Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק שיפור המחקר אוניברסלי קהיליה מחלקת פנסילבניה הבריאות T.I.S.

הערה: ודא כי החומרים הדרושים הם זמינים הוכנו כראוי (ראה טבלה של חומרים).
1. הכנה
<ol><li>מכנית lyse דגימת הרקמות (1-2 מ ג של רקמות µL 100 פירוק מאגר, טבלה 1) או תרבותי תאים (10 ס מ זה 80-90% confluent ב µL 350 מאגר פירוק), לוחית עם המטרה היא לאסוף סכום של 900 µL מדגם לניסוי. שימו לב כי נפ...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

כאן, אנו מתארים שיטה הביוכימי פשוט יחסית לזיהוי סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיות מורכבות. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מבוססים על מאפייני אנזימטי יוצא דופן CK2 וכוללים CK2 תלוית thiophosphorylation של חלבונים ספציפיים המצע באמצעות GTPוγS ו immunoprecipitation הבאים וזיהוי שלהם. עם התוצאות האלה, ה...

חלבונים kinases הם רכיבי מפתח של האות התמרה חושית cascades. זרחון של חלבונים המצע על ידי אנזימים אלה מעורר תגובות ביולוגיות להסדיר אירועים קריטיים שליטה חלוקת התא, חילוף החומרים, בידול, בין היתר. CK2 הוא קינאז ביטוי ubiquitously, acidophilic סרין/טראונין זה חוק של שמרים לבני אדם, זה ממלא תפקידים חשובים רבים תהליכים תאיים ועד תקנה תעתיק מחזור התא התקדמות אפופטוזיס1 ,2,3. האנזים הוא heterotetramer המורכב שני α קטליטי (או α') subunits וβ רגולטוריות שני subunits4. בנוסף להיותו מאוד pleiotropic, CK2 מוצגים שני יוצא דופן מאפיינים אחרים זה לסבך את הניתוח שלה, כלומר פעילות מכוננת5 ו- ירידה לפרטים מצע משותף כפול6. המאפיין האחרון הזה מעניק CK2 עם היכולת להשתמש GTP, כמו גם ATP עבור זרחון של חלבונים המצע.
מחיקת גנטי subunits קטליטי או תקניות של CK2 בעכברים גורמת lethality עובריים המציין כי זה משחק תפקיד מכריע במהלך פיתוח ו-7,organogenesis8. CK2 הוא overexpressed גם כמה סוגים של סרטן ומייצגת ובכך מבטיח מטרה טיפולית9,10,11. אכן, ספציפית מעכבי פעילות קינאז CK2 את היעד הם כעת תחת חקירה זו מטרה12,13,14. בעוד עיכוב של CK2 היא אפשרות מעשית, בהתחשב באופי pleiotropic שלה, חלופה אולי גישה יותר הגיוני יהיה היעד קריטית סובסטרטים CK2 העומדים בבסיס את התקדמות סרטן מסוימים. לכן, מקיף זיהוי ואפיון של חלבונים המצע CK2 יהיה של יתרון משמעותי עבור שחקרתי את function(s) ספציפיים של קינאז בתוך סוג הרקמה או גידול מסוים.
כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית רב-תכליתי לזיהוי CK2 סובסטרטים מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תאים או רקמות lysate. פרוטוקול זה מנצל יחודיות כפול מצע משותף של CK2 על-ידי שימוש אנלוגי GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) guanosine שלא kinases אנדוגני אחרים יכולים להשתמש. דבר זה מאפשר ביעילות את קינאז "לסמן" שלה מצעים בתוך את הדוגמית הזו. עבור הבאים בידוד וזיהוי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

המחקר של קינאז-המצע יחסים חיונית כדי להשיג הבנה מלאה של הפונקציות של אנזימים אלה ומטרות במורד הזרם שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. CK2 הוא קינאז סרין אבולוציונית שנשמרת/תראונין עם הרשימה המתארכת של מאות סובסטרטים מעורבים תהליכים תאיים מרובים. בשל תכונותיו pleiotropic, זיהוי ואפיון ערכה מקיפה של סובסטרטים CK2 כבר מאתגר במיוחד, נשאר משוכה במחקר של אנזים חשוב זה. כדי לטפל באתגר זה, אנו פיתחו אסטרטגיה ניסיוני רב תכליתי המאפשר את העשרה יישוב וזיהוי של בשם דיאלקטריים CK2. פרוטוקול זה מנצל יחודיות ייחודי מצע משותף כפול של CK2 ומאפשר thiophosphorylation ספציפיים של סובסטרטים שלו בתא או רקמות lysate. חלבונים אלו המצע לאחר מכן alkylated, immunoprecipitated, ו המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). השתמשנו בעבר גישה זו בהצלחה לזהות CK2 סובסטרטים מן השחלות דרוזופילה ולהרחיב כאן אנחנו היישום של פרוטוקול זה לתאים אנושיים גליובלסטומה, הממחישות את יכולת ההתאמה של שיטה זו לחקור התפקיד הביולוגי של קינאז דגם אורגניזמים שונים, מערכות ניסויות.

תרשים כללי של ההליך ניסיוני מסופק באיור1. הבסיס כבסיס של הטכניקה היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP להעברת קבוצה phosphoryl. תוספת של holoenzyme CK2 אקסוגני יחד עם GTP אנלוגי, GTPγS, אל תא lysate גורמת thiophosphorylation של סובסטרטים CK2 אנדוגני. הטיפול הבאים של lysate עם החומר מגיב p</...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

פרוטוקול זה מאפשר תיוג ספציפי והעשרה וזיהוי של מצעי CK2 אנדוגניים מדגימה ביולוגית מורכבת כגון ליסס תא או רקמה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או רקמה. ובכך להקל, המחקר של CK2 בהקשרים ביולוגיים שונים.מדגים את ההליך יהיה ג'ון Chojnowski, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, באופן מכני lyse מדגם הרקמה או תאים מתורבתים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף סך של 900 microliters של מדגם. צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן, להעביר 270 microliters של supernatant לכל אחד משלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר חדש. הסר 40 מיקרוליטרים של העל-טבעי הנותרים שישמשו כבקרת קלט, והעבר אותו לצינור חדש. מניחים את כל הדגימות על קרח.ראשית, סמן כל אחד משלושת צינורות הדגימה כפי שמוצג כאן. לצינור התגובה Kinase, להוסיף 2.7 microliters של CK2 ו 2.7 microliters של 2.5 מילימולאר GTPgammaS. מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח.לצינור GTPgammaS בלבד, הוסיפו 2.7 מיקרוליטרים של GTPgammaS 2.5 מילימולרים ו-2.7 מיקרוליטרים של מאגר ליזה. תצליף בצינור הזה כדי לערבב, ומיד תן לו קרח. לצינור PNBM בלבד להוסיף 5.4 microliters של מאגר ליזה.מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח. דגירה כל שלושת הצינורות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף 13.5 microliters של PNBM ב 12 מיליגרם למיליליטר לכל צינור.להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות, ולהדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. בזמן שהדגימות דגירה, סמן כל אחת מהעמודות כך שהדגימה תיטען, כפי שמוצג כאן. הכן את העמודות על-ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי להוסיף שימוש חוזר לשרף Sephadex G-25 במאגר האחסון.צרף כל עמודה לעמוד מהדק, ותן לו לשבת באין מפריע במשך כחמש דקות כדי לאפשר את שהרשת להתיישב. לאחר מכן, מניחים צינור מתחת לפתיחה התחתונה של כל עמודה. הסר את הכובעים הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של כל עמודה, כדי לאפשר למאגר האחסון להתנקז לצינורות בכוח הכבידה.לאחר חיץ האחסון מתרוקן, להוסיף כ 2.7 מיליליטר של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לצייד אותם, הקפד לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. חזור על תהליך זה של הוספת מאגר Lysis ומבטל את הזרימה דרך, שלוש פעמים. כדי להתחיל, טען כל דגימה בעמודה המתאימה לה.לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. הוסף 420 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לשטוף את הדגימות. תן למאגר Lysis לסנן דרך העמודה, ולאסוף ולמחוק את הזרימה דרך.לאחר מכן, מניחים צינורות למיקום מתחת לכל עמודה לאיסוף לדוגמה. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר Lysis לכל עמודה כדי לחמק מהדגימות. לאסוף את הזרימה דרך, אשר מכיל כעת אוכלוסייה מועשרת של מצעים CK2 thiophosphorylated ו alkylated בתגובת קינאז.התגובה GTPgammaS בלבד יכיל מצעים thiophosphorylated ו alkylated על ידי כל CK2 אנדוגני נוכח. תגובת PNMB בלבד תכיל חלבונים אלקילואטים ברקע. הסר 80 מיקרוליטרים מכל אלוטיון כדגימה לבקרת קלט אלוטיון.לאחר מכן, לפצל כל מדגם לשני צינורות שכל אחד מכיל 200 microliters. סמן כל אחד מהצינורות כאנטי-תיופוספט אסתר או אימונוגלובולין G, כפי שמוצג כאן. הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן אסתר אנטי-תיופוספט לכל אחד מצינורות אסתר אנטי-תיופוספט.הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן בקרת Isotype לכל אחד מצינורות IGG. ואז למקם את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים. במהלך 15 הדקות האחרונות של הדגירה לדוגמה, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את הקצה של קצה פיפטה P200 כדי להגדיל את גודל המד.מיד לפני השימוש, בקצרה מערבולת צינור האחסון המכיל את חרוזים agarose. באמצעות קצה פיפטה לחתוך, להעביר 100 microliters של תרחיף חרוזים לכל immunoprecipitation לצינור microcentrifuge חדש 1.7 מיליליטר. חשוב למערבולת את חרוזים לפני כל העברה כדי למנוע חרוזים להתיישב.צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר והשליך את העל-טבעי. תוסיפו מחדש את חרוזים על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב.חזור על תהליך זה של צנטריפוגה ושטיפת חרוזים שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את חרוזים על קרח עד מוכן להמשיך. כאשר הדגימות סיימו דגירה, צנטריפוגה אותם ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל מדגם לצינורות המכילים את חרוזים שטף. מניחים את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת.הסר 40 מיקרוליטרים מכל על-טבעי כדי לחסוך כבקרת דלדול. הסר והשליך את שאר העל-טבעי, נזהר שלא להפריע לקדושים. לשטוף את הדגימות על ידי הוספת 200 microliters של מאגר ליזה לכל מערבולת בקצרה.צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, השלכת העל טבעי. חזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה שלוש פעמים דואג לא להפריע חרוזים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מאגר מדגם 2X לכל מדגם המכיל חרוזים.עבור כל הדוגמאות האחרות, הכוללות את בקרת הקלט, פקדי קלט האלוטיון ופקדי הדלדול, הוסף 8 מיקרוליטרים של מאגר מדגם 6X. פיפטה כל צינור למעלה ולמטה לערבב למעט צינורות המכילים חרוזים, לחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני שתמשיך עם SDS-PAGE. כדי להעריך אם האימונופרציפציה הצליחה, הפעל 25 עד 30 מיקרוליטרים של כל דגימה שחמקה מעולםים בג'ל פוליאקרילמיד נפרד של 12.5%.הכתם כל ג'ל בכחול קומאסי כדי לדמיין חלבונים מועשרים מהשלבים השונים של פרוטוקול הניסוי. באמצעות סכיני גילוח חדשים ונקיים, יש למלמל בזהירות את כל הרצועות הייחודיות הקיימות בתגובת הקינאז נגד תיופוספט אסתר IP ליין, תוך שים לב למשקולות המולקולריות המשוערות שלהם. יש להשתמש בסכין גילוח חדש עבור כל רצועה ייחודית.הבסיס של טכניקה זו היא טכניקה זו היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP עבור העברת קבוצת זרחן. תוספת של הולואנזים CK2 אקסוגני יחד עם אנלוגי GTP, GTPgammaS, לליזאט תא, תוצאות תיופוספרילציה של מצעים אנדוגני CK2. הטיפול הבא של ליסט עם p-Nitrobenzyl mesylate reagent alkylating מייצר מויטי אסתר תיופוספט על חלבוני מצע ספציפיים אלה, כי אז יכול להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדן אסתר אנטי תיופוספט ובסופו של דבר מזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה.בתוצאות החיוביות הייצוגיות המוצגות כאן, CK2 תלוי, thiophosphorylation ו אלקליות הבאים היו מוצלחים. כצפוי, אות אסתר אנטי-תיופוספט משופר על ידי כתמים מערביים נצפה רק בנתיב המכיל את תגובת קינאז מלאה, ולא ב GTPgammaS בלבד ו PNMB רק דגימות מטופלות. ג'ל מוכתם כחול קומאסי של חלבונים immunoprecipitated ו רמז, גם להפגין תוצאה חיובית.כמו להקות ייחודיות מרובות ניכרים רק בנתיב IP אסתר אנטי-תיופוספט, שבו ליסט היה דגירה עם CK2 אקסוגני GTPgammaS. לאחר מכן, הלהקה המסומנת הוצאה מהג'ל והוגשתה לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה. בעקבות הליך זה, יש לאמת מצעים CK2 putative שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה באמצעות גישה נוספת, כגון על ידי זרחון תלוי CK2 בהתעקשות תקן במבחנה קינאז.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...