Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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Este trabalho foi financiado em parte por uma subvenção da Comunidade Universal do realce de pesquisa do departamento da saúde de Pensilvânia para T.I.S.

Nota: Certifique-se que os materiais necessários estão disponíveis e devidamente preparados (ver Tabela de materiais).
1. preparação
<ol><li>Lyse mecanicamente a amostra de tecido (1-2 mg de tecido em 100 µ l de tampão de Lise, tabela 1) ou cultura de células (placa de 10 cm que é confluente de 80-90% em 350 µ l de tampão de Lise), com o objetivo de coletar um total de 900 µ l de amostra para o experimento. Note que este volume é em ligeiro exce...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Aqui, descrevemos um método relativamente simples e bioquímico para identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa. Os passos críticos do presente protocolo são baseados nas propriedades enzimáticas incomuns de CK2 e incluem thiophosphorylation CK2 dependente das proteínas de substrato específico usando GTPγS e sua subsequente imunoprecipitação e identificação. Com estes resultados, nós Demonstramos a utilidade e versatilidade desta abordagem como temos agora apli...

Quinase de proteína é componentes-chave de cascatas de transdução de sinal. Fosforilação de proteínas de substrato por estas enzimas elicia respostas biológicas que regulam eventos críticos, controlando a divisão celular, metabolismo e diferenciação, entre outros. CK2 é uma quinase serina/treonina ubiquitously expressa, acidófilo que é conservada do fermento aos seres humanos e que tem um papel importante em muitos processos celulares, variando de regulamento transcriptional a progressão do ciclo celular a apoptose1 ,2,3. A enzima é uma heterotetramer composta por dois α catalítico (ou α') subunidades e dois de subunidades reguladoras β4. Além de ser altamente pleiotrópicos, CK2 exibe dois outras incomuns características que complicam a sua análise, ou seja, atividade constitutiva5 e especificidade de substrato co dupla6. Esta última Propriedade dota CK2 com a capacidade de usar o GTP, bem como ATP por fosforilação de proteínas de substrato.
Exclusão genética das subunidades catalíticas ou regulamentares da CK2 em camundongos resulta em embrionária letalidade indicando que ele tem um papel crucial durante o desenvolvimento e organogênese7,8. CK2 também é overexpressed em vários tipos de câncer e, portanto, representa um promissor alvo terapêutico9,10,11. Com efeito, inibidores específicos dessa atividade de quinase CK2 alvo estão atualmente sob investigação por este propósito12,13,14. Enquanto a inibição da CK2 é uma opção viável, dada a sua natureza pleiotrópicos, alternativa e talvez a abordagem mais racional seria alvo de substratos CK2 críticos que sustentam a progressão de certos tipos de câncer. Portanto, o abrangente identificação e caracterização das proteínas de substrato CK2 seria um benefício significativo para elucidar as funções específicas deste quinase dentro de um determinado tipo de tecido ou tumor.
Aqui, descrevemos um método bioquímico versátil para identificar substratos CK2 de uma amostra biológica complexa como uma célula ou tecido lisado. Este protocolo aproveita a especificidade de substrato co dual de CK2 pelo uso do análogo de GTP GTPγS (guanosina 5'-[γ-thio]triphosphate) que não podem usar outras cinases endógenas. Efetivamente, isso permite que a quinase de "rotular" seus substratos dentro desta amostra para posterior isolamento e identificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

O estudo das relações de quinase-substrato é essencial para uma compreensão completa das funções de enzimas e suas metas a jusante em Estados fisiológicos e patológicos. CK2 é uma quinase serina/treonina evolutivamente conservada com uma lista crescente de centenas de substratos envolvidos em vários processos celulares. Devido a suas propriedades pleiotrópicos, identificando e caracterizando um conjunto abrangente de substratos CK2 tem sido particularmente desafiador e continua a ser um obstáculo no estudo desta importante enzima. Para responder a este desafio, criámos uma estratégia experimental versátil que permite o enriquecimento de alvo e identificação de substratos de CK2 putativos. Este protocolo aproveita a único dual co especificidade de CK2 permitindo lisado thiophosphorylation específica de seus substratos em uma célula ou tecido. Estas proteínas de substrato são posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por espectrometria de massa de tandem/cromatografia líquida (LC-MS/MS). Temos anteriormente usado essa abordagem para identificar com sucesso CK2 substratos de Drosophila ovários e aqui nós estendemos a aplicação do presente protocolo para células de glioblastoma humano, ilustrando a capacidade de adaptação desse método para investigar a papéis biológicos deste quinase em vários organismos modelo e sistemas experimentais.

Um diagrama esquemático do procedimento experimental é fornecido na Figura 1. A base subjacente da técnica é a capacidade incomum de CK2 usar GTP para transferência de grupo de fosforilo. Adição de exógenos CK2 holoenzima, juntamente com o análogo de GTP, GTPγS, para um lisado celular resulta em thiophosphorylation de substratos endógenos de CK2. Tratamento subsequente do lisado com o alquilantes reagente p- nitrobenzil mesilato (PNBM) ger...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

O objetivo do presente protocolo é rotular, enriquecer e identificar substratos de proteína quinase CK2 de uma amostra biológica complexa como um lisado celular ou homogeneizado de tecido. Este método utiliza aspectos únicos da biologia CK2 para essa finalidade.

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Este protocolo permite a rotulagem específica e posterior enriquecimento e identificação de substratos ck2 endógenos de uma amostra biológica complexa, como uma célula ou tecido lysate. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou tecido. Facilitando, o estudo do CK2 em diversos contextos biológicos.Demonstrando o procedimento será John Chojnowski, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, mecanicamente, lise a amostra de tecido ou células cultivadas conforme descrito no protocolo de texto para coletar um total de 900 microlitadores de amostra. Centrífuga a 17.500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por três minutos.Em seguida, transfira 270 microlitadores do supernaente para cada um dos três novos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Remova 40 microliters do supernatante restante para ser usado como controle de entrada e transfira-o para um novo tubo. Coloque todas as amostras no gelo.Primeiro, rotule cada um dos três tubos de amostra, como mostrado aqui. Ao tubo Kinase Reaction, adicione 2,7 microliters de CK2 e 2,7 microliters de 2,5 mililitros GTPgammaS. Flick o tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo.Apenas ao tubo GTPgammaS, adicione 2,7 microliters de 2,5 mililitros GTPgammaS e 2,7 microliters de Lysis Buffer. Flick este tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo. Ao tubo PNBM apenas adicione 5,4 microliters de Lysis Buffer.Flick o tubo para misturar, e imediatamente colocá-lo no gelo. Incubar os três tubos em um banho de água a 30 graus Celsius por um minuto. Depois disso, adicione 13,5 microliters de PNBM a 12 miligramas por mililitro em cada tubo.Inverta os tubos para misturar as amostras e incubar as amostras à temperatura ambiente por uma hora. Enquanto as amostras estão incubando, rotule cada uma das colunas para que a amostra seja carregada, como mostrado aqui. Prepare as colunas invertendo cada coluna várias vezes para resuspensar a resina Sephadex G-25 no buffer de armazenamento.Coloque cada coluna em um suporte de grampo e deixe-a sentada sem ser perturbada por aproximadamente cinco minutos para deixar a resina se instalar. Em seguida, coloque um tubo abaixo da abertura inferior de cada coluna. Remova as tampas tanto da parte superior quanto da parte inferior de cada coluna, para permitir que o buffer de armazenamento escorra para os tubos por gravidade.Uma vez que o buffer de armazenamento esteja esgotado, adicione aproximadamente 2,7 mililitros de Tampão de Lysis a cada coluna para equilibrá-los, certificando-se de coletar e descartar o fluxo através. Repita este processo de adicionar Lysis Buffer e descartar o fluxo através de três vezes. Para começar, carregue cada amostra em sua respectiva coluna.Coletar e descartar o fluxo através. Adicione 420 microliters de Tampão de Lise a cada coluna para lavar as amostras. Deixe o tampão de lise filtrar a coluna e coletar e descartar o fluxo.Em seguida, coloque os tubos em posição sob cada coluna para coleta de amostras. Adicione 500 microliters de Tampão de Lysis a cada coluna para eluto das amostras. Colete o fluxo através, que agora contém uma população enriquecida de substratos CK2 tiofosforilados e alquilados na reação de quinase.A reação somente gtpgammas conterá substratos tiofosforilados e alquilados por qualquer CK2 endógeno presente. A reação única da PNMB conterá proteínas alquiladas de fundo. Remova 80 microliters de cada Elução como uma amostra de controle de entrada de elução.Em seguida, divida cada amostra em dois tubos que contêm 200 microliters. Rotule cada um dos tubos como sendo ester anti-tiofosfato ou imunoglobulina G, como mostrado aqui. Adicione 2,8 microgramas de anticorpo éster antiofosfato a cada um dos tubos de éster antiofosfato.Adicione 2,8 microgramas de anticorpo isótipo controle a cada um dos tubos IGG. Em seguida, coloque os tubos em um rotador a quatro graus Celsius por duas horas. Durante os últimos 15 minutos da incubação da amostra, use uma lâmina de barbear limpa para cortar a extremidade de uma ponta de pipeta P200 para aumentar o tamanho do medidor.Imediatamente antes do uso, o vórtice brevemente o tubo de armazenamento contendo as contas agarose. Usando a ponta de pipeta cortada, transfira 100 microliters das contas por imunoprecipitação para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. É importante vórtice as contas antes de cada transferência para evitar que as contas se instalem.Centrifugar os tubos a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto. Remova e descarte o supernaspe. Resuspenja as contas adicionando 200 microliters de Lysis Buffer e brevemente vórtice para misturar.Repita este processo de centrifugação e lavagem das contas três vezes. Após a lavagem final, coloque as contas no gelo até que esteja pronto para prosseguir. Quando as amostras terminarem de incubar, centrifuá-las a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por três minutos.Em seguida, transfira 200 microliters de cada amostra para os tubos contendo as contas lavadas. Coloque os tubos em um rotador a quatro graus Celsius durante uma hora. Em seguida, centrifugar os tubos a 17.500 vezes de gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto.Remova 40 microliters de cada supernatante para economizar como um controle de esgotamento. Remova e descarte o restante do supernaspeuta, tomando cuidado para não perturbar as contas. Lave as amostras adicionando 200 microliters de Tampão de Lysis a cada um e vórtice brevemente.Centrífuga a 17.500 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por um minuto, descartando o supernante. Repita este processo de lavagem e centrifugação três vezes tomando cuidado para não perturbar as contas. Depois disso, adicione 50 microliters de tampão de amostra 2X a cada amostra contendo contas.Para todas as outras amostras, que incluem o Controle de Entrada, os Controles de Entrada de Elução e os Controles de Esgotamento, adicione 8 microliters de buffer de amostra 6X. Pipeta cada tubo para cima e para baixo para misturar com exceção de tubos contendo contas, e aquecer todas as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos antes de prosseguir com ODS-PAGE. Para avaliar se a imunoprecipitação foi bem sucedida, execute de 25 a 30 microlitres de cada amostra que foi iludida de contas em um gel de poliacrilamida separado de 12,5%.Colorisse cada gel com Coomassie Blue para visualizar proteínas enriquecidas de vários estágios do protocolo experimental. Usando lâminas de barbear novas e limpas, extirpa cuidadosamente quaisquer bandas únicas presentes na reação de quinase anti-tifosfato ér IP Lane enquanto anotam seus pesos moleculares aproximados. Uma nova lâmina de barbear deve ser usada para cada banda única.A base subjacente desta técnica é esta técnica é a habilidade incomum de CK2 para usar GTP para transferência de grupo fosforila. A adição de holoenzima CK2 exógena junto com o analógico GTP, GTPgammaS, a um lisetê celular, resulta em uma tiafosforilação de substratos CK2 endógenos. O tratamento subsequente do lysato com o reagente alquilante p-Nitrobenzyl mesillate gera moiety ester de tiofosfato nessas proteínas específicas do substrato, que podem então ser imunoprecipitados usando um anticorpo ester anti-tiofosfato e, finalmente, identificado pela espectrometria de Massa.Nos resultados positivos representativos aqui apresentados, foram bem sucedidos os resultados dependentes da CK2, a tiafosforilação e a alquilação subsequente. Como esperado, um sinal de éster anti-tiofosfato aprimorado por manchas ocidentais é observado apenas na pista contendo a reação completa da quinase, e não apenas no GTPgammaS e amostras tratadas apenas por PNMB. Um gel manchado Coomassie Blue das proteínas imunoprecipitadas e aludidas, também demonstram um resultado positivo.Como várias bandas únicas são evidentes apenas no éster anti-tiofosfato IP Lane, no qual o lysate foi incubado com exógeno CK2 e GTPgammaS. A banda marcada é então extirpada do gel e submetida à identificação de proteínas por espectrometria de massa. Após este procedimento, substratos putativos CK2 identificados por espectrometria de massa devem ser validados usando uma abordagem adicional, como por CK2 a fosforilação dependente em um ensaio padrão in vitro quinase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Bioquímica

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...