Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av Commonwealth Universal forskning Enhancement bidrag från Pennsylvania hälsodepartementet till T.I.S.

Anmärkning: Se till att material som behövs är tillgängliga och väl förberedda (se Tabell för material).
1. beredning
<ol><li>Mekaniskt lysera vävnadsprov (1-2 mg vävnad i 100 µL lyseringsbuffert, tabell 1) eller odlade celler (10 cm platta som är 80-90% konfluenta i 350 μl lyseringsbuffert), med målet är att samla in totalt 900 µL prov för experimentet. Observera att denna volym är i smärre överskott av vad som krävs för experimentet be...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Här beskriver vi en relativt enkel biokemiska metod för att identifiera substrat av proteinkinas CK2 från ett komplext biologiskt prov. De kritiska steg i detta protokoll baseras på CK2 ovanliga enzymatisk egenskaper och inkluderar CK2-beroende thiophosphorylation av särskilda substrat proteiner använder GTPγS och deras efterföljande immunoprecipitation och identifiering. Med dessa resultat, har vi visat nytta och mångsidigheten hos denna strategi som vi nu har tillämpat denna strategi i både mänskli...

Proteinkinaser är nyckelkomponenter för signaltransduktion cascades. Fosforylering av substrat proteiner av dessa enzymer framkallar biologiska svar som reglerar kritiska händelser kontrollerar celldelning, ämnesomsättning och differentiering, bland andra. CK2 är en ubiquitously uttryckt, acidofiler serin/treonin-Kinas som är bevarad från jäst till människor och som spelar viktiga roller i många cellulära processer alltifrån Transkriptionsreglering till cellcykelns förlopp till apoptos1 ,2,3. Enzymet är en heterotetramer består av två katalytisk α (eller α') subenheter och två reglerande β-subenheter4. Förutom att vara mycket pleiotropiska, uppvisar CK2 två andra ovanliga egenskaper som komplicerar dess analys, nämligen konstituerande verksamhet5 och dubbla samtidig substrat specificitet6. Detta sistnämnda Boende begåvar CK2 med möjlighet att använda GTP samt ATP för fosforylering av substrat proteiner.
Genetiska radering av katalytisk eller reglerande subunitsna av CK2 hos möss resulterar i embryonal dödlighet som anger att det spelar avgörande roller under utveckling och organogenes7,8. CK2 förekommer också i ökad utsträckning i flera typer av cancer och utgör därmed en lovande terapeutiskt mål9,10,11. Hämmare som målaktiviteten CK2 Kreatinkinas är faktiskt för närvarande under utredning för detta ändamål12,13,14. Medan hämning av CK2 är ett genomförbart alternativ, med tanke på dess pleiotropiska natur, ett alternativ och kanske mer rationellt tillvägagångssätt skulle vara att rikta kritiska CK2 substrat som ligger bakom utvecklingen av vissa cancerformer. Därför, omfattande identifiering och karakterisering av CK2 substrat proteiner skulle vara till stor nytta för belysa specifika funktionerna här Kinas inom en viss typ av vävnad eller tumör.
Här beskriver vi en mångsidig biokemisk metod för att identifiera CK2 substrat från komplexa biologiska prov som en cell eller vävnad lysate. Detta protokoll utnyttjar dubbla samtidig substrat specificitet CK2 genom användning av det GTP analogt GTPγS (guanosin 5'-[γ-thio]triphosphate) som andra endogena kinaser inte kan använda. Detta tillåter effektivt den Kinas att ”märka” dess substrat inom detta prov för efterföljande isolering och identifiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Studien av Kreatinkinas-substrat relationer är avgörande för att få en komplett förståelse för funktionerna hos dessa enzymer och deras nedströms mål i både fysiologiska och patologiska stater. CK2 är en evolutionärt bevarade serin/treonin-Kinas med en växande lista av hundratals substrat inblandade i flera cellulära processer. På grund av dess pleiotropiska egenskaper, att identifiera och karaktärisera en omfattande uppsättning CK2 substrat har varit särskilt utmanande och förblir ett hinder i studien av detta viktiga enzym. För att möta denna utmaning, har vi utarbetat en mångsidig experimentella strategi som möjliggör riktade anrikning och identifiering av förmodad CK2 substrat. Detta protokoll utnyttjar unika dubbla samtidig substrat specificitet CK2 möjliggör specifika thiophosphorylation av dess substrat i en cell eller vävnad lysate. Dessa substrat proteiner är därefter alkylerade, immunoprecipitated, och identifieras av liquid chromatography/tandem masspektrometri (LC-MS/MS). Vi har tidigare använt denna metod att framgångsrikt identifiera CK2 substrat från Drosophila äggstockarna och här vi utsträcka tillämpningen av detta protokoll till mänskliga glioblastoma celler, som illustrerar anpassningsförmåga med denna metod att undersöka den biologiska roller här Kinas i olika modellorganismer och experimentella system.

En Schematisk bild av det experimentella förfarandet ges i figur 1. Underliggande grunden för tekniken är CK2 ovanliga förmåga att använda GTP för phosphorylen grupp överföring. Tillsats av exogen CK2 holoenzyme tillsammans med det GTP analogt, GTPγS, till en cell lysate resulterar i thiophosphorylation av endogena CK2 substrat. Efterföljande behandling av den lysate med den alkylerande reagens p- nitrobenzyl MESYLAT (PNBM) genererar en th...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Syftet med detta protokoll är att märka, berika och identifiera substrat av proteinkinas CK2 från en komplexa biologiska prov som en cell lysate eller vävnad Homogenatet. Denna metod utnyttjar unika aspekter av CK2 biologi för detta ändamål.

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Detta protokoll möjliggör specifik märkning och efterföljande anrikning och identifiering av endogena CK2-substrat från ett komplext biologiskt prov som en cell eller vävnadst lysate. Denna metod kan tillämpas på alla celltyp eller vävnad. Således underlätta, studiet av CK2 i olika biologiska sammanhang.Demonstrera förfarandet kommer att John Chojnowski, en doktorand från mitt laboratorium. Till att börja med, mekaniskt lysa vävnadsprovet eller odlade celler som beskrivs i textprotokollet för att samla in totalt 900 mikroliter prov. Centrifugera vid 17, 500 gånger gravitation och vid fyra grader celsius i tre minuter.Överför sedan 270 mikroliter av supernatanten till var och en av tre nya 1,7 milliliter mikrocentrifugrör. Ta bort 40 mikroliter av den återstående supernatanten som ska användas som inmatningskontroll, och överför den till ett nytt rör. Placera alla prover på is.Först märka var och en av de tre provrören enligt bilden här. Till Kinas reaction-röret, tillsätt 2,7 mikroliter av CK2 och 2,7 mikroliter på 2,5 millimolar GTPgammaS. Snärta röret för att blanda, och omedelbart placera den på is.Till gtpgammaS enda röret, tillsätt 2,7 mikroliter på 2,5 millimolar GTPgammaS, och 2,7 mikroliter av Lys Buffert. Snärta detta rör för att blanda, och omedelbart placera den på is. Till PNBM Endast röret tillsätt 5,4 mikroliter av Lys Buffert.Snärta röret för att blanda, och omedelbart placera den på is. Inkubera alla tre rören i ett vattenbad i 30 grader Celsius i en minut. Efter detta, tillsätt 13,5 mikroliter av PNBM vid 12 milligram per milliliter till varje rör.Invertera rören för att blanda proverna, och inkubera proverna i rumstemperatur i en timme. Medan proverna inkuberar, märka var och en av kolumnerna för provet som ska laddas, som visas här. Förbered kolumnerna genom att invertera varje kolumn flera gånger för att återanvända sephadex G-25-hartset i lagringsbufferten.Fäst varje kolumn på ett klämstativ, och låt den sitta ostört i cirka fem minuter för att låta hartset lägga sig. Därefter placerar du ett rör under den nedre öppningen av varje kolumn. Ta bort locken från både toppen och botten av varje kolumn, så att lagringsbufferten kan rinna ut i rören genom tyngdkraft.När lagringsbufferten är tömd, tillsätt cirka 2,7 milliliter Lysbuffert till varje kolumn för att balansera dem, se till att samla in och kasta flödet genom. Upprepa denna process för att lägga till Lysbuffert och kassera flödet genom, tre gånger. Till att börja, ladda varje prov i dess respektive kolumn.Samla och kasta flödet genom. Tillsätt 420 mikroliter Lysbuffert till varje kolumn för att tvätta proverna. Låt Lysbufferten filtrera igenom kolumnen, och samla in och kasta flödet igenom.Placera sedan rör i läge under varje kolumn för provsamling. Tillsätt 500 mikroliter Lysbuffert till varje kolumn för att elera proverna. Samla flödet genom, som nu innehåller en berikad population av tioforylerat och alkylerade CK2 substrat i kinasreaktionen.Den GTPgammaS enda reaktionen kommer att innehålla substrat tioforylerat och alkyleras av någon endogen CK2 närvarande. Den PNMB enda reaktionen kommer att innehålla bakgrund alkylerade proteiner. Ta bort 80 mikroliter från varje Eluering som ett Elution Input Control-prov.Därefter dela varje prov i två rör som var och en innehåller 200 mikroliter. Märk vart och ett av rören för att vara antingen anti-tiofosfatester eller immunglobulin G, som visas här. Tillsätt 2,8 mikrogram anti-tiofilosfatester antikropp till var och en av anti-tiofosfatesterrören.Tillsätt 2,8 mikrogram Isotype Control-antikropp till var och en av IGG-rören. Placera sedan rören på en rotator vid fyra grader Celsius i två timmar. Under de sista 15 minuterna av provinkubationen, använd ett rent rakblad för att skära av änden på en P200-pipettspets för att öka mätarstorleken.Omedelbart före användning, vortexa kort lagringsröret som innehåller agarospärlorna. Med hjälp av den skurna pipettspetsen överför du 100 mikroliter av pärlornas slurry per immunoprecipitation till ett nytt 1,7 milliliter mikrocentrifugrör. Det är viktigt att virvel pärlorna före varje överföring för att förhindra pärlor från att lösa.Centrifugera rören på 17, 500 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i en minut. Ta bort och kasta supernatanten. Resuspend pärlorna genom att lägga till 200 mikroliter av Lys Buffert och kort virvelning att blanda.Upprepa denna process av centrifugering och tvättning av pärlorna tre gånger. Efter den sista tvätten, placera pärlorna på is tills redo att fortsätta. När proverna har inkuberat färdigt centrifugerar de dem vid 17, 500 gånger gravitationen och vid fyra grader Celsius i tre minuter.Överför sedan 200 mikroliter av varje prov till de rör som innehåller de tvättade pärlorna. Placera rören på en rotator vid fyra grader Celsius i en timme. Därefter centrifugera rören vid 17, 500 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i en minut.Ta bort 40 mikroliter från varje supernatant för att spara som en utarmningskontroll. Ta bort och kassera resten av supernatanten, var noga med att inte störa pärlorna. Tvätta proverna genom att tillsätta 200 mikroliter Lysbuffert till var och en och virvelning en kort stund.Centrifugera vid 17, 500 gånger gravitation och vid fyra grader Celsius i en minut, kasta supernatant. Upprepa denna tvätt och centrifugering process tre gånger var noga med att inte störa pärlorna. Efter detta, tillsätt 50 mikroliter av 2X provbuffert till varje prov som innehåller pärlor.För alla andra prover, som inkluderar indatakontrollen, Elution Input Controls och utarmningskontrollerna, lägger du till 8 mikroliter av 6X Provbuffert. Pipett varje rör upp och ner för att blanda med undantag av rör som innehåller pärlor, och värm alla prover på 95 grader Celsius i fem minuter innan du fortsätter med SDS-PAGE. För att bedöma om immunoprecipitationen lyckades, kör 25 till 30 mikroliter av varje prov som gäckades från pärlor på en separat 12,5%polyakrylamid gel.Stain varje gel med Coomassie Blue att visualisera berikade proteiner från olika stadier av experimentella protokollet. Med hjälp av nya, rena rakblad, noggrant punktskatt alla unika band som finns i kinasreaktion anti-tioofosfat ester IP Lane samtidigt som man noterar deras ungefärliga molekylära vikter. Ett nytt rakblad ska användas för varje unikt band.Den underliggande grunden för denna teknik är denna teknik är den ovanliga förmågan hos CK2 att använda GTP för fosforyl gruppöverföring. Tillägg av exogena CK2 holoenzym tillsammans med GTP analog, GTPgammaS, till en cell lysate, resulterar i en tioofosforylering av endogena CK2 substrat. Efterföljande behandling av lysate med den alkylating reagens p-Nitrobenzyl mesylate genererar tioofosfat ester moiety på dessa specifika substratproteiner, som sedan kan immunoprecipitated med hjälp av en anti-tiofosfat ester antikropp och slutligen identifieras av Mass spectrometry.I de representativa positiva resultat som visas här, CK2 beroende, tioofosforylering och efterföljande alkylering var framgångsrika. Som väntat observeras en förstärkt anti-tiofilosfatestersignal av Western blotting endast i körfältet som innehåller den fullständiga kinasreaktionen, och inte i endast GTPgammaS och PNMB endast behandlade prover. En Coomassie Blue färgade gel av immunoprecipitated och anspelade proteiner, visar också ett positivt resultat.Som flera unika band är uppenbart endast i anti-tiofilosfat ester IP Lane, där lysate inkuberades med exogena CK2 och GTPgammaS. Det markerade bandet är sedan strukits från gelén och lämnas in för proteinidentifiering genom masspektrometri. Efter detta förfarande måste förmodade CK2-substrat som identifieras med en masspektrometri valideras med hjälp av ytterligare ett tillvägagångssätt, såsom genom CK2-beroende fosforylering i en standardin vitro-kinasanalys.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Ett protein framställningsmetod för hög kapacitet Identifiering av proteiner interagerar med en kärnteknisk Cofactor Använda LC-MS / MS-analys

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifiering av havet nejonöga feromoner med hjälp av Bioassay-guidad fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...