Name: identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Bu eser kısmen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı T.I.S. bir İngiliz Milletler Topluluğu evrensel araştırma geliştirme hibe tarafından desteklenmiştir

Not: gerekli malzemeler kullanılabilir ve düzgün hazırlanmış olduğundan emin olun ( Tablo malzemelerigörmek).
1. hazırlık
<ol><li>Mekanik olarak doku örneği (1-2 mg 100 µL lizis arabelleği, Tablo 1doku) koşullar veya toplam 900 µL deney için örnek toplamak için amaç ile hücreleri (10 cm tabak), lizis arabelleği 350 µL % 80-90 birleşmesi olan kültürlü. Bu birim ne aşağıda açıklanan deney için gerekli olduğu hafif fazla olduğ...

<ol>
	<li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2:+structure,+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death.">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li><li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joining+the+cell+survival+squad:+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2).">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li><li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2.">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li><li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2:+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme.">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li><li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme.">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li><li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2.">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li><li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development.">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li><li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality.">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li><li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+in+Cancer:+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target.">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li><li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia.">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li><li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+Kinase+II:+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design.">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li><li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX-4945,+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2,+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy.">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li><li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+casein+kinase+2+inhibitor,+CX-4945,+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies.">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).</li><li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIGB-300,+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo.">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation.">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).</li><li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions.">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li><li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity.">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li><li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis.">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li><li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival:+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells.">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li><li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics.">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).</li><li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow.">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460 (2013).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells.">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li><li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy:+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells.">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li></ol>

Burada, karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden protein kinaz CK2 yüzeylerde tanımlamak için nispeten basit bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol kritik adımları CK2 enzimatik sıradışı özelliklerini temel alan ve CK2 bağlı thiophosphorylation GTPγS ve onların sonraki immunoprecipitation ve kimlik kullanarak belirli yüzey proteinleri içerir. Şimdi bu strateji insan glioblastoma hücreleri ve Drosophila yumurtalık18uyguladığınız gibi bu s...

Protein kinaz sinyal iletim cascades anahtar bileşenleridir. Fosforilasyon tarafından Bu enzim substrat proteinlerin biyolojik yanıt-e doğru kontrol hücre bölünmesi, metabolizma ve farklılaşma, diğerleri arasında kritik olayları düzenleyen ortaya çıkarır. Bu Maya insanlar için korunmuş ve bu transkripsiyon Yönetmeliği hücre döngüsü ilerleme apoptosis1 kadar uzanan birçok hücresel süreçler önemli roller oynar ubiquitously ifade, acidophilic serin/treonin kinaz CK2 olduğunu ,2,3. İki katalitik α oluşan bir heterotetramer enzimdir (veya α') alt birimleri ve iki düzenleyici β alt birimleri4. Son derece pleiotropic olmasının yanı sıra, CK2, analizleri, karmaşık hale iki diğer sıradışı özellikleri Yani bünye etkinlik5 ve ikili ortak substrat özgüllüğü6sergiler. Bu ikinci özellik GTP hem de ATP substrat protein fosforilasyon için kullanma yeteneği ile CK2 endows.
Embriyonik ölümcül geliştirme ve organogenesis7,8sırasında çok önemli roller oynayan gösteren CK2 katalitik veya düzenleyici altbirimden farelerde genetik silinmesiyle sonuçlanır. CK2 de kanser çeşitli overexpressed ve böylece gelecek vaat eden bir terapötik hedef9,10,11temsil eder. Gerçekten de, belirli inhibitörleri bu hedef CK2 kinaz aktivitesi vardır şu anda bu amaç12,13,14soruşturma altında. Süre CK2 inhibisyonu pleiotropic doğası, alternatif verilen uygun bir seçenek ve belki de daha akılcı yaklaşım bazı kanserler ilerlemesini altında yatan kritik CK2 yüzeylerde hedef olacaktır. Bu nedenle, kapsamlı kimlik ve CK2 yüzey proteinleri karakterizasyonu bu kinaz belirli bir doku veya tümör tür içinde belirli function(s) elucidating için önemli yararı olacaktır.
Burada, bir hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden CK2 yüzeylerde tanımlamak için çok yönlü bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı CK2 ikili ortak substrat özgüllüğü GTP analog GTPγS (diğer endojen kinaz kullanamazsınız guanozin 5'-[γ-thio]triphosphate). kullanımı tarafından yararlanır Bu etkili bir şekilde "onun yüzeylerde içinde bu örnek sonraki yalıtım ve kimlik için etiketlemek" kinaz sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2010px;" width="2008">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">12 mg/mL PNBM</td>
			<td style="width:599px;">Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab138910</td>
			<td style="width:406px;">40.5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mM GTP&#947;S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8634-1MG</td>
			<td>5.4 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CK2&#945; (E-7) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-373894</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab22758</td>
			<td>1:1000 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:599px;">ab92570</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge pre-set to 4&#186;C</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis Buffer</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>See recipe below</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal rabbit IgG antibody (isotype control)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S&#160;</td>
			<td>Varies (final concentration 2.8 &#181;g for each sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD MiniTrap Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9180-10</td>
			<td>3 columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein A/G Plus Agarose Beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2003</td>
			<td>600 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant human CK2 holoenzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6010S</td>
			<td>2.7 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator</td>
			<td>Labnet: Mini Labroller</td>
			<td>Mini Labroller SKU# H5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T98G human glioblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath pre-set to 30&#186;C</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>H20 Bath Series Model# SWB15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of novel ck2 kinase substrates using a versatile biochemical approach

Kinaz-substrat ilişkileri Bu enzimler ve aşağı akım hedeflerine fizyolojik ve patolojik Birleşik Devletleri fonksiyonları tam bir anlayış kazanmak için önemli bir çalışmadır. CK2 bir evrimsel korunmuş serin/treonin kinaz ile gittikçe artan sayıda yüzeylerde birden çok hücresel süreçlerinde yer alan yüzlerce var. Pleiotropic özellikleri nedeniyle belirlenmesi ve CK2 yüzeylerde kapsamlı bir dizi karakterize özellikle zor olmuştur ve bu önemli enzim çalışmada bir engel olarak kalır. Bu sorun adrese hedeflenen zenginleştirme ve sözde CK2 yüzeylerde tanımlaması sağlayan çok yönlü bir deneysel strateji geliştirmiştir. Bu iletişim kuralı, bir hücre veya doku onun yüzeylerde özel thiophosphorylation için lysate izin benzersiz Çift ortak substrat özgüllüğü CK2 yararlanır. Daha sonra bu substrat proteinler vardır, immunoprecipitated, alkylated ve sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) tarafından tespit edilmiştir. Biz daha önce bu yaklaşım başarılı bir şekilde CK2 yüzeylerde Drosophila yumurtalıklar üzerinden tanımlamak için kullanılan ve burada araştırmak için bu yöntemin uyum gösteren insan glioblastoma hücreleri, bu iletişim kuralını uygulamaya uzatmak Bu kinaz çeşitli model organizmalar ve deneysel sistemleri biyolojik rolleri.

Deneysel işlemin bir şematik diyagramı şekil 1' de verilmiştir. Temel teknik GTP phosphoryl grup transferi için alışılmadık kullanabilme, CK2 temelidir. Ayrıca eksojen CK2 holoenzyme ile birlikte bir hücreye lysate GTP analog, GTPγS, endojen CK2 yüzeylerde thiophosphorylation içinde sonuçlanır. Sonraki tedavi etmen reaktif p- nitrobenzyl (PNBM) mesylate ile lysate, o zaman bir anti-thiophosphate ester antikor kullanarak immunoprecipi...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach at JoVE.com

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Bu protokol, hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten endojen CK2 substratlarının özel etiketleme ve sonraki zenginleştirme ve tanımlanmasına olanak sağlar. Bu yöntem herhangi bir hücre tipine veya dokuya uygulanabilir. Böylece, çeşitli biyolojik bağlamlarda CK2 çalışma kolaylaştırıcı.Prosedürü gösteren John Chojnowski, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, toplam 900 mikrolitre numune toplamak için metin protokolünde belirtildiği gibi doku örneğini veya kültürlü hücreleri mekanik olarak inceleyin. Santrifüj 17, 500 kat yerçekimi ve üç dakika boyunca dört santigrat derecede.Daha sonra, supernatant 270 mikrolitre her üç yeni 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere kalan supernatant 40 mikrolitre çıkarın ve yeni bir tüp aktarın. Tüm örnekleri buza yerleştirin.İlk olarak, burada gösterildiği gibi üç örnek tüpün her birini etiketlayın. Kiaz reaksiyon tüpüne 2,7 mikrolitre CK2 ve 2,7 mikrolitre 2,5 milimolar GTPgammaS ekleyin. Karıştırmak için tüp flick ve hemen buz üzerine yerleştirin.GTPgammaS'a sadece tüp, 2,7 mikrolitre 2,5 milimolar GTPgammaS ve 2,7 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Karıştırmak için bu tüpü flick ve hemen buz üzerine yerleştirin. PNBM sadece tüp Lysis Tampon 5.4 mikrolitre ekleyin.Karıştırmak için tüp flick ve hemen buz üzerine yerleştirin. Bir dakika için 30 santigrat derece bir su banyosunda her üç tüp kuluçka. Bundan sonra, her tüp için mililitre başına 12 miligram PNBM 13,5 mikrolitre ekleyin.Örnekleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Örnekler kuluçkaya yatarken, burada gösterildiği gibi, numunenin yüklenmesi için sütunların her birini etiketleyin. Depolama arabelleğindeki Sephadex G-25 reçinesini yeniden askıya almak için her sütunu birkaç kez ters çevirerek sütunları hazırlayın.Her sütunu bir kelepçe standına takın ve reçinenin yerleşmesini sağlamak için yaklaşık beş dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Ardından, her sütunun alt açılışının altına bir tüp yerleştirin. Depolama arabellesinin yerçekimi tarafından tüplere akmasını sağlamak için, her sütunun hem üstünden hem de altındaki kapakları çıkarın.Depolama arabelleği tükendikten sonra, her sütuna yaklaşık 2,7 mililitre Lysis Arabelle ekleyin ve akışı topladığından ve atdığından emin olun. Bu Lysis Arabellek ekleme ve akışı üç kez atma işlemini tekrarlayın. Başlamak için, her örneği kendi sütununa yükleyin.Akışı toplayın ve atın. Örnekleri yıkamak için her sütuna 420 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Lysis Arabelleği sütun üzerinden filtre ve toplamak ve akışı atmak sağlar.Ardından, örnek toplama için tüpleri her sütunun altına yerleştirin. Örnekleri elemek için her sütuna 500 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Şimdi kizaz reaksiyonu içinde kiyofosforile ve alkillenmiş CK2 substratları zenginleştirilmiş bir nüfus içeren aracılığıyla akışı toplamak.GTPgammaS sadece reaksiyon herhangi bir endojen CK2 mevcut tarafından tiyofosforile ve alkillenmiş substratlar içerecektir. PNMB sadece reaksiyon arka plan alkillenmiş proteinler içerecektir. Her Bir Elution Giriş Kontrolü örneği olarak her Birlasyondan 80 mikrolitre çıkarın.Ardından, her bir örneği 200 mikrolitre içeren iki tüpe bölün. Burada gösterildiği gibi tüplerin her birini anti-tiofosfat ester veya immünglobulin G olarak etiketleyin. Anti-tiophosphate ester tüplerinin her birine 2,8 mikrogram anti-tiofosfat ester antikoru ekleyin.IGG tüplerinin her birine 2,8 mikrogram Isotip Control antikor ekleyin. Daha sonra tüpleri dört derece santigrat derecede iki saat boyunca bir rotator üzerine yerleştirin. Numune kuluçkasının son 15 dakikası boyunca, gösterge boyutunu artırmak için P200 pipet ucunu kesmek için temiz bir jilet kullanın.Hemen önce kullanımdan önce, kısaca agarose boncuk içeren depolama tüpü girdap. Kesme pipet ucunu kullanarak, immünopredibaşına boncuk bulamacının 100 mikrolitresini yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Her transferden önce boncukların yerleşmesini önlemek için boncukları girdaplamak önemlidir.Tüpleri 17, 500 kat yerçekimive dört santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Lysis Tampon 200 mikrolitre ekleyerek boncukre askıya ve kısaca karıştırmak için girdap.Bu santrifüj işlemini üç kez tekrarlayın ve boncukları yıkanın. Son yıkamadan sonra, devam etmeye hazır olana kadar buz üzerine boncuk yerleştirin. Örnekler kuluçkaya yatıldığında, onları 17, 500 kat yerçekimi ve dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin.Daha sonra, her numunenin 200 mikrolitresini yıkanmış boncukları içeren tüplere aktarın. Tüpleri bir saat boyunca dört derece santigrat derecede bir rotator üzerine yerleştirin. Sonra, tüpleri 17, 500 kat yerçekiminde ve dört santigrat derecede bir dakika santrifüj edin.Tükenme kontrolü olarak kaydetmek için her supernatant 40 mikrolitre çıkarın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin, supernatant'ın geri kalanını çıkarın ve atın. Örnekleri her birine 200 mikrolitre Lysis Tampon ekleyerek ve kısa bir süre girdap yaparak yıkayın.17, 500 kat yerçekimi ve bir dakika için dört santigrat derece, supernatant atarak santrifüj. Bu yıkama ve santrifüj işlemini boncukları rahatsız etmemeye özen alarak üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, boncuk içeren her örneğe 50 mikrolitre 2X numune arabelleği ekleyin.Giriş Kontrolü, Elütion Giriş Kontrolleri ve Tükenme Kontrolleri dahil olmak üzere diğer tüm örnekler için, 6X Örnek Arabellek 8 mikrolitre ekleyin. Pipet her tüp yukarı ve aşağı boncuk içeren tüpler dışında karıştırmak için, ve SDS-PAGE ile devam etmeden önce beş dakika boyunca 95 santigrat derece tüm örnekleri ısıtın. İmmünenyağış başarılı olup olmadığını değerlendirmek için, ayrı bir% 12.5 poliakrilamid jel üzerinde boncuklar kaçan her örnek 25-30 mikrolitre çalıştırın.Deneysel protokolün çeşitli aşamalarından zenginleştirilmiş proteinleri görselleştirmek için her jeli Coomassie Blue ile lekeleyin. Yeni, temiz jiletler kullanarak, yaklaşık molekül ağırlıklarını not alırken kizreaksiyonanti-tiyosfat ester IP Lane mevcut herhangi bir benzersiz bantları dikkatle çıkarmak. Her benzersiz bant için yeni bir jilet kullanılmalıdır.Bu tekniğin altında yatan temel, CK2'nin fosforlu grup transferi için GTP'yi kullanabilmesidir. GTP analogu GTPgammaS ile birlikte eksojen CK2 holoenziminin hücre lysate'sine eklenmesi, endojen CK2 substratlarının tiyofosforilasyonla sonuçlanır. Alkilleyici reaktif p-Nitrobenzyl mesylate ile lysate sonraki tedavi bu özel substrat proteinlerüzerinde tiyofosfat ester moiety oluşturur, daha sonra bir anti-tiyofosfat ester antikor kullanılarak immünpresipite edilebilir ve sonuçta Kütle spektrometresi ile tespit.Burada gösterilen temsili olumlu sonuçlarda CK2 bağımlı, tiyofosforilasyon ve müteakip alkilasyon başarılı oldu. Beklendiği gibi, Batı lekeleme tarafından geliştirilmiş bir anti-tiyofosfat ester sinyali sadece tam kiyaz reaksiyonu içeren şeritte gözlenir, sadece GTPgammaS ve PNMB sadece tedavi örnekleri nde değil. Bir Coomassie Mavi lekeli jel immünopsipitated ve ima proteinler, ayrıca olumlu bir sonuç göstermektedir.Birden fazla benzersiz bantlar sadece anti-tiyofosfat ester IP Lane belirgin olduğu gibi, hangi lysate eksojen CK2 ve GTPgammaS ile kuluçka yada oldu. İşaretli bant daha sonra jelden çıkarılarak kütle spektrometresi ile protein tanımlaması için gönderilir. Bu prosedürü takiben, kütle spektrometresi ile tanımlanan putatif CK2 substratları, standart in vitro kisaz testinde CK2'ye bağımlı fosforilasyon gibi ek bir yaklaşımla doğrulanmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...