Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Dette arbeidet var støttes delvis av en Commonwealth Universal forskning ekstrautstyr bevilgning fra Pennsylvania Department of Health å T.I.S.

Merk: Kontroller at de nødvendige materialene er tilgjengelig og skikkelig forberedt (se Tabell for materiale).
1. forberedelse
<ol><li>Mekanisk lyse Vevsprøve (1-2 mg av vev i 100 µL av lyseringsbuffer, tabell 1) eller kultivert celler (10 cm plate som er 80-90% confluent i 350 µL av lyseringsbuffer), med det mål å samle totalt 900 µL av prøve for eksperimentet. Merk at dette volumet litt i overkant av hva som kreves for eksperimentet beskrevet nede...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Her beskriver vi en relativt enkel biokjemiske metode for å identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg. De avgjørende skritt i denne protokollen er basert på uvanlig enzymatisk egenskapene for CK2 og inkluderer CK2-avhengige thiophosphorylation bestemt substrat proteiner med GTPγS og påfølgende immunoprecipitation og identifikasjon. Med disse resultatene har vi vist av og allsidighet av denne tilnærmingen som vi nå har søkt denne strategien i både menneskelige gliobl...

Protein kinaser er sentrale komponenter av signal signaltransduksjon cascades. Fosforylering substrat proteiner av disse enzymene utløser biologiske respons som regulerer kritiske hendelser kontrollere celledeling, metabolisme og differensiering, blant andre. CK2 er en overalt uttrykte, syre serine/threonin kinase som er bevart fra gjær til mennesker og som spiller viktige roller i mange mobilnettet prosesser, fra transcriptional regulering til celle syklus progresjon til apoptose1 ,2,3. Enzymet er en heterotetramer består av to katalytisk î± (eller α') underenheter og to regulatoriske β underenheter4. Er svært pleiotropic, har CK2 to andre uvanlige egenskaper som kompliserer sin analyse, nemlig grunnleggende aktivitet5 og dobbelt co substrat spesifisitet6. Sistnevnte egenskapen endows CK2 muligheten til å bruke GTP samt ATP for fosforylering substrat proteiner.
Genetisk sletting av de katalytiske eller forskriftsmessige underenheter av CK2 i mus gir embryonale dødelighet som indikerer at den spiller avgjørende roller under utvikling og organogenesen7,8. CK2 er også overexpressed i flere typer kreft og dermed representerer en lovende terapeutisk mål9,10,11. Faktisk, bestemte hemmere som CK2 kinase målaktiviteten er under etterforskning for dette formålet12,13,14. Mens hemming av CK2 er et levedyktig alternativ, gitt sin pleiotropic natur, et alternativ, og kanskje mer rasjonell tilnærming ville være å målrette kritiske CK2 underlag underlie progresjon av visse kreftformer. Derfor ville omfattende identifikasjon og karakterisering av CK2 substrat proteiner være betydelig fordel for Klargjørende den spesifikke funksjon av denne kinase innenfor en bestemt vev eller svulst type.
Her beskriver vi en allsidig biokjemiske metode for å identifisere CK2 underlag fra et komplekse biologiske utvalg som en celle eller vev lysate. Denne protokollen utnytter dual co substrat spesifisiteten av CK2 ved bruk av den GTP analogt GTPγS (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) som andre endogene kinaser ikke kan bruke. Effektivt kan kinase til "etiketten" sin underlag i dette eksemplet for påfølgende isolasjon og identifikasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Studiet av kinase-underlaget relasjoner er viktig å få en fullstendig forståelse av funksjonene til disse enzymer og deres nedstrøms mål i både fysiologiske og patologiske tilstander. CK2 er et evolusjonært bevarte serine/threonin kinase med en voksende liste av hundrevis av underlag involvert i flere cellulære prosesser. På grunn av pleiotropic egenskaper, identifisere og karakterisere et omfattende sett av CK2 underlag er spesielt utfordrende og forblir et hinder i studiet av dette viktige enzymet. For å møte denne utfordringen, har vi utviklet en allsidig eksperimentelle strategi som aktiverer målrettet berikelse og identifikasjon av antatte CK2 underlag. Denne protokollen utnytter unike doble co substrat spesifisiteten av CK2 tillater for bestemte thiophosphorylation av sin underlag i en celle eller vev lysate. Disse substrat proteiner er senere alkylated, immunoprecipitated, og identifiseres av flytende kromatografi/tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vi har brukt denne tilnærmingen å kunne identifisere CK2 underlag fra Drosophila eggstokkene og her vi utvide bruken av denne protokollen til menneskelig glioblastom celler, illustrerer tilpasningsevne denne metoden til å undersøke den biologiske rollene til denne kinase i ulike modell organismer og eksperimentelle systemer.

En skjematisk diagram av den eksperimentelle prosedyren finnes i figur 1. Underliggende grunnlaget for teknikken er uvanlig mulighet til CK2 å bruke GTP for phosphoryl gruppe overføring. Tillegg av eksogene CK2 holoenzyme sammen med GTP analog, GTPγS, til en celle lysate resulterer i thiophosphorylation av endogene CK2 underlag. Påfølgende behandling av det lysate med alkylating reagens p- nitrobenzyl mesylate (PNBM) genererer en thiophosphate e...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Målet med denne protokollen er etiketten, berike og identifisere underlag av protein kinase CK2 fra et komplekse biologiske utvalg som en celle lysate eller vev homogenate. Denne metoden bruker unike aspekter av CK2 biologi for dette formålet.

Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Denne protokollen tillater spesifikk merking og påfølgende berikelse og identifisering av endogene CK2-substrater fra en kompleks biologisk prøve som en celle eller vevslylat. Denne metoden kan brukes på en hvilken som helst celletype eller vev. Dermed tilrettelegge, studiet av CK2 i ulike biologiske sammenhenger.Å demonstrere prosedyren vil være John Chojnowski, en utdannet student fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, mekanisk lyse vev prøven eller kultiverte celler som beskrevet i tekstprotokollen for å samle totalt 900 mikroliter prøve. Sentrifuge på 17, 500 ganger tyngdekraften og på fire grader celsius i tre minutter.Deretter overfører du 270 mikroliter av supernatanten til hver av tre nye 1,7 milliliter mikrocentrifuge rør. Fjern 40 mikroliter av de gjenværende supernatantene som skal brukes som en inngangskontroll, og overfør den til et nytt rør. Plasser alle prøvene på is.Først merker du hvert av de tre prøverørene som vist her. Til Kinase Reaction tube, legg til 2,7 mikroliter av CK2 og 2,7 mikroliter på 2,5 millimolar GTPgammaS. Knips røret for å blande, og legg det umiddelbart på is.Til GTPgammaS bare rør, legg til 2,7 mikroliter på 2,5 millimolar GTPgammaS, og 2,7 mikroliter lysis buffer. Knips dette røret for å blande, og legg det umiddelbart på is. Til PNBM Only tube legge til 5,4 mikroliter lysis buffer.Knips røret for å blande, og legg det umiddelbart på is. Inkuber alle tre rørene i et vannbad ved 30 grader Celsius i ett minutt. Etter dette legger du til 13,5 mikroliter PNBM ved 12 milligram per milliliter til hvert rør.Inverter rørene for å blande prøvene, og inkuber prøvene ved romtemperatur i en time. Mens prøvene inkuberer, merker du hver av kolonnene for at prøven skal lastes inn, som vist her. Klargjør kolonnene ved å invertere hver kolonne flere ganger for å bruke Sephadex G-25-harpiksen på nytt i lagringsbufferen.Fest hver kolonne til et klemmestativ, og la den sitte uforstyrret i ca. fem minutter for å la harpiksen avgjøre. Deretter plasserer du et rør under den nederste åpningen av hver kolonne. Fjern hettene fra både toppen og bunnen av hver kolonne, slik at lagringsbufferen kan renne inn i rørene ved tyngdekraften.Når lagringsbufferen er tømt, legger du til ca. 2,7 milliliter Lysis Buffer i hver kolonne for å likevekte dem, og sørg for å samle inn og kaste strømmen gjennom. Gjenta denne prosessen med å legge til Lysis Buffer og forkaste flyten gjennom, tre ganger. Last inn hvert eksempel i den respektive kolonnen for å begynne.Samle og kast strømmen gjennom. Tilsett 420 mikroliter lysisbuffer i hver kolonne for å vaske prøvene. La Lysisbufferen filtrere gjennom kolonnen, og samle inn og forkaste flyten gjennom.Plasser deretter rørene på plass under hver kolonne for eksempelsamling. Legg til 500 mikroliter lysisbuffer i hver kolonne for å fjerne prøvene. Samle strømmen gjennom, som nå inneholder en beriket populasjon av tiofosforylert og alkylerte CK2-substrater i kinasereaksjonen.GTPgammaS eneste reaksjonen vil inneholde substrater tiofosforylert og alkylert av en hvilken som helst endogene CK2 tilstede. PNMB bare reaksjonen vil inneholde bakgrunn alkylerte proteiner. Fjern 80 mikroliter fra hver Elution som en Elution Input Control-prøve.Deretter deler du hver prøve i to rør som hver inneholder 200 mikroliter. Merk hvert av rørene for å være enten anti-tiofosfat ester eller immunoglobulin G, som vist her. Tilsett 2,8 mikrogram anti-tiofosfat ester antistoff til hver av anti-tiofosfat ester rør.Legg til 2,8 mikrogram Isotype Control antistoff til hvert av IGG-rørene. Plasser deretter rørene på en rotator ved fire grader Celsius i to timer. I løpet av de siste 15 minuttene av prøveinkubasjonen, bruk et rent barberblad til å kutte enden av en P200 pipettespiss for å øke målerstørrelsen.Umiddelbart før bruk, kort virvel lagringsrøret som inneholder agarose perler. Bruk den kuttede pipettespissen til å overføre 100 mikroliter av perlene slurry per immunforedrag til et nytt 1,7 milliliter mikrocentrifugerør. Det er viktig å virvle perlene før hver overføring for å forhindre at perler bosetter seg.Sentrifuger rørene på 17, 500 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i ett minutt. Fjern og kast overnatanten. Resuspend perlene ved å legge til 200 mikroliter lysis buffer og kort virvlende å blande.Gjenta denne prosessen med sentrifugering og vask perlene tre ganger. Etter den endelige vasken, legg perlene på is til de er klare til å fortsette. Når prøvene er ferdig med å inkubere, sentrifuger dem på 17, 500 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i tre minutter.Deretter overfører du 200 mikroliter av hver prøve til rørene som inneholder de vasket perlene. Plasser rørene på en rotator ved fire grader Celsius i en time. Deretter sentrifuger rørene på 17, 500 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i ett minutt.Fjern 40 mikroliter fra hver supernatant for å spare som en uttømmingskontroll. Fjern og kast resten av det overnaturlige, vær forsiktig så du ikke forstyrrer perlene. Vask prøvene ved å legge til 200 mikroliter lysisbuffer til hver og virvler kort.Sentrifuge ved 17, 500 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i ett minutt, kaster supernatant. Gjenta denne vaske- og sentrifugeringsprosessen tre ganger, og ta vare på å ikke forstyrre perlene. Etter dette legger du til 50 mikroliter 2X prøvebuffer til hver prøve som inneholder perler.For alle andre eksempler, som inkluderer inndatakontrollen, Elution-inndatakontrollene og uttømmingskontrollene, legger du til 8 mikroliter med 6X prøvebuffer. Pipette hvert rør opp og ned for å blande med unntak av rør som inneholder perler, og varme alle prøver på 95 grader Celsius i fem minutter før du fortsetter med SDS-PAGE. For å vurdere om immunforutsigelse var vellykket, kjør 25 til 30 mikroliter av hver prøve som ble unnsluppet fra perler på en egen 12,5% polyakrylamidgel.Beis hver gel med Coomassie Blue for å visualisere berikede proteiner fra ulike stadier av eksperimentell protokoll. Ved hjelp av nye, rene barberblad, forsiktig avgiftsdirektoratet noen unike band som finnes i kinase reaksjon anti-tiofosfat ester IP Lane mens du gjør oppmerksom på sine omtrentlige molekylvekter. Et nytt barberblad skal brukes for hvert unike bånd.Det underliggende grunnlaget for denne teknikken er denne teknikken er CK2s uvanlige evne til å bruke GTP for fosforgruppeoverføring. Tilsetning av eksogene CK2 holoenzym sammen med GTP analog, GTPgammaS, til en cellelylat, resulterer i en tiofosforylering av endogene CK2 substrater. Etterfølgende behandling av lysatet med alkylerende reagens p-Nitrobenzyl mesylat genererer tiofosfat ester moiety på disse spesifikke substrat proteiner, som deretter kan immunoprecipitated ved hjelp av en anti-tiofosfat ester antistoff og til slutt identifisert av Massespektrometri.I de representative positive resultatene som ble vist her, var CK2-avhengig, tiofosforylering og påfølgende alkylering vellykket. Som forventet observeres et forbedret anti-tiofosfatestersignal fra vestlig blotting bare i kjørefeltet som inneholder den komplette kinasereaksjonen, og ikke bare i GTPgammaS og PNMB bare behandlede prøver. En Coomassie Blå farget gel av immunprecipitated og hentydet proteiner, viser også et positivt resultat.Som flere unike band er tydelig bare i anti-tiofosfat ester IP Lane, der lysate ble inkubert med eksogene CK2 og GTPgammaS. Det merkede båndet blir deretter fjernet fra gelen og sendt for proteinidentifikasjon ved massespektrometri. Etter denne prosedyren må antatte CK2-substrater identifisert av en massespektrometri valideres ved hjelp av en ekstra tilnærming, for eksempel ved CK2-avhengig fosforylering i en standard in vitro kinaseanalyse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse metode for High-throughput identifisering av proteiner samspill med et kjernefysisk kofaktor Bruke LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikasjon av havet Lamprey feromoner bruker Bioassay-guidede fraksjoneres

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...