieses Protokolls basieren auf die ungewöhnlichen enzymatischen Eigenschaften von CK2 und beinhalten CK2-abhängige Thiophosphorylation von bestimmten Substrat Proteinen mit GTPγS und deren anschließende Immunopräzipitation und Identifikation. Mit diesen Ergebnissen haben wir den nutzen und die Vielseitigkeit dieses Ansatzes ge...

Proteinkinasen sind Schlüsselkomponenten der Transduktion Signalkaskaden. Phosphorylierung von Proteinen Substrat durch diese Enzyme entlockt biologische Reaktionen, die kritische Ereignisse, die Kontrolle der Zellteilung, Stoffwechsel und Differenzierung, unter anderem zu regulieren. CK2 ist ein ubiquitär ausgedrückt, acidophilen Serin/Threonin-Kinase, die ist von Hefe für den Menschen erhalten und spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen von transcriptional Regelung bis hin zu Zellzyklus Progression zu Apoptose1 ,2,3. Das Enzym ist ein Heterotetramer bestehend aus zwei katalytischen α (oder α') Untereinheiten und zwei regulatorischen β Untereinheiten4. Abgesehen davon, dass hoch pleiotrope, Exponate CK2 zwei andere ungewöhnlichen Eigenschaften, die ihre Analyse erschweren nämlich konstitutive Aktivität5 und dual Co Substrat Spezifität6. Diese letztere Eigenschaft verleiht CK2 mit der Fähigkeit, GTP sowie ATP für die Phosphorylierung von Proteinen Substrat verwenden.
Genetische Löschung der katalytischen oder regulatorischen Untereinheiten der CK2 bei Mäusen führt zu embryonalen Tödlichkeit darauf hinweist, dass es entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Organogenese7,8 spielt. CK2 ist auch in verschiedenen Arten von Krebs überexprimiert und stellt damit eine vielversprechende therapeutische Ziel9,10,11. In der Tat spezifische Inhibitoren dieses Ziel CK2-Kinase-Aktivität werden derzeit untersucht für diesen Zweck12,13,14. Während Hemmung der CK2 ist ein gangbarer Weg, angesichts seiner pleiotrope Natur, eine Alternative und rationaler Ansatz vielleicht wäre auf kritische CK2 Substrate, die das Fortschreiten bestimmter Krebsarten zugrunde liegen. Daher wäre die umfassende Identifizierung und Charakterisierung von CK2 Substrat Proteine von erheblichem Nutzen für die Aufklärung die spezifische Funktion(en) von dieser Kinase innerhalb eines bestimmten Gewebes oder Tumor-Typs.
Hier beschreiben wir eine vielseitige biochemische Methode zur Identifizierung CK2 Substrate aus einer komplexen biologischen Probe wie einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Dieses Protokoll nutzt die dual Co Substratspezifität der CK2 durch Verwendung der GTP-Analogons GTPγS (Guanosin-5'-[γ-thio]triphosphate), die anderen endogenen Kinasen verwenden können. Dadurch können effektiv die Kinase, "seine Substrate innerhalb dieses Beispiel für nachträgliche Isolierung und Identifizierung zu kennzeichnen".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Das Studium der Kinase-Substrat Beziehungen unbedingt ein vollständiges Verständnis der Funktionen von dieser Enzyme und ihre nachgelagerten Ziele in physiologische und pathologische Zustände zu gewinnen. CK2 ist ein evolutionär konservierte Serin/Threonin-Kinase mit einer wachsenden Liste von Hunderten von Substraten in mehreren zellulären Prozessen beteiligt. Aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaften ist zu identifizieren und zu charakterisieren ein umfassendes Set an CK2 Substrate besonders anspruchsvoll und bleibt eine Hürde in der Studie dieses wichtigen Enzyms. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine vielseitige experimentelle Strategie entwickelt, die es die gezielte Anreicherung und Identifizierung von vermeintlichen CK2 Substrate ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die einzigartige dual Co Substratspezifität der CK2 zulassend bestimmte Thiophosphorylation der Substrate in einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Diese Substrat Proteine werden im Anschluss alkyliert, Immunoprecipitated, und durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert. Wir haben früher dieser Ansatz erfolgreich CK2 Substrate von Drosophila Eierstöcken identifizieren und hier verlängern wir die Anwendung dieses Protokolls zu menschlichen Glioblastom-Zellen, illustrieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode zu untersuchen, die biologische Rollen dieser Kinase in verschiedenen Modellorganismen und experimentellen Systemen.

Eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die zugrunde liegende Basis der Technik ist die ungewöhnliche Fähigkeit der CK2, GTP für Phosphoryl-Gruppe Übertragung verwenden. Zugabe von exogenen CK2 Holoenzym sowie das GTP-Analogon, GTPγS, zu einer Zelle lysate führt zu Thiophosphorylation von endogenen CK2 Substraten. Nachbehandlung der lysate mit alkylierende Reagenz p- Nitrobenzyl-Mesylat (PN...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Dieses Protokoll ermöglicht die spezifische Kennzeichnung und anschließende Anreicherung und Identifizierung von endogenen CK2-Substraten aus einer komplexen biologischen Probe wie einem Zell- oder Gewebelysat. Diese Methode kann auf jeden Zelltyp oder jedes Gewebe angewendet werden. So erleichtern, die Untersuchung von CK2 in verschiedenen biologischen Kontexten.Demonstriert wird das Verfahren von John Chojnowski, einem Doktoranden aus meinem Labor. Zunächst wird die Gewebeprobe oder die kultivierten Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, mechanisch lysieren, um insgesamt 900 Mikroliter Probe zu sammeln. Zentrifuge bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für drei Minuten.Dann übertragen Sie 270 Mikroliter des Überstandes auf jeweils drei neue 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohre. Entfernen Sie 40 Mikroliter des verbleibenden Überstandes, der als Eingangssteuerung verwendet werden soll, und übertragen Sie ihn in ein neues Rohr. Legen Sie alle Proben auf Eis.Beschriften Sie zunächst jedes der drei Probenröhrchen, wie hier gezeigt. Zum Kinase-Reaktionsrohr 2,7 Mikroliter CK2 und 2,7 Mikroliter 2,5 Millimolar GTPgammaS hinzufügen. Streichen Sie die Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis.Zum GTPgammaS nur Rohr, fügen Sie 2,7 Mikroliter von 2,5 Millimolar GTPgammaS, und 2,7 Mikroliter Lysis Buffer. Streichen Sie diese Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis. Zum PNBM Only Tube 5,4 Mikroliter Lysis Buffer hinzufügen.Streichen Sie die Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis. Alle drei Röhren in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius für eine Minute inkubieren. Danach fügen Sie 13,5 Mikroliter PNBM bei 12 Milligramm pro Milliliter zu jeder Röhre hinzu.Invertieren Sie die Rohre, um die Proben zu mischen, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für eine Stunde. Während die Proben inkubiert werden, beschriften Sie jede der Spalten für das zu ladende Beispiel, wie hier gezeigt. Bereiten Sie die Spalten vor, indem Sie jede Spalte mehrmals umkehren, um das Sephadex G-25-Harz im Speicherpuffer wieder auszusetzen.Befestigen Sie jede Säule an einem Klemmständer, und lassen Sie sie etwa fünf Minuten ungestört sitzen, damit sich das Harz absetzen kann. Platzieren Sie als Nächstes eine Röhre unter der unteren Öffnung jeder Spalte. Entfernen Sie die Kappen sowohl von der Ober- als auch vom Unterseite jeder Säule, damit der Speicherpuffer durch Schwerkraft in die Rohre abfließen kann.Sobald der Speicherpuffer erschöpft ist, fügen Sie jeder Spalte etwa 2,7 Milliliter Lysispuffer hinzu, um sie auszulagern, und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss gesammelt und verworfen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie Lysis Buffer hinzufügen und den Durchfluss dreimal verwerfen. Laden Sie zunächst jedes Beispiel in die jeweilige Spalte.Sammeln und verwerfen Sie den Fluss durch. Fügen Sie 420 Mikroliter Lysisbuffer zu jeder Spalte hinzu, um die Proben zu waschen. Lassen Sie den Lysispuffer durch die Spalte filtern, und sammeln und verwerfen Sie den Flow durch.Platzieren Sie dann Die Rohre unter jeder Spalte für die Probenentnahme. Fügen Sie 500 Mikroliter Lysisbuffer zu jeder Spalte hinzu, um die Proben zu löschen. Sammeln Sie den Durchfluss, der nun eine angereicherte Population von thiophosphorylierten und alkylierten CK2-Substraten in der Kinase-Reaktion enthält.Die gtPgammaS-Reaktion enthält Substrate, die von jedem endogenen CK2-Wert thiophosphoryliert und alkyliert werden. Die reine PNMB-Reaktion enthält alkylierte Hintergrundproteine. Entfernen Sie 80 Mikroliter aus jeder Elution als Elution Input Control Probe.Als nächstes teilen Sie jede Probe in zwei Röhren auf, die jeweils 200 Mikroliter enthalten. Beschriften Sie jede der Röhren als Antithiophosphatester oder Immunglobulin G, wie hier gezeigt. Fügen Sie 2,8 Mikrogramm Antithiophosphatester-Antikörper zu jedem der Antithiophosphat-Ester-Röhren hinzu.Fügen Sie jedem der IGG-Röhren 2,8 Mikrogramm Isotype Control Antikörper hinzu. Dann legen Sie die Rohre auf einen Rotator bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Während der letzten 15 Minuten der Probeninkubation verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um das Ende einer P200 Pipettenspitze abzuschneiden, um die Spurweite zu erhöhen.Unmittelbar vor der Verwendung das Speicherrohr mit den Agaroseperlen kurz wirbeln. Mit der geschnittenen Pipettenspitze 100 Mikroliter der Perlenschlämme pro Immunpräzipitation auf ein neues 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Es ist wichtig, die Perlen vor jedem Transfer zu wirbeln, um zu verhindern, dass sich Perlen absetzen.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie 200 Mikroliter Lysis Buffer hinzufügen und kurz wirbeln, um sie zu mischen.Wiederholen Sie diesen Prozess des Zentrifugierens und Waschens der Perlen dreimal. Nach der letzten Wäsche die Perlen auf Eis legen, bis sie fertig sind. Wenn die Proben die Inkubation beendet haben, zentrifugieren Sie sie bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für drei Minuten.Dann 200 Mikroliter jeder Probe in die Röhrchen mit den gewaschenen Perlen geben. Legen Sie die Rohre eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Als nächstes zentrieren Sie die Rohre bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute.Entfernen Sie 40 Mikroliter von jedem Überstand, um ihn als Erschöpfungskontrolle zu speichern. Entfernen und entsorgen Sie den Rest des Überstandes, wobei Sie darauf achten, die Perlen nicht zu stören. Waschen Sie die Proben, indem Sie jeweils 200 Mikroliter Lysisbuffer hinzufügen und kurz wirbeln.Zentrifuge bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute, den Überstand zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugationsprozess dreimal mit Vorsicht, um die Perlen nicht zu stören. Danach fügen Sie 50 Mikroliter 2X Probenpuffer zu jeder Probe hinzu, die Perlen enthält.Für alle anderen Samples, zu denen das Eingabesteuerelement, die Elution Input Controls und die Depletion Controls gehören, fügen Sie 8 Mikroliter 6X Sample Buffer hinzu. Pipette jede Röhre nach oben und unten mit Ausnahme von Rohren mit Perlen zu mischen, und erhitzen Sie alle Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie mit SDS-PAGE fortfahren. Um zu beurteilen, ob die Immunpräzipitation erfolgreich war, führen Sie 25 bis 30 Mikroliter jeder Probe durch, die perlend auf einem separaten 12,5%Polyacrylamid-Gel entging.Färben Sie jedes Gel mit Coomassie Blue, um angereicherte Proteine aus verschiedenen Stadien des experimentellen Protokolls zu visualisieren. Mit neuen, sauberen Rasierklingen, sorgfältig verbrauchen alle einzigartigen Bänder in der Kinase-Reaktion Anti-Thiophosphat-Ester IP Lane vorhanden, während sie ihre ungefähren Molekulargewichte beachten. Für jedes einzelne Band sollte eine neue Rasierklinge verwendet werden.Die Zugrundeliegende dieser Technik ist diese Technik die ungewöhnliche Fähigkeit von CK2, GTP für phosphorylgruppentransfer zu verwenden. Die Zugabe von exogenem CK2-Holoenzym zusammen mit dem GTP-Analog, GTPgammaS, zu einem Zelllysat führt zu einer Thiophosphorylierung endogener CK2-Substrate. Die nachfolgende Behandlung des Lysats mit dem Alkylierungsreagenz p-Nitrobenzyl-Mesylat erzeugt Thiophosphatester-Moiety auf diesen spezifischen Substratproteinen, die dann mit einem Antithiophosphatester-Antikörper immunpräzipiert und schließlich durch Massenspektrometrie identifiziert werden können.In den hier gezeigten repräsentativen positiven Ergebnissen waren CK2-abhängige Thiophosphorylierung und anschließende Alkylierung erfolgreich. Wie erwartet wird ein verbessertes Antithiophosphat-Ester-Signal durch Western Blotting nur in der Spur beobachtet, die die vollständige Kinase-Reaktion enthält, und nicht nur in den GTPgammaS- und PNMB-Proben. Ein Coomassie Blue-Gefärbtgel der immunpräzipierten und angedeuteten Proteine weist ebenfalls ein positives Ergebnis auf.Da mehrere einzigartige Bänder nur in der Antithiophosphat-Ester-IP-Lane zu erkennen sind, in der das Lysat mit exogenen CK2 und GTPgammaS inkubiert wurde. Das markierte Band wird dann aus dem Gel entfernt und zur Proteinidentifikation mittels Massenspektrometrie eingereicht. Nach diesem Verfahren müssen vermeintliche CK2-Substrate, die durch eine Massenspektrometrie identifiziert werden, mit einem zusätzlichen Ansatz validiert werden, z. B. durch CK2-abhängige Phosphorylierung in einem Standard-In-vitro-Kinase-Assay.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Forschung

Biochemie

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...