Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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この作品は、授業を実施するペンシルベニア州保健省から連邦普遍的な研究強化助成金によって部分で支えられました

メモ: は、必要な材料は、使用可能な適切に準備を確認 (材料の表を参照してください)。
1. 準備
<ol><li>機械的に組織サンプル (表 1の換散バッファーの 100 μ L の組織の 1-2 mg) を溶解または培養細胞 (換散バッファーの 350 μ L で 80-90% の合流は、10 cm プレート)、実験用サンプルの 900 μ L の合計を収集することを目標とします。このボリュームは、...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

ここでは、複雑な生物的サンプルからの蛋白質キナーゼ CK2 の基板を識別するため比較的単純な生化学的手法について述べる。このプロトコルの重要なステップは、CK2 の異常な酵素学的性質に基づくし、CK2 依存 thiophosphorylation GTPγS 以降免疫沈降と識別を用いた特異的基質タンパク質が含まれています。これらの結果、ひと神経膠芽腫細胞、ショウジョウバエ卵巣18...

蛋白質キナーゼはシグナル伝達カスケードの主要なコンポーネントです。これらの酵素による基質タンパク質のリン酸化は細胞分裂、新陳代謝および他の中の分化を制御する重要なイベントを調節する生体反応を引き出します。CK2 は普遍的表現、好酸性セリン/スレオニン ・ キナーゼ人間に酵母から保存されているが、転写制御からアポトーシス1 細胞周期の進行に至るまで多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。、2,3。酵素は 2 つの触媒 α で構成される heterotetramer (または α') サブユニットと 2 つの規制 β サブユニット4。高い, だけでなく、CK2 の特徴 2 他珍しいその分析を複雑にするすなわち、構成活動5と二重共同の基質特異性6。この後者のプロパティは、基質タンパク質のリン酸化のため ATP と同様に GTP を使用する能力を持つ CK2 を与えます。
マウス CK2 の触媒作用または規制のサブユニットの遺伝子の欠失は、開発と器官形成7、8時に重要な役割を果たしていることを示す胚性致死の結果します。CK2 は癌のいくつかの種類の過剰発現も、従って有望な治療上のターゲット9,10,11を表します。確かに、特異的阻害剤そのターゲット CK2 キナーゼ活動現在調査中ですこの目的12,13,14。一方、CK2 の阻害は, 本来の代わりを与え、可能なオプションと、おそらくより合理的なアプローチはある特定の癌の進行の根底にある重要な CK2 基板を対象とするでしょう。したがって、包括的な同定と CK2 基質タンパク質の機能解析は特定の組織や腫瘍の型の中でこのキナーゼの特定の機能を解明するための重要な利点のでしょう。
ここでは、細胞や組織ライセートなど複雑な生体試料から CK2 基板を識別するため多彩な生化学的手法について述べる。このプロトコルを用いて GTP アナログ GTPγS (その他の内因性のキナーゼを使用ことはできませんグアノシン 5'-[γ-thio]triphosphate) CK2 のデュアルの共同の基質特異性の活用します。これにより、このサンプルに後続の分離と同定のための基板を「ラベル」としてキナーゼ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

キナーゼ基質の関係の研究は生理と病態におけるこれらの酵素とその下流の機能の完全な理解を得るために不可欠です。CK2 は複数の細胞プロセスに関与する基板の何百もの成長のリストに進化上保存されたセリン/スレオニン キナーゼです。その多面プロパティのため抽出と定量化 CK2 基板の包括的なセットは特に挑戦されているし、この重要な酵素の研究でハードルのまま。このような課題に対処するため、我々 は、ターゲットの濃縮と推定 CK2 基板の識別を可能にする汎用性の高い実験的戦略を考案した.このプロトコルは、ライセートその基質細胞または組織の特定の thiophosphorylation を可能にする CK2 のユニークな二重共同基質特異性の活用します。これらの基質タンパク質がその後は、アルキル化、沈澱と液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) によって識別されます。我々 はショウジョウバエ卵巣から CK2 基板を正しく識別するこのアプローチを使用している以前とここで我々 は調査方法の適応性を示すひと膠芽腫細胞にこのプロトコルのアプリケーションを拡張、各種のモデル生物・実験システムにおけるこのキナーゼの生物学的役割は。

図 1に実験手順の概略図があります。技術の基盤には、リン酸化グループ転送に GTP を使用する CK2 の珍しい機能です。ホロ酵素 CK2 外因性内因性 CK2 基板の thiophosphorylation の細胞ライセート結果 GTP アナログ、GTPγS、に沿っての追加。ライセート アルキル化試薬p- ニトロベンジル イマチニブ (PNBM) との後の治療はエステル抗 thiophosphate 抗体...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2 生物のユニークな側面を活用しています。

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

このプロトコルは、細胞または組織のライセートのような複雑な生物学的サンプルから特定の標識およびそれに続くCK2基質の濃縮および同定を可能にする。この方法は、任意の細胞タイプまたは組織に適用することができる。このようにして、種々の生物学的文脈におけるCK2の研究を促進する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるジョン・チョイノフスキです。まず、テキストプロトコルで概説されているように組織サンプルまたは培養細胞を機械的に融液し、合計900マイクロリットルのサンプルを収集する。17倍、重力500倍、摂氏4度で3分間遠心分離機。次いで、上清の270マイクロリットルを3つの新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管のそれぞれに移す。入力コントロールとして使用する残りの上清の40マイクロリットルを取り除き、新しいチューブに移します。すべてのサンプルを氷の上に置きます。まず、ここに示すように、3つのサンプルチューブのそれぞれにラベルを付けます。キナーゼ反応チューブに、CK2の2.7マイクロリットルと2.5ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルを加えます。チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。GTPgammaS専用チューブに、2.7ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルと2.7マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。このチューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。PNBMにのみチューブにリシスバッファーの5.4マイクロリットルを追加します。チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。3本のチューブを摂氏30度の水浴に1分間インキュベートします。この後、各チューブに1ミリリットルあたり12ミリグラムで13.5マイクロリットルのPNBMを加えます。チューブを反転してサンプルを混合し、室温で1時間インキュベートします。サンプルがインキュベートされている間、次に示すように、読み込むサンプルの各列にラベルを付けます。各カラムを数回反転させて、記憶バッファー内のSephadex G-25樹脂を再懸濁させてカラムを準備します。各列をクランプスタンドに取り付け、約5分間邪魔されずに座らせて樹脂を落ち着かせます。次に、各列の下の開口部の下にチューブを配置します。各列の上部と下部の両方からキャップを取り外し、ストレージバッファが重力によってチューブに排出されるようにします。ストレージバッファーが使い果たされたら、各カラムに約2.7ミリリットルのLysis Bufferを追加して平衡化し、フローを収集して廃棄します。Lysis バッファを追加し、フローを 3 回破棄するこのプロセスを繰り返します。開始するには、各サンプルをそれぞれの列にロードします。フローを収集し、破棄します。各カラムに420マイクロリットルのLysis Bufferを加え、サンプルを洗浄します。Lysis バッファが列を通してフィルター処理し、フローを収集して破棄します。次に、サンプル収集のために各列の下の位置にチューブを配置します。各カラムに500マイクロリットルのLysis Bufferを加える。キナーゼ反応でチオリン酸化およびアルキル化されたCK2基質の濃縮集団を含む流れを収集します。GTPgammaSのみの反応は、存在する任意の内因性CK2によってチオリン酸化およびアルキル化された基質を含む。PNMBのみの反応は、バックグラウンドアルキル化タンパク質を含む。溶出入力制御サンプルとして各溶出から80マイクロリットルを取り除く。次に、各サンプルを200マイクロリットルを含む2つのチューブに分割します。各管に対して、抗チオリン酸エステルまたは免疫グロブリンGのいずれかであることをラベル付けする。.抗チオリン酸エステルチューブのそれぞれに2.8マイクログラムの抗チオリン酸エステル抗体を加えます。各IGGチューブに2.8マイクログラムのアイソタイプコントロール抗体を加えます。その後、2時間摂氏4度で回転器の上にチューブを置きます。サンプルインキュベーションの最後の15分間、きれいなカミソリの刃を使用して、P200ピペットチップの端部を切り落とし、ゲージサイズを大きくします。使用の直前に、アガロースビーズを含む貯蔵管を短時間渦に入れます。カットピペットチップを使用して、新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに免疫沈降ごとにビーズスラリーの100マイクロリットルを移します。ビーズが落ち着くのを防ぐために、各転送の前にビーズを渦に入れるのが重要です。チューブを17、500倍の重力、摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。200マイクロリットルのLysisバッファーを加え、短時間渦を混ぜてビーズを再懸濁します。このプロセスを繰り返し、遠心分離し、ビーズを洗浄します。最後の洗浄の後、ビーズを氷の上に置いて、準備が整うまで進みます。サンプルがインキュベートを終えたら、17、500倍の重力、摂氏4度で3分間遠心分離します。次いで、各サンプルの200マイクロリットルを洗浄されたビーズを含むチューブに移す。チューブを摂氏4度の回転器に1時間置きます。次に、チューブを17倍、重力の500倍、摂氏4度で1分間遠心します。各上清から40マイクロリットルを取り除き、枯渇制御として保存します。上清の残りの部分を取り除き、ビーズを邪魔しないように注意してください。サンプルを洗浄するには、それぞれに200マイクロリットルのライシスバッファーを加え、短時間で渦を出します。17、500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で1分間、上清を捨てる。この洗浄と遠心分離プロセスを3回繰り返し、ビーズを乱さないように注意してください。この後、ビーズを含む各サンプルに2Xサンプルバッファーの50マイクロリットルを追加します。入力コントロール、溶出入力コントロール、および枯渇制御を含む他のすべてのサンプルでは、6X サンプル バッファーの 8 マイクロリットルを追加します。ピペット各チューブは、ビーズを含むチューブを除いて混合し、SDS-PAGEを続行する前に5分間摂氏95度ですべてのサンプルを加熱します。免疫沈降が成功したかどうかを評価するには、ビーズから除外された各サンプルの25〜30マイクロリットルを別の12.5%ポリアクリルアミドゲルで実行します。各ゲルをクマシーブルーで染色し、実験プロトコルの様々な段階から濃縮タンパク質を可視化します。新しい、きれいなカミソリの刃を使用して、慎重にそれらのおおよその分子量をメモしながら、キナーゼ反応抗チオリン酸エステルIPレーンに存在する任意のユニークなバンドを切除します。新しいカミソリの刃は、それぞれのユニークなバンドに使用する必要があります。この技術の根底にあるのは、この技術は、CK2がリン酸化基の転写にGTPを用いるという異常な能力である。外因性CK2ホロ酵素をGTPアナログと共に添加すると、GTPgammaSは、細胞ライセートに、内因性CK2基質のチオリン酸化を生じる。アルキル化試薬p-ニトロベンジルメシル酸を用いたライセートの後の処理は、これらの特定の基質タンパク質上にチオリン酸エステル部分を生成し、抗チオリン酸エステル抗体を使用して免疫沈降させ、最終的には質量分析によって同定することができる。ここに示す代表的な陽性結果では、CK2依存性、チオリン酸化およびその後のアルキル化が成功した。予想通り、ウェスタンブロッティングによる強化された抗チオリン酸エステルシグナルは、完全なキナーゼ反応を含むレーンでのみ観察され、GTPgammaSのみおよびPNMBのみで処理されたサンプルでは観察されない。免疫沈降およびほのめかされたタンパク質のクーマシーブルー染色ゲルと、陽性の結果も示す。複数のユニークなバンドは、抗チオリン酸エステルIPレーンでのみ明らかであるように、ライセートは外因性CK2およびGTPgammaSでインキュベートされた。マークされたバンドは、その後、ゲルから切除され、質量分析によってタンパク質同定のために提出される。この手順に従って、質量分析法によって同定された推定CK2基質は、標準的なin vitroキナーゼアッセイにおけるCK2依存性リン酸化などの追加アプローチを使用して検証されなければならない。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...