Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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이 작품은 펜실베니아 보건에서 T.I.S.의 연방 보편적인 연구 향상 그랜트에 의해 부분적으로 지원

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1입니다. 준비
<ol><li>기계적 조직 샘플 (조직 세포의 용 해 버퍼, 표 1의 100 µ L에 1-2 mg) lyse 세포 (세포의 용 해 버퍼의 350 µ L에서 80-90% 합칠 즉는 10 cm 접시) 실험에 대 한 샘플의 900 µ L의 총 수집 되 고 목표와 교양 또는. 이 볼륨의 아래에서 설명 하는 실험에 필요한 약간?...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

여기, 우리는 복잡 한 생물학 견본에서 단백질 키 니 아 제 CK2의 기질을 식별 하는 데 상대적으로 간단한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜의 중요 한 단계 CK2의 특이 한 효소 속성에 기반 하 고 GTPγS 및 후속 immunoprecipitation 식별을 사용 하 여 특정 기질 단백질의 CK2 종속 thiophosphorylation를 포함 합니다. 이러한 결과 함께 우리 시연 유틸리티와이 접근의 다양성으로 우리가 지금 인간의 세?...

단백질 kinases는 신호 변환 폭포의 핵심 요소입니다. 이 효소에 의해 기질 단백질의 인 산화는 세포 분열, 물질 대사, 및 다른 사람의 사이에서 분화 하는 중요 한 이벤트를 규제 하는 생물학 응답 elicits. CK2 편 표현, acidophilic 떠들고/트레오닌 키 니 아 하이 인 간에 게 효 모에서 보존 하 고는 transcriptional 규칙에서 apoptosis1 세포 주기 진행에 이르기까지 많은 세포질 과정에 중요 한 역할은 2,3. 효소는 2 개의 촉매 α의 구성 하는 heterotetramer (또는 α') 소 단위 및 2 개의 규제 β 소 단위4. 매우 다 면 발현 성 덧붙여 CK2 두 다른 특이 한 특성의 분석을 복잡 하 게 하는 즉 제정 활동5 와 듀얼 공동 기질 특이성6전시 한다. 이 후자의 속성 기질 단백질의 인 산화에 대 한 ATP로 서 GTP를 사용 하는 기능 CK2 endows.
쥐에서 CK2의 촉매 또는 규제 subunits의 유전 삭제 결과 그것은 개발 및 organogenesis7,8동안 중요 한 역할을 재생을 나타내는 배아 치 사 율. CK2 또한 여러 가지 유형의 암 overexpressed 고 따라서 유망 치료 대상9,,1011를 나타냅니다. 실제로, 특정 억제제 대상 CK2 키 니 아 제 활동은 현재이 목적12,,1314에 대 한 조사를 받고. 동안 억제 CK2의 가능한 옵션을 주어진 다 면 발현 성 자연, 대안 이며 아마도 더 합리적인 접근의 특정 암 진행의 기반이 되는 중요 한 CK2 기판 대상 하는 것. 따라서, 포괄적인 신분증과 CK2 기질 단백질의 특정 조직이 나 종양 유형 내에서이 키의 특정 함수를 elucidating 상당한 이점 될 것 이다.
여기, 우리는 셀 또는 조직 lysate 복잡 한 생물학 견본에서 CK2 기판 식별에 대 한 다양 한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜은 GTP 아날로그 (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) 다른 생 kinases 사용할 수 없습니다 GTPγS의 사용에 의해 CK2의 듀얼 공동 기질 특이성을 이용. 효과적으로 "레이블" 후속 격리 및 식별에 대 한이 예제 내에서 기판 하 니 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

키 기판 관계의 연구는 이러한 효소와 생리 및 병 적인 상태에서 그들의 다운스트림 목표의 기능에 대 한 완전 한 이해를 얻기 위해 필수적 이다. CK2 여러 세포질 과정에서 포함 된 기판의 수백의 성장 목록을 진화론 보존된 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 이다. 다 면 발현 성 속성으로 인해 식별 및 CK2 기판의 종합 세트 특히 도전 하고있다 고이 중요 한 효소의 연구에서 장애물을 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 대상된 농축 및 상 상속 CK2 기판의 식별을 가능 하 게 하는 다양 한 실험적인 전략을 고안 했다. 이 프로토콜은 lysate 셀 또는 조직에는 기판의 특정 thiophosphorylation에 대 한 허용 CK2의 독특한 듀얼 공동 기질 특이성을 활용 합니다. 이러한 기판 단백질은 이후에 alkylated, immunoprecipitated, 및 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)에 의해 식별. 우리는 이전 CK2 기판 초파리 난소에서 성공적으로 식별 하이 접근을 사용 하 고 여기 우리가 조사를이 방법의 적응성을 보여주는 인간 세포종 세포에이 프로토콜의 응용 프로그램을 확장 합니다 다양 한 모형 유기 체 및 실험적인 시스템에이 키의 생물학 역할.

실험 절차의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 기술의 기본으로 phosphoryl 그룹 전송을 위한 GTP를 사용 하 여 CK2의 특이 한 능력 이다. 에 세포 lysate thiophosphorylation 생 CK2 기판의 GTP 아날로그, GTPγS, 함께 exogenous CK2 holoenzyme의 추가. 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated 수 다음이 특정 기질 단백질에 thiophosphate 에스테 르 moiety를 생성 ?...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

이 프로토콜은 세포 또는 조직 용해와 같은 복잡한 생물학적 샘플에서 내인성 CK2 기판의 특정 라벨링 및 후속 농축 및 식별을 허용한다. 이 방법은 모든 세포 유형 또는 조직에 적용될 수 있다. 따라서 다양한 생물학적 맥락에서 CK2의 연구를 촉진한다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 존 Chojnowski가 될 것입니다. 시작하려면, 총 900 마이크로리터의 시료를 수집하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 조직 샘플 또는 배양 세포를 기계적으로 분해한다. 원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 3분간.그런 다음, 3개의 새로운 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브의 각각에 상피의 270 마이크로리터를 전송합니다. 입력 제어로 사용할 나머지 상체의 40 마이크로리터를 제거하고 새로운 튜브로 전송합니다. 모든 샘플을 얼음 위에 놓습니다.먼저, 여기에 표시된 대로 3개의 샘플 튜브각각에 라벨을 붙입니다. 키나제 반응 튜브에 CK2의 2.7 마이크로리터와 2.7 마이크로리터를 2.5 밀리머 GTPgammaS를 추가합니다. 튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다.GTPgammaS 전용 튜브에 2.7 마이크로리터 2.5 밀리머 GTPgammaS, 그리고 2.7 리시스 버퍼의 마이크로리터를 추가합니다. 혼합이 튜브를 플릭하고 즉시 얼음에 배치합니다. PNBM 전용 튜브에 5.4 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.튜브를 플릭하여 섞어 즉시 얼음 위에 놓습니다. 30°C에서 1분간 3개의 튜브를 모두 수조에 담는다. 그 후 각 튜브에 밀리리터당 12밀리그램에 13.5 마이크로리터의 PNBM을 추가합니다.튜브를 반전하여 샘플을 혼합하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 샘플이 인큐베이팅되는 동안 여기에 표시된 대로 샘플이 로드될 각 열에 레이블을 지정합니다. 각 열을 여러 번 반전하여 저장소 버퍼의 Sephadex G-25 수지를 다시 일시 중지하여 열을 준비합니다.각 컬럼을 클램프 스탠드에 부착하고 약 5분간 방해받지 않고 앉아 수지정착을 허용합니다. 다음으로 각 컬럼의 아래쪽 개구부 아래에 튜브를 놓습니다. 각 컬럼의 상단과 하단모두에서 캡을 제거하여 저장 버퍼가 중력에 의해 튜브로 배출되도록 합니다.저장소 버퍼가 고갈되면 각 열에 약 2.7 밀리리터의 Lysis Buffer를 추가하여 이를 상화하여 흐름을 수집하고 폐기합니다. Lysis 버퍼를 추가하고 흐름을 세 번 삭제하는 이 프로세스를 반복합니다. 시작하려면 각 샘플을 해당 열에 로드합니다.흐름을 수집하고 폐기합니다. 각 컬럼에 420마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하여 샘플을 세척합니다. Lysis 버퍼가 열을 통해 필터링하고 흐름을 수집하고 폐기하도록 합니다.그런 다음 샘플 수집을 위해 각 컬럼 아래에 튜브를 배치합니다. 샘플을 elute하기 위해 각 열에 500 마이크로리터의 Lysis 버퍼를 추가합니다. 지금 키나아제 반응에 있는 티오포스포리및 alkylated CK2 기판의 농축된 인구를 포함하는 통해 흐름을 수집합니다.GTPgammaS 만 반응은 어떤 내생 CK2 존재에 의해 기질 티오포스포리및 알킬것을 포함합니다. PNMB 만 반응은 배경 알키드 단백질을 포함합니다. 용출 입력 제어 샘플로 각 용출에서 80 마이크로리터를 제거합니다.다음으로 각 샘플을 각각 200마이크로리터가 포함된 두 개의 튜브로 분할합니다. 여기에 도시된 바와 같이 각 튜브를 안티 티오포스페이트 에스테르 또는 면역글로불린 G로 라벨을 붙인다. 각 티오포스페이트 에스테르 튜브에 2.8 마이크로그램의 항티오포스페이트 에스테르 항체를 첨가합니다.각 IGG 튜브에 2.8 마이크로그램의 이소타입 제어 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전에 놓습니다. 샘플 인큐베이션의 마지막 15 분 동안 깨끗한 면도날을 사용하여 P200 파이펫 팁의 끝을 잘라 게이지 크기를 증가시면 됩니다.사용하기 직전에 아가로즈 구슬이 들어 있는 저장 튜브를 잠시 소용돌이시다. 절단 파이펫 팁을 사용하여 면역 침전물당 비드 슬러리 100 마이크로리터를 새로운 1.7 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송합니다. 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 각 전송 전에 구슬을 소용돌이치게하는 것이 중요합니다.17, 500 배 중력과 1 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. Lysis 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가하고 잠시 혼합 소용돌이를 추가하여 구슬을 다시 중단합니다.구슬을 원심분리하고 세게 씻는 과정을 세 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 진행 할 준비가 될 때까지 얼음에 구슬을 놓습니다. 시료가 인큐베이팅을 마쳤을 때 원심분리기는 중력17, 500배, 섭씨 4도에서 3분간 분리합니다.그런 다음 각 샘플의 200 마이크로리터를 세척된 구슬을 포함하는 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 회전에 섭씨 4도에 1시간 동안 놓습니다. 다음으로, 17, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 튜브를 원심분리합니다.각 미세입자에서 40마이크로리터를 제거하여 고갈 제어로 저장합니다. 구슬을 방해하지 않도록 주의하면서 나머지 상체를 제거하고 버리십시오. 각각에 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하고 간략하게 소용돌이를 만들어 샘플을 씻어내라.원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 1분간 1분간 상주포를 폐기한다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 세 번 반복하여 구슬을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그 후 구슬을 포함하는 각 샘플에 2X 샘플 버퍼50마이크로리터를 추가합니다.입력 제어, 용출 입력 제어 및 고갈 컨트롤을 포함하는 다른 모든 샘플의 경우 6X 샘플 버퍼의 8 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫각 튜브는 구슬이 들어 있는 튜브를 제외한 모든 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열한 후 SDS-PAGE를 진행합니다. 면역 침전이 성공했는지 평가하기 위해 별도의 12.5 %의 폴리 아크릴 아미드 젤에서 구슬에서 벗어난 각 샘플의 25 ~ 30 마이크로 리터를 실행합니다.각 젤을 쿠마시 블루와 함께 염색하여 실험 프로토콜의 다양한 단계에서 농축된 단백질을 시각화합니다. 새롭고 깨끗한 면도날을 사용하여 키나아제 반응 항티오포스페이트 에스테르 IP 레인에 존재하는 독특한 밴드를 신중하게 절제하고 대략적인 분자량을 기록합니다. 각 고유 밴드에 새 면도날을 사용해야 합니다.이 기술의 기본 기초는이 기술은 인스포릴 그룹 전송에 대 한 GTP를 사용 하는 CK2의 특이 한 능력. GTP 아날로그와 함께 외인성 CK2 홀로효소를 첨가한 GTPgammaS는 세포 용액에, 내인성 CK2 기판의 티오포스포틸화를 초래한다. 알킬라팅 시약 p-니트로벤질 메실레이트와 함께 용액의 후속 치료는 이러한 특정 기판 단백질에 티오포스페이트 에스테르 모에티를 생성하며, 이는 항 티오포스페이트 에스테르 항체를 사용하여 면역침전될 수 있으며 궁극적으로 질량 분광법에 의해 식별될 수 있다.여기에 나타난 대표적인 긍정적인 결과에서 CK2 의존성, 티오포스포릴화 및 후속 알킬레이션이 성공했습니다. 예상대로, 서양 블로팅에 의한 향상된 안티 티오포스페이트 에스테르 신호는 GTPgammaS만이 아닌 완전한 키나아제 반응을 포함하는 차선에서만 관찰되며, PNMB는 처리된 샘플만으로 관찰된다. 면역 절전 및 암시 된 단백질의 Coomassie Blue 스테인드 젤은 긍정적 인 결과를 보여줍니다.여러 독특한 밴드는 항 티오포스페이트 에스테르 IP 레인에서만 분명하기 때문에, lysate는 외인성 CK2와 GTPgammaS로 배양되었습니다. 표시된 밴드는 젤에서 절제되고 질량 분석법에 의한 단백질 식별을 위해 제출됩니다. 이 절차에 따라, 질량 분광법에 의해 확인된 PUTative CK2 기판은 체외 키나아제 분석법에서 CK2 의존형 인산화와 같은 추가 접근법을 사용하여 검증되어야 한다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

연구

생화학

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...