Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
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Este trabajo fue financiado en parte por una beca de la Commonwealth mejora Universal de investigación del Departamento de salud de Pennsylvania a T.I.S.

Nota: Asegúrese de que los materiales están disponibles y preparados adecuadamente (véase Tabla de materiales).
1. preparación
<ol><li>Mecánicamente lyse muestra de tejido (1-2 mg de tejido en 100 μl de tampón de lisis, tabla 1) o cultivadas las células (placa de 10 cm que es 80-90% confluente en 350 μl de tampón de lisis,) con el objetivo de recolectar un total de 900 μl de la muestra para el experimento. Tenga en cuenta que este volumen es en li...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Aquí, describimos un método bioquímico relativamente simple para la identificación de sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja. Los pasos críticos de este protocolo se basan en las propiedades enzimáticas inusuales de CK2 e incluyen thiophosphorylation CK2 dependiente de las proteínas sustrato específico utilizando GTPγS y su posterior inmunoprecipitación e identificación. Con estos resultados, hemos demostrado la utilidad y versatilidad de este enfoque como ahora hemos...

Proteínas quinasas son componentes clave de cascadas de transducción de la señal. Fosforilación de las proteínas sustrato de estas enzimas produce respuestas biológicas que regulan eventos críticos que controla la división celular, el metabolismo y la diferenciación, entre otros. CK2 es una quinasa de serina/treonina ubicuo expresada, acidófilos que se conserva de la levadura a los seres humanos y que juega un papel importante en muchos procesos celulares que van desde la regulación transcripcional de la progresión del ciclo celular apoptosis1 ,2,3. La enzima es un heterotetrámero compuesto de dos α catalítica (o α') subunidades y dos subunidades β regulador4. Además de ser muy pleiotrópico, CK2 exhibe dos otras características inusuales que complican su análisis, es decir, actividad constitutiva5 y de la especificidad de sustrato Co doble6. Esta última propiedad dota la habilidad de usar GTP y ATP para la fosforilación de las proteínas sustrato de CK2.
Supresión genética de las subunidades catalíticas o reglamentarias de CK2 en ratones produce mortalidad embrionaria que indica que desempeña papeles cruciales durante el desarrollo y organogénesis7,8. CK2 también se sobreexpresa en varios tipos de cáncer y representa una prometedora diana terapéutica9,10,11. De hecho, inhibidores específicos quinasa CK2 de destino están actualmente bajo investigación para este propósito12,13,14. Mientras que la inhibición de la CK2 es una opción viable, dada su carácter pleiotrópico, alternativa y quizás más racional sería objetivo crítico sustratos CK2 que subyacen a la progresión de ciertos tipos de cáncer. Por lo tanto, la completa identificación y caracterización de proteínas de sustrato de CK2 sería un beneficio significativo para dilucidar las funciones específicas de esta quinasa en un tipo particular de tejido o tumor.
Aquí, describimos un método versátil bioquímico para la identificación de sustratos de CK2 de una muestra biológica compleja como una célula o un tejido lisado. Este protocolo toma ventaja de la especificidad de sustrato Co dual de CK2 utilizando el análogo del GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) de guanosina que otras quinasas endógenas no pueden utilizar. Esto permite con eficacia la quinasa a sus substratos dentro de esta muestra para posterior aislamiento e identificación de la "etiqueta".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

El estudio de las relaciones del sustrato de la quinasa es esencial tener una comprensión completa de las funciones de estas enzimas y sus objetivos downstream en Estados fisiológicos y patológicos. CK2 es una cinasa serina/treonina evolutivamente conservados con una creciente lista de centenares de sustratos implicados en múltiples procesos celulares. Debido a sus propiedades pleiotrópicos, identificar y caracterizar un conjunto amplio de sustratos de CK2 ha sido particularmente difícil y sigue siendo un obstáculo en el estudio de esta enzima importante. Para abordar este desafío, hemos ideado una estrategia experimental versátil que permite el enriquecimiento objetivo e identificación de posibles sustratos de CK2. Este protocolo aprovecha de la especificidad de sustrato Co dual única de CK2 permitiendo thiophosphorylation específico de sus sustratos en una célula o tejido lisado. Estas proteínas de sustrato son posteriormente alquilados, immunoprecipitated e identificados por líquido cromatografía/tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). Previamente hemos utilizado este enfoque para identificar con éxito CK2 sustratos de Drosophila ovarios y aquí extendemos la aplicación del presente Protocolo a las células de glioblastoma humano, ilustrando la capacidad de adaptación de este método para investigar la funciones biológicas de esta quinasa en diversos organismos modelo y sistemas experimentales.

Un diagrama esquemático del procedimiento experimental se ofrece en la figura 1. La base subyacente de la técnica es la inusual habilidad de CK2 con GTP para la transferencia de grupo fosforilo. Además de holoenzyme de CK2 exógeno junto con el análogo del GTP, GTPγS, a un lisado celular resulta en thiophosphorylation de sustratos de CK2 endógenos. Posterior tratamiento de lisado con lo alquilantes reactivo p- Nitrobencilo mesilato (PNBM) gener...

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Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.

Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Este protocolo permite el etiquetado específico y el posterior enriquecimiento e identificación de sustratos endógenos de CK2 a partir de una muestra biológica compleja como un izado celular o tisular. Este método se puede aplicar a cualquier tipo de célula o tejido. Facilitando así, el estudio de CK2 en diversos contextos biológicos.Demostrando el procedimiento estará John Chojnowski, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar, lice la muestra de tejido o las células cultivadas como se describe en el protocolo de texto para recoger un total de 900 microlitros de muestra. Centrifugar a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante tres minutos.A continuación, transfiera 270 microlitros del sobrenadante a cada uno de los tres nuevos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Retire 40 microlitros del sobrenadante restante para ser utilizado como control de entrada, y transfiételo a un tubo nuevo. Coloque todas las muestras en hielo.En primer lugar, etiquete cada uno de los tres tubos de muestra como se muestra aquí. Al tubo Kinase Reaction, añada 2,7 microlitros de CK2 y 2,7 microlitros de 2,5 mililitros de GTPgammaS. Deslice el tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo sobre hielo.Para el tubo solo GTPgammaS, agregue 2,7 microlitros de 2,5 GTPgammaS mililolares y 2,7 microlitros de Lysis Buffer. Deslice este tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo en hielo. Al tubo PNBM Only añadir 5,4 microlitros de Lysis Buffer.Deslice el tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo sobre hielo. Incubar los tres tubos en un baño de agua a 30 grados centígrados durante un minuto. Después de esto, añadir 13,5 microlitros de PNBM a 12 miligramos por mililitro a cada tubo.Invierta los tubos para mezclar las muestras e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora. Mientras las muestras están incubando, etiquete cada una de las columnas para que la muestra se cargue, como se muestra aquí. Prepare las columnas invirtiendo cada columna varias veces para resuspender la resina Sephadex G-25 en el búfer de almacenamiento.Fije cada columna a un soporte de abrazadera, y déjelo reposar durante aproximadamente cinco minutos para dejar que la resina se asiente. A continuación, coloque un tubo debajo de la abertura inferior de cada columna. Retire las tapas de la parte superior e inferior de cada columna, para permitir que el búfer de almacenamiento drene en los tubos por gravedad.Una vez que el búfer de almacenamiento está agotado, agregue aproximadamente 2,7 mililitros de búfer de lysis a cada columna para equilibrarlos, asegurándose de recopilar y descartar el flujo a través. Repita este proceso de agregar el búfer de lysis y descartar el flujo a través de, tres veces. Para comenzar, cargue cada muestra en su columna respectiva.Recoja y deseche el flujo a través. Agregue 420 microlitros de Lysis Buffer a cada columna para lavar las muestras. Deje que el búfer de lysis filtre a través de la columna y recopile y deseche el flujo.A continuación, coloque los tubos en su posición debajo de cada columna para la recolección de muestras. Agregue 500 microlitros de Lysis Buffer a cada columna para eluir las muestras. Recoger el flujo a través, que ahora contiene una población enriquecida de tiofosforilados y alquilados sustratos de CK2 en la reacción de la quinasa.La reacción de GTPgammaS sólo contendrá sustratos tiofosforilados y alquilados por cualquier CK2 endógeno presente. La reacción PNMB sólo contendrá proteínas alquiladas de fondo. Retire 80 microlitros de cada Elution como muestra de Control de entrada de elución.A continuación, divida cada muestra en dos tubos que contengan cada uno 200 microlitros. Etiquete cada uno de los tubos para que sea éster anti tiofosfato o inmunoglobulina G, como se muestra aquí. Añadir 2,8 microgramos de anticuerpos anti-tiofosfato éster a cada uno de los tubos de éster anti-tiofosfato.Añadir 2,8 microgramos de anticuerpos de control de isotipos a cada uno de los tubos IGG. A continuación, coloque los tubos en un rotador a cuatro grados Centígrados durante dos horas. Durante los últimos 15 minutos de la incubación de la muestra, utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar el extremo de una punta de pipeta P200 para aumentar el tamaño del medidor.Inmediatamente antes de su uso, vórtice brevemente el tubo de almacenamiento que contiene las perlas de agarosa. Con la punta de la pipeta cortada, transfiera 100 microlitros de las perlas por inmunoprecipitación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Es importante vórtices las perlas antes de cada transferencia para evitar que las perlas se asienten.Centrifugar los tubos a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire y deseche el sobrenadante. Resuspender las perlas mediante la adición de 200 microlitros de Lysis Buffer y brevemente vórtice para mezclar.Repita este proceso de centrifugar y lavar las cuentas tres veces. Después del lavado final, coloque las cuentas sobre hielo hasta que estén listas para proceder. Cuando las muestras hayan terminado de incubar, centrifugarlas a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante tres minutos.A continuación, transfiera 200 microlitros de cada muestra a los tubos que contienen las perlas lavadas. Coloque los tubos en un rotador a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar los tubos a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto.Retire 40 microlitros de cada sobrenadante para guardarlos como control de agotamiento. Retire y deseche el resto del sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar las cuentas. Lave las muestras añadiendo 200 microlitros de Lysis Buffer a cada uno y vórtices brevemente.Centrífuga a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto, descartando el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación tres veces teniendo cuidado de no molestar las cuentas. Después de esto, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 2X a cada muestra que contenga perlas.Para todas las demás muestras, que incluyen el control de entrada, los controles de entrada de elución y los controles de agotamiento, agregue 8 microlitros de búfer de muestra 6X. Pipetear cada tubo hacia arriba y hacia abajo para mezclar con la excepción de los tubos que contienen cuentas, y calentar todas las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos antes de proceder con SDS-PAGE. Para evaluar si la inmunoprecipitación tuvo éxito, ejecute de 25 a 30 microlitros de cada muestra que se eludieron de las cuentas en un gel separado de poliacrilamida del 12,5%.Mancha cada gel con Coomassie Blue para visualizar proteínas enriquecidas de varias etapas del protocolo experimental. Usando nuevas cuchillas de afeitar limpias, excúme cuidadosamente cualquier banda única presente en el éster anti tiofosfato de reacción quinasa IP Lane mientras toma nota de sus pesos moleculares aproximados. Se debe utilizar una nueva cuchilla de afeitar para cada banda única.La base subyacente de esta técnica es que esta técnica es la capacidad inusual de CK2 de utilizar GTP para la transferencia de grupos de fósforo. La adición de la holoenzima exógena CK2 junto con el análogo GTP, GTPgammaS, a un lesado celular, da como resultado una tiofosforilación de sustratos endógenos de CK2. El tratamiento posterior del lisato con el reactivo alquilante p-Nitrobenzyl mesilato genera mitad ester de tiofosfato en estas proteínas de sustrato específicas, que luego pueden ser inmunoprecipitados utilizando un anticuerpo éster anti-tiofosfato y, en última instancia, identificado por espectrometría de masas.En los resultados positivos representativos mostrados aquí, CK2 dependiente, tiophosforilación y posterior alquilación tuvieron éxito. Como era de esperar, una señal de éster anti-tiofosfato mejorada por hinchazón occidental se observa sólo en el carril que contiene la reacción quinasa completa, y no en el GTPgammaS solamente y PNMB sólo tratada muestras. Un gel teñido Coomassie Blue de las proteínas inmunoprecipitadas y aludidas, también demuestran un resultado positivo.Como múltiples bandas únicas son evidentes sólo en el éster anti-tiofosfato IP Lane, en el que el izado fue incubado con exógeno CK2 y GTPgammaS. La banda marcada se extirpa del gel y se somete a identificación de proteínas por espectrometría de masas. Después de este procedimiento, los sustratos putativos CK2 identificados por una espectrometría de masas deben validarse mediante un enfoque adicional, como por la fosforilación dependiente de CK2 en un ensayo estándar de quinasa in vitro.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

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Investigación

Bioquímica

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

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Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

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