Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione del Commonwealth universale ricerca Enhancement Pennsylvania dipartimento della sanità di t.i.s.

Nota: Assicurarsi che i materiali necessari sono disponibili e adeguatamente preparati (Vedi Tabella materiali).
1. preparazione
<ol><li>Meccanicamente lisare il campione di tessuto (1-2 mg di tessuto in 100 µ l di tampone di Lisi, tabella 1) o cellule (piastra di 10 cm che è 80-90% confluenti in 350 µ l di tampone di lisi), coltivate con l'obiettivo di raccogliere un totale di 900 µ l di campione per l'esperimento. Si noti che questo volume è in legger...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Qui, descriviamo un metodo relativamente semplice biochimico per l'identificazione dei substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso. I passaggi critici del presente protocollo si basano sull'insolita proprietà enzimatiche di CK2 e includono CK2-dipendente thiophosphorylation delle proteine substrato specifico utilizzando GTPγS e loro successiva immunoprecipitazione e identificazione. Con questi risultati, abbiamo dimostrato l'utilità e la versatilità di questo approccio come ora...

Chinasi di proteina sono componenti chiave delle cascate di trasduzione del segnale. La fosforilazione delle proteine substrato da questi enzimi suscita risposte biologiche che regolano gli eventi critici, controllo della divisione cellulare, il metabolismo e differenziazione, tra gli altri. CK2 è un'espressa ubiquitariamente, acidofilico serina/treonina chinasi che è conservata dal lievito all'uomo e che svolge i ruoli importanti in molti processi cellulari che vanno dalla regolazione trascrizionale di progressione del ciclo cellulare per apoptosi1 ,2,3. L'enzima è un heterotetramer composto da due α catalitico (o α') subunità e due di subunità β regolamentazione4. Oltre ad essere altamente pleiotropico, CK2 esibisce due altre caratteristiche insolite che complicano la sua analisi, vale a dire attività costitutiva5 e dual co-substrato specificità6. Quest'ultima proprietà dota CK2 con la possibilità di utilizzare GTP nonché ATP per fosforilazione delle proteine substrato.
Delezione genica delle subunità catalitica o regolamentazione di CK2 in topi provoca mortalità embrionale che indica che esso gioca un ruolo cruciale durante lo sviluppo e l'organogenesi7,8. CK2 anche overexpressed in diversi tipi di cancro e quindi rappresenta un promettente bersaglio terapeutico9,10,11. Infatti, inibitori specifici che attività di chinasi CK2 destinazione sono attualmente sotto inchiesta per questo scopo12,13,14. Mentre l'inibizione di CK2 è una valida opzione, data la sua natura pleiotropica, un'alternativa e forse più razionale approccio sarebbe target critici substrati CK2 che sottendono la progressione di alcuni tumori. Pertanto, la completa identificazione e caratterizzazione di proteine substrato CK2 sarebbe di beneficio significativo per delucidare le funzioni specifiche di questa chinasi all'interno di un particolare tipo di tessuto o del tumore.
Qui, descriviamo un metodo versatile biochimico per l'identificazione dei substrati di CK2 da un campione biologico complesso come una cellula o tessuto lisato. Questo protocollo sfrutta la specificità di co-substrato dual di CK2 dall'uso dell'analogo GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) che non è possibile utilizzare altre chinasi endogene. Questo permette efficacemente la chinasi ad "etichettare" suoi substrati all'interno di questo campione per identificazione e isolamento successivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Lo studio delle relazioni di chinasi-substrato è essenziale per ottenere una comprensione completa delle funzioni di questi enzimi e ai loro obiettivi a valle negli Stati sia fisiologici che patologici. CK2 è un'evolutivamente conservati serina/treonina chinasi con un crescente elenco di centinaia di substrati coinvolti in molteplici processi cellulari. Grazie alle sue proprietà pleiotropici, identificare e caratterizzare una serie completa di CK2 substrati è stato particolarmente impegnativo e rimane un ostacolo nello studio di questo importante enzima. Per affrontare questa sfida, abbiamo messo a punto una strategia sperimentale versatile che consente l'arricchimento mirato e l'identificazione di presunti CK2 substrati. Questo protocollo si avvale della specificità unica dual co-substrato di CK2 permettendo per specifici thiophosphorylation dei suoi substrati in una cellula o tessuto lisato. Queste proteine del substrato sono successivamente alchilati, immunoprecipitated e identificati mediante spettrometria di massa tandem/cromatografia liquida (LC-MS/MS). In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per identificare con successo CK2 substrati dalle ovaie di Drosophila e qui abbiamo estendere l'applicazione del presente protocollo alle cellule di glioblastoma umano, illustrando l'adattabilità di questo metodo per indagare il ruoli biologici di questa chinasi in vari organismi modello e sistemi sperimentali.

Nella Figura 1viene fornito un diagramma schematico della procedura sperimentale. Alla base della tecnica è la capacità insolita di CK2 utilizzare GTP per trasferimento del gruppo fosforile. Aggiunta di esogeno CK2 holoenzyme insieme con l'analogo del GTP, GTPγS, per un lysate delle cellule provoca thiophosphorylation di substrati endogeni CK2. Il trattamento successivo del lisato con l'alchilanti reagente p- nitrobenzyl mesylate (PNBM) genera una...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

L'obiettivo del presente protocollo è di etichettare, arricchire e identificare i substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso come un lysate delle cellule o del tessuto omogeneizzato. Questo metodo sfrutta gli aspetti unici di CK2 biologia per questo scopo.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Questo protocollo consente l'etichettatura specifica e il successivo arricchimento e identificazione di substrati CK2 endogeni da un campione biologico complesso come una cellula o un lisce di tessuto. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o tessuto. Facilitando così lo studio della CK2 in vari contesti biologici.A dimostrare la procedura sarà John Chojnowski, uno studente laureato del mio laboratorio. Per cominciare, lisciviare meccanicamente il campione di tessuto o le cellule coltivate come delineato nel protocollo di testo per raccogliere un totale di 900 microlitri di campione. Centrifuga a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per tre minuti.Quindi, trasferire 270 microlitri del supernatante in ciascuno dei tre nuovi tubi a microcentrifugo da 1,7 millilitri. Rimuovere 40 microlitri del supernatante rimanente da utilizzare come controllo di ingresso e trasferirlo su un nuovo tubo. Metti tutti i campioni sul ghiaccio.In primo luogo, etichettare ciascuno dei tre tubi campione come mostrato qui. Al tubo di reazione della Chinasi aggiungere 2,7 microlitri di CK2 e 2,7 microlitri di GTPgammaS da 2,5 millimolare. Scorrere il tubo per mescolare e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio.All'unico tubo GTPgammaS, aggiungere 2,7 microlitri di GTPgammaS da 2,5 millimolari e 2,7 microlitri di Lysis Buffer. Sfoglia questo tubo per mescolare e posizionalo immediatamente sul ghiaccio. Al tubo solo PNBM aggiungere 5,4 microlitri di Lysis Buffer.Scorrere il tubo per mescolare e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Incubare tutti e tre i tubi in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, aggiungere 13,5 microlitri di PNBM a 12 milligrammi per millilitro a ciascun tubo.Invertire i tubi per mescolare i campioni e incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora. Durante l'incubazione dei campioni, etichettare ciascuna delle colonne per il campione da caricare, come mostrato qui. Preparare le colonne invertendo ogni colonna più volte per rimescolare la resina Sephadex G-25 nel tampone di stoccaggio.Attaccare ogni colonna a un supporto del morsetto e lasciarla riposare indisturbata per circa cinque minuti per lasciare depositare la resina. Quindi, posizionare un tubo sotto l'apertura inferiore di ogni colonna. Rimuovere i tappi sia dalla parte superiore che inferiore di ogni colonna, per consentire al buffer di stoccaggio di drenare nei tubi per gravità.Una volta esaurito il buffer di archiviazione, aggiungere circa 2,7 millilitri di Lysis Buffer a ogni colonna per equilibrarli, assicurandosi di raccogliere e scartare il flusso attraverso. Ripetere questo processo di aggiunta del buffer di lisi e di eliminazione del flusso, tre volte. Per iniziare, caricare ogni campione nella rispettiva colonna.Raccogliere e scartare il flusso. Aggiungere 420 microlitri di Lysis Buffer a ogni colonna per lavare i campioni. Lasciare che il buffer di lisi filtri attraverso la colonna e raccogliere ed eliminare il flusso.Quindi, posizionare i tubi in posizione sotto ogni colonna per la raccolta del campione. Aggiungere 500 microlitri di Lysis Buffer a ogni colonna per elutere i campioni. Raccogliere il flusso attraverso, che ora contiene una popolazione arricchita di substrati CK2 tiofosforati e alchilati nella reazione della chinasi.L'unica reazione di GTPgammaS conterrà substrati tiofosforati e alchilati da qualsiasi CK2 endogeno presente. L'unica reazione del PNMB conterrà proteine alchilate di fondo. Rimuovere 80 microlitri da ogni eluizione come campione di controllo dell'input di eluizione.Successivamente, dividere ogni campione in due tubi che contengono ciascuno 200 microlitri. Etichettare ciascuno dei tubi come estere anti-tiofosfato o immunoglobulina G, come mostrato qui. Aggiungere 2,8 microgrammi di anticorpo estere anti-tiofosfato a ciascuno dei tubi di estere anti-tiofosfato.Aggiungere 2,8 microgrammi di anticorpo di controllo dell'isotipo a ciascuno dei tubi IGG. Quindi posizionare i tubi su un rotatore a quattro gradi Celsius per due ore. Durante gli ultimi 15 minuti dell'incubazione del campione, utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare l'estremità di una punta della pipetta P200 per aumentare le dimensioni del misuratore.Immediatamente prima dell'uso, vortice brevemente il tubo di stoccaggio contenente le perline di agarosio. Utilizzando la punta della pipetta tagliata, trasferire 100 microlitri del liquame delle perline per immunoprecipitazione in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. È importante vortice delle perline prima di ogni trasferimento per evitare che le perline si assestano.Centrifuga i tubi a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere e scartare il supernatante. Rimescolare le perline aggiungendo 200 microlitri di Lysis Buffer e brevemente vortice da mescolare.Ripetere questo processo di centrifugazione e lavaggio delle perline tre volte. Dopo il lavaggio finale, posizionare le perline sul ghiaccio fino a quando non sono pronte a procedere. Quando i campioni hanno finito di incubare, centrifugarli a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per tre minuti.Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascun campione ai tubi contenenti le perline lavate. Posizionare i tubi su un rotatore a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifuga i tubi a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto.Rimuovere 40 microlitri da ogni supernatante per salvarli come controllo dell'esaurimento. Rimuovere e scartare il resto del supernatante, facendo attenzione a non disturbare le perline. Lavare i campioni aggiungendo 200 microlitri di Lysis Buffer a ciascuno e vortice brevemente.Centrifuga a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto, scartando il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione tre volte facendo attenzione a non disturbare le perline. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone campione 2X a ciascun campione contenente perline.Per tutti gli altri campioni, tra cui il controllo di input, i controlli di input di eluizione e i controlli di esaurimento, aggiungere 8 microlitri di 6X Sample Buffer. Pipettare ogni tubo su e giù per mescolare ad eccezione dei tubi contenenti perline e riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti prima di procedere con SDS-PAGE. Per valutare se l'immunoprecipitazione ha avuto successo, eseguire da 25 a 30 microlitri di ciascun campione che è stato eluso dalle perline su un gel di poliacrilammide separato al 12,5%.Macchiare ogni gel con Coomassie Blue per visualizzare proteine arricchite da varie fasi del protocollo sperimentale. Utilizzando nuove lamette pulite, asportare con cura tutte le bande uniche presenti nella reazione chinasi anti-tiofosfato estere IP Lane prendendo nota dei loro pesi molecolari approssimativi. Una nuova lama di rasoio dovrebbe essere utilizzata per ogni fascia unica.La base alla base di questa tecnica è questa tecnica è l'insolita capacità di CK2 di usare GTP per il trasferimento di gruppi fosforilici. L'aggiunta di oloenzima CK2 esogeno insieme all'analogo GTP, GTPgammaS, a un llysato cellulare, si traduce in una tiofosforilazione di substrati CK2 endogeni. Il successivo trattamento del lisato con il reagente alchilante p-Nitrobenzyl mesylato genera moietà estere tiofosfato su queste specifiche proteine del substrato, che possono quindi essere immunoprecipitate utilizzando un anticorpo estere anti-tiofosfato e infine identificate dalla spettrometria di massa.Nei risultati positivi rappresentativi qui riportati, CK2 dipendente, tiofosforilazione e successiva alchilazione hanno avuto successo. Come previsto, un segnale di estere anti-tiofosfato potenziato da western blotting si osserva solo nella corsia contenente la reazione completa della chinasi, e non solo nel GTPgammaS e nei campioni trattati solo con PNMB. Anche un gel macchiato Coomassie Blue delle proteine immunoprecipitate e alluse, dimostra un risultato positivo.Poiché più bande uniche sono evidenti solo nell'estere anti-tiofosfato IP Lane, in cui il lisato è stato incubato con CK2 e GTPgammaS esogeni. La banda marcata viene quindi asportata dal gel e sottoposta all'identificazione proteica mediante spettrometria di massa. Seguendo questa procedura, i substrati putativi CK2 identificati da una spettrometria di massa devono essere convalidati utilizzando un approccio aggiuntivo, come ad esempio dalla fosforilazione dipendente da CK2 in un saggio standard in vitro sulla chinasi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Ricerca

Biochimica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

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L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

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Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

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