Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Эта работа частично поддержали Содружества универсальный исследования повышение грант от Пенсильвании Департамента здравоохранения для T.I.S.

Примечание: Убедитесь, что необходимые материалы доступны и должным образом подготовленных (см. Таблицу материалы).
1. Подготовка
<ol><li>Механически лизируйте образцы тканей (1-2 мг ткани в 100 мкл буфера lysis, Таблица 1) или культивируемых клеток (плита 10 см, 80-9...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Здесь мы описываем относительно простой биохимическим методом для выявления субстратов протеинкиназы CK2 от сложных биологических образцов. Важнейшие шаги настоящего Протокола основаны на необычные ферментативных свойств CK2 и включают CK2-зависимой thiophosphorylation конкретного субстрата бе...

Протеинкиназы являются ключевыми компонентами трансдукции сигнала каскады. Фосфорилирование белков субстрата этими ферментами выпытывают биологических реакций, которые регулируют критические события контролируя деление клеток, обмен веществ и дифференциации, среди других. CK2 является повсеместно выражаются, ацидофильной Серин/треонин киназу, сохраняется из дрожжей для людей и который играет важную роль во многих клеточных процессах, начиная от регуляцию клеточного цикла прогрессии к апоптозу1 ,2,3. Фермент является heterotetramer, состоящий из двух каталитических α (или α') субблоков и два регулирующих β субблоков4. В дополнение к весьма плейотропный, CK2 экспонатов два других необычные характеристики усложняют его анализа, а именно учредительные деятельности5 и двойной Сопредседатель субстрата специфика6. Это последний свойство наделяет CK2 с возможностью использования гтп, а также АТФ для фосфорилирование белков субстрата.
Генетическая удаление катализатора или регулирования подразделений CK2 мышей приводит к эмбриональной летальность, указав, что он играет решающую роль во время разработки и Органогенез7,8. CK2 также оверэкспрессировали в нескольких типов рака и таким образом представляет собой многообещающие терапевтические задачи9,10,11. Действительно специфичные ингибиторы что целевой CK2 киназы деятельность в настоящее время проводится расследование для этой цели по12,,1314. В то время как ингибирование CK2 является жизнеспособным вариантом, учитывая его плейотропный характер, альтернативу, и возможно более рациональный подход для критических подложек CK2, которые лежат в основе прогрессирования некоторых видов рака. Таким образом всеобъемлющее определение и характеристика CK2 субстрата белков бы значительные выгоды для выяснения конкретных функцией(ями) этой киназы в пределах определенного типа ткани или опухоли.
Здесь мы описываем универсальный биохимическим методом для выявления CK2 подложек из сложных биологических образцов такие клетки или ткани lysate. Этот протокол использует двойной Сопредседатель субстратная специфичность CK2 использованием GTP аналог GTPγS (гуанозина 5'-[γ-thio]triphosphate), что нельзя использовать другие эндогенные киназы. Это позволяет эффективно киназы «маркировать» его субстратов в этом образце для последующего изоляции и идентификации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Изучение отношения киназы субстрат имеет важное значение для полного понимания функций этих ферментов и их вниз по течению целей в физиологических и патологических государствах. CK2 является эволюционно сохранены Серин/треонин киназу с растущим списком сотен субстратов, участвующих в нескольких клеточных процессах. Благодаря своим свойствам плейотропный выявления и классификации всеобъемлющий набор CK2 субстратов был особенно сложным и остается препятствием в изучении этой важной фермента. Для решения этой проблемы, мы разработали универсальный экспериментальной стратегии, которая позволяет целевых обогащения и идентификации предполагаемого CK2 субстратов. Этот протокол использует уникальный двойной Сопредседатель субстратная специфичность по CK2 позволяя для конкретных thiophosphorylation его субстратов в клетки или ткани lysate. Эти белки субстрата, впоследствии алкилированные, immunoprecipitated и выявленные жидкостной хроматографии/тандемные масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Ранее мы использовали этот подход успешно определить CK2 субстратов из яичников дрозофилы и здесь мы распространить применение настоящего протокола для клеток глиобластомы человека, иллюстрирующие адаптации этого метода для расследования биологической роли этой киназы в различных модельных организмов и экспериментальных систем.

Схема экспериментальной процедуры представлена на рисунке 1. В основе техники лежит необычные способности CK2 использовать GTP для передачи группы фосфорила. Добавление внешних CK2 Холофермент наряду с GTP аналог, GTPγS, lysate клетки приводит к thiophosphorylation эндог?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Цель настоящего Протокола заключается в этикетке, обогатить и идентифицировать субстратов протеинкиназы CK2 от сложный биологический образец например lysate клетки или ткани огневки. Этот метод использует уникальные аспекты CK2 биологии для этой цели.

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Этот протокол позволяет проводить конкретную маркировку и последующее обогащение и идентификацию эндогенных субстратов CK2 из сложного биологического образца, такого как лизат клеток или тканей. Этот метод может быть применен к любому типу клеток или тканей. Таким образом, содействие, изучение CK2 в различных биологических контекстах.Демонстрацией процедуры будет Джон Чойновски, аспирант моей лаборатории. Для начала механически высасыте образец ткани или культурные клетки, как указано в текстовом протоколе, чтобы собрать в общей сложности 900 микролитров образца. Центрифуга при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение трех минут.Затем перенесите 270 микролитров супернатанта на каждую из трех новых микроцентрифугных трубок диаметром 1,7 миллилитра. Удалите 40 микролитров оставшегося супернатанта, которые будут использоваться в качестве входного управления, и перенесите его в новую трубку. Поместите все образцы на лед.Во-первых, этикетка каждого из трех проб труб, как показано здесь. К трубке Реакции Kinase добавьте 2,7 микролитров CK2 и 2,7 микролитров 2,5 миллимолярной GTPgammaS. Флик трубки для смешивания, и сразу же поместить его на лед.К только трубке GTPgammaS добавьте 2,7 микролитров 2,5 миллимолярной GTPgammaS и 2,7 микролитров Lysis Buffer. Флик эту трубку, чтобы смешать, и сразу же поместить его на лед. К PNBM только трубки добавляют 5,4 микролитров Lysis Buffer.Флик трубки для смешивания, и сразу же поместить его на лед. Инкубировать все три трубки в водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение одной минуты. После этого добавьте 13,5 микролитров PNBM по 12 миллиграммов на миллилитр к каждой трубке.Переверните трубки, чтобы смешать образцы, и инкубировать образцы при комнатной температуре в течение одного часа. В то время как образцы инкубируются, отметь каждый из столбцов для загрузки образца, как показано здесь. Подготовь столбцы, несколько раз инвертивировать каждую колонку, чтобы повторно использовать смолу Sephadex G-25 в буфере хранения.Прикрепите каждую колонку к стенду зажима, и пусть он сидит спокойно в течение примерно пяти минут, чтобы смола оседает. Затем поместите трубку под нижнее отверстие каждой колонны. Удалите колпачки как сверху, так и снизу каждого столбца, чтобы буфер хранения стека в трубы под действием силы тяжести.После того, как буфер хранилища истощается, добавьте приблизительно 2,7 миллилитров Lysis Buffer к каждому столбецу, чтобы уравночные их, убедившись, что собирать и отбрасывать поток через. Повторите этот процесс добавления Lysis Buffer и отбрасывания потока через, три раза. Для начала загрузите каждый образец в соответствующий столбец.Соберите и отбросьте поток до конца. Добавьте 420 микролитров Lysis Buffer к каждому столбецу для мытья образцов. Пусть Lysis Buffer фильтрует через столбец, и собирать и отбрасывать поток через.Затем поместите трубки в положение под каждой колонкой для сбора образцов. Добавьте 500 микролитров Lysis Buffer в каждую колонку, чтобы утоить образцы. Соберите поток через, который в настоящее время содержит обогащенную популяцию тиофосфорилированных и алкилатированных субстратов CK2 в реакции киназы.Только реакция GTPgammaS будет содержать субстраты тиофосфорилированные и алкилированные любым эндогенным CK2 настоящее время. Только реакция PNMB будет содержать фоновые алкилатные белки. Удалите 80 микролитров из каждого Elution в качестве образца elution Input Control.Затем разделите каждый образец на две трубки, каждая из которых содержит 200 микролитров. Этикетка каждой из трубок будет либо антитиофосфатного эстера или иммуноглобулина G, как показано здесь. Добавьте 2,8 микрограмма антитиофосфатного эстерного антитела к каждой из антитиофосфатных эстерных трубок.Добавьте 2,8 микрограмма антитела Isotype Control к каждой из трубок IGG. Затем поместите трубки на ротатор при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов. В течение последних 15 минут инкубации образца используйте чистое лезвие бритвы, чтобы отрезать конец наконечника пипетки P200, чтобы увеличить размер датчика.Непосредственно перед использованием, кратко вихрь трубки хранения, содержащей агарозы бусы. Используя наконечник вырезать пипетку, перенесите 100 микролитров бусинки суспензии на иммунопреципитацию в новую микроцентрифугную трубку на 1,7 миллилитра. Важно, чтобы вихрь бусы перед каждой передачей, чтобы предотвратить бисер от урегулирования.Центрифуга труб при 17 500 раз больше тяжести и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты. Удалите и отбросьте супернатант. Resuspend шарики путем добавлять 200 микролитров буфера Lysis и кратко vortexing для того чтобы смешать.Повторите этот процесс центрифугирования и мытья бисера три раза. После окончательной стирки, поместите бисер на лед, пока не будет готов к работе. Когда образцы закончили инкубацию, центрифуга их в 17500 раз тяжести и при четырех градусах по Цельсию в течение трех минут.Затем перенесите 200 микролитров каждого образца в трубки, содержащие вымытые бусины. Поместите трубки на ротатор при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Далее центрифуга труб при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах По Цельсию в течение одной минуты.Удалите 40 микролитров из каждого супернатанта, чтобы сохранить в качестве контроля истощения. Удалите и отбросьте остаток супернатанта, будьте осторожны, чтобы не беспокоить бисер. Вымойте образцы, добавив 200 микролитров Lysis Buffer к каждому и вихревые кратко.Центрифуга при 17 500 раз больше гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты, отбрасывая супернатант. Повторите этот процесс мытья и центрифугации три раза заботясь, чтобы не беспокоить бисер. После этого добавьте 50 микролитров буфера образца 2X к каждому образцу, содержащем бисер.Для всех других образцов, которые включают в себя контроль ввода, elution Input Controls и элементы управления истощением, добавьте 8 микролитров буфера образца 6X. Pipette каждую трубку вверх и вниз, чтобы смешать с исключением труб, содержащих бисер, и тепла все образцы при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем приступить к SDS-PAGE. Чтобы оценить, была ли иммунопреципиентация успешной, запустите от 25 до 30 микролитров каждого образца, который ускользал от бисера на отдельном 12,5%полиакриламинидного геля.Пятно каждого геля с Coomassie Blue для визуализации обогащенных белков из различных стадий экспериментального протокола. Используя новые, чистые лезвия бритвы, тщательно акцизных любых уникальных полос, присутствующих в киназы реакции антитиофосфат эстер IP Lane, делая к сведению их приблизительные молекулярные веса. Для каждой уникальной группы следует использовать новое лезвие бритвы.Основой этого метода является необычная способность CK2 использовать GTP для передачи фосфориловой группы. Добавление экзогенного холоэнзима CK2 вместе с аналогом GTP, GTPgammaS, к лизате клетки, приводит к тиофосфорилированию эндогенных субстратов CK2. Последующее лечение лизата с алкилацией реагента p-Nitrobenzyl мезилат генерирует тиофосфат эстер moiety на этих конкретных белков субстрата, которые затем могут быть immunoprecipitated с помощью анти-тиофосфат эстер антитела и в конечном итоге определены масс-спектрометрии.В репрезентативных положительных результатах, показанных здесь, зависимый CK2, тиофосфорилирование и последующая алкиляция были успешными. Как и ожидалось, усиленный антитиофосфатный эстерный сигнал от западного blotting наблюдается только в полосе, содержащей полную реакцию киназы, а не только в GTPgammaS и PNMB только обработанные образцы. Кумасси Синий окрашенный гель иммунопрофилированных и ссылаясь белков, также демонстрируют положительный результат.Как несколько уникальных полос проявляются только в антитиофосфатном эстер IP Lane, в котором лизат был инкубирован с экзогенными CK2 и GTPgammaS. Отмеченная полоса затем выбана из геля и представлена для идентификации белка с помощью масс-спектрометрии. После этой процедуры, предположительно CK2 субстраты, выявленные масс-спектрометрии должны быть проверены с помощью дополнительного подхода, например, CK2 зависимых фосфорилирования в стандартной пробирке киназы анализа.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Идентификация Морская минога феромоны, используя Bioassay руководствуясь фракционирования

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...