Name: pretargeted radioimmunotherapy based on the inverse electron demand diels-alder reaction
Uploaded: 2019-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction at JoVE.com

Os autores agradecer Dr. Jacob Houghton conversas úteis. Os autores também gostaria de agradecer o NIH para seu financiamento generoso (R00CA178205 e U01CA221046).

Todos na vivo as experiências com animais descritas neste trabalho foram realizadas de acordo com protocolos aprovados e executadas sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center e Hunter College Institucional cuidados com animais e uso de comitês (IACUC).
1. a preparação do huA33-TCO
Nota: A síntese de huA33-TCO tem sido relatado anteriormente29. No entanto, para a facilidade do ...

<ol>
	<li>Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapy+of+Cancer+with+Radiolabeled+Antibodies.">Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).</li><li>Goldenberg, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunotherapy+of+B-cell+Lymphomas+with+Iodine-131-labeled+LL2+Monoclonal+Antibody.">Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody.</a> Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).</li><li>Kaminski, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dose+131I-Tositumomab+(Anti-CD20)+Radioimmunotherapy+for+Non-Hodgkin's+Lymphoma:+Adjusting+Radiation+Absorbed+Dose+to+Actual+Organ+Volumes.">High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes.</a> Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).</li><li>Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunotherapy+of+Human+tumours.">Radioimmunotherapy of Human tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).</li><li>Kelly, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Targeting+by+a+Multivalent+Single-Chain+Fv+(scFv)+Anti-Lewis+Y+Antibody+Construct.">Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct.</a> Cancer Biotherapy &#38; Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).</li><li>Yazaki, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Targeting+of+Radiometal+Labeled+Anti-CEA+Recombinant+T84.66+Diabody+and+T84.66+Minibody:+Comparison+to+Radioiodinated+Fragments.">Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).</li><li>van Duijnhoven, S. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabody+Pretargeting+with+Click+Chemistry+In+Vivo.">Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).</li><li>Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+Imaging+and+Therapy.">Pretargeted Imaging and Therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).</li><li>Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Step+Targeting+of+Xenografted+Colon+Carcinoma+Using+a+Bispecific+Antibody+and+188Re-Labeled+Bivalent+Hapten:+Biodistribution+and+Dosimetry+Studies.">Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies.</a> Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).</li><li>Green, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Bispecific+Antibody+and+Streptavidin-Targeted+Radioimmunotherapy+for+B-cell+Cancers.">Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers.</a> Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).</li><li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Streptavidin&#8722;Anti-Carcinoembryonic+Antigen+Antibody,+Radiolabeled+Biotin+Pretargeting+Method+for+Radioimmunotherapy+of+Colorectal+Cancer.+Studies+in+a+Human+Colon+Cancer+Xenograft+Model.">Development of a Streptavidin&#8722;Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model.</a> Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).</li><li>Knox, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+Tumor+in+Patients+with+Indium-111-Labeled+Biotin+and+Streptavidin-Conjugated+Antibodies:+Preliminary+Communication.">Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication.</a> Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry.">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li><li>Meyer, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-Based+Pretargeted+PET+Imaging+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry.">18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).</li><li>Rossin, R., L&#228;ppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+Reaction+for+Tumor+Pretargeting:+In+Vivo+Chemistry+Can+Boost+Tumor+Radiation+Dose+Compared+with+Directly+Labeled+Antibody.">Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Pretargeted+Strategy+for+the+PET+Imaging+of+Colorectal+Carcinoma+via+the+Modulation+of+Radioligand+Pharmacokinetics.">Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+In+Vivo+Efficacy+of+Pretargeted+Radioimmunotherapy+Utilizing+Inverse+Electron+Demand+Diels-Alder+Click+Chemistry.">Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).</li><li>Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Mediated+Pretargeted+Radioimmunotherapy+of+Colorectal+Carcinoma.">Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma.</a> Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).</li><li>Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+Bioorthogonal+Inverse+Electron+Demand+Diels-Alder+Cycloaddition+for+Pretargeted+PET+Imaging.">Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).</li><li>Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer+Scaffold+for+the+Amplification+of+In+Vivo+Pretargeting+Ligations.">Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations.</a> Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).</li><li>Cheal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+Pretargeted+Radioimmunotherapy+of+Colorectal+Cancer+Xenografts+in+Mice+Using+Picomolar+Affinity+Y-86-+or+Lu-177-DOTA-Bn+Binding+scFv+C825/GPA33+IgG+Bispecific+Immunoconjugates.">Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates.</a> European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).</li><li>Meyer, J. -. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+Immuno-PET+of+Pancreatic+Cancer:+Overcoming+Circulating+Antigen+and+Internalized+Antibody+to+Reduce+Radiation+Doses.">Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses.</a> Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).</li><li>Kein&#228;nen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeting+of+Internalizing+Trastuzumab+and+Cetuximab+with+a+(18)F-Tetrazine+Tracer+in+Xenograft+Models.">Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).</li><li>Billaud, E. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-flow+Photosynthesis+of+New+Dienophiles+for+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactions.+Potential+Applications+for+Pretargeted+In+Vivo+PET+Imaging.">Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging.</a> Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).</li></ol>

Um dos pontos fortes desta abordagem na vivo pretargeting — especialmente em relação às estratégias baseia bispecific anticorpos e radiolabeled haptens — é sua modularidade: trans- cyclooctene partes podem ser anexados a qualquer anticorpo, e tetrazine radioligands pode ser radiolabeled com uma extraordinária variedade de radionuclídeos, sem prejudicar a sua capacidade de reagir com os seus parceiros de clique. Ainda a adaptação desta abordagem para outro sistema de antígeno/anticorpo não...

Radioimmunotherapy (RIT) — o uso de anticorpos para a entrega de radionuclídeos terapêuticos para tumores — tem sido uma abordagem atraente para o tratamento de câncer1,2. Com efeito, esta promessa tem sido sublinhada pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration da aprovação de dois radioimmunoconjugates para o tratamento de linfoma não-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan e 131tositumomab eu3 , 4. ainda mesmo desde seus primeiros dias, as perspectivas clínicas de RIT foram dificultadas por uma complicação crítica: taxas de dose alta de radiação para os tecidos saudáveis5,6. De um modo geral, radioimmunoconjugates para RIT são rotulados com radionuclídeos de vida longa (por exemplo, 131eu [t½ = 8,0 dias] e 90Y [t½ = 2,7 dias]) com meia-vida física que se encaixam bem com o farmacocinéticas longa semi-vida de imunoglobulinas. Isto é essencial, pois garante que radioatividade suficiente permanece, uma vez que o anticorpo alcançou sua biodistribuição ideal após vários dias de circulação. No entanto, esta combinação de tempos de residência de longa no sangue e tempo físico de meia-vida inevitavelmente resulta na irradiação dos tecidos saudáveis, desse modo reduzindo relações terapêuticas e limitando a eficácia da terapia7. Várias estratégias têm sido exploradas para contornar este problema, incluindo a utilização de fragmentos de anticorpos truncado como Fab, Fab', F(ab')2, minibodies e nanobodies8,9,10. Uma das mais promissoras e fascinante, no entanto, abordagens alternativas, inegavelmente complexas é na vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting é uma abordagem de imagem nuclear e terapia que visa aproveitar o requintado afinidade e seletividade de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para este fim, o anticorpo radiolabeled usado em radioimmunotherapy tradicional é desconstruído em dois componentes: uma pequena molécula radioligantes e um immunoconjugate que pode ligar tanto um antígeno tumoral e o radioligantes acima mencionados. O immunoconjugate é injetado primeiro e dado um 'avanço', muitas vezes de vários dias, durante o qual ele se acumula no tecido-alvo e limpa o sangue. Posteriormente, a pequena molécula radioligantes é administrado e combina com o immunoconjugate do tumor ou rapidamente limpa do corpo. Em essência, na vivo pretargeting depende de realização de radioquímica dentro do próprio corpo. Ao reduzir a circulação de radioatividade, esta abordagem simultaneamente reduz a doses de radiação para os tecidos saudáveis e facilita o uso de radionuclídeos (por exemplo, 68Ga, t½ = 68 min211; Como, t½ = 7,2 h) com meias-vidas que são normalmente considerados incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.
Começando na década de 1980, um punhado de diferentes abordagens na vivo pretargeting foram desenvolvidos, incluindo estratégias baseadas em anticorpos bispecific, a interação entre streptavidin e biotina e a hibridação de complementares os oligonucleotides14,15,16,17,18. Ainda cada uma foi realizada a volta em diferentes graus por complicações, a mais famosa a imunogenicidade potente de anticorpos streptavidin-modificado19,20. Nos últimos cinco anos, o nosso grupo e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseia o rapid e opaco elétron inversa demanda Diels-Alder ligadura entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz) 21,22,23,24. A mais bem sucedida destas estratégias empregaram um anticorpo TCO-modificado e um radioligantes Tz-rolamento, como TCO é geralmente mais estável na vivo do que seu parceiro (Figura 1) de Tz25,26. Como em outras metodologias pretargeting, o immunoconjugate mAb-TCO é administrado primeiro e dado tempo para limpar de circulação e se acumulam no tecido do tumor. Posteriormente, a pequena molécula Tz radioligantes é injetado, após o qual ele clica com o immunoconjugate dentro do tecido-alvo ou limpa rapidamente do corpo. Esta na vivo pretargeting estratégia provou altamente eficaz para PET e SPECT de imagem com vários sistemas diferentes de antígeno/anticorpo, consistentemente produzir imagens com alto contraste e permitindo o uso de radionuclídeos de vida curto, tais como 18 F (t½ = 109 min) e Cu de 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Mais recentemente, demonstrou-se a eficácia do clique-baseado pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) em modelos murino de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) e carcinoma colorrectal27,28. Para este fim, o radionuclídeo terapêutico 177Lu (βmáx = 498 keV, t1/2 = 6,7 dias) foi empregado em conjunto com dois anticorpos diferentes: 5B1, que tem como alvo o antígeno de carboidrato 19,9 (CA19.9) expressado ubiquitously no PDAC , e huA33, que tem como alvo a A33, uma glicoproteína transmembrana expressos em > 95% dos cancros colo-rectais. Em ambos os casos, esta abordagem a 177Lu-Thayse rendeu concentrações de alta atividade no tecido do tumor, criou um efeito terapêutico dose-dependente e simultaneamente reduzidas concentrações de actividade em tecidos saudáveis em relação ao tradicional radioimmunoconjugates diretamente-rotulados.
Neste artigo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, nós descrevemos a construção de huA33-TCO (Figura 2), a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figura 3 e Figura 4) e o desempenho da vivo em biodistribuição e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorrectal. Além disso, na discussão e resultados representativos, apresentamos um conjunto de dados de amostra, possíveis estratégias de endereço para a otimização desta abordagem e considerar esta estratégia no contexto mais vasto na vivo pretargeting e Thayse. Finalmente, é importante notar que enquanto nós escolhemos focar pretargeting usando huA33-TCO e [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz no presente protocolo, esta estratégia é altamente modular e pode ser adaptado para atender uma ampla gama de anticorpos e radionuclidos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764523</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>764701</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MeCN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (NH4OAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O&#8242;-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70023</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D143-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC205024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC610941000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>70-011-044</td>
			<td>10x Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor measuring device</td>
			<td>Peira TM900</td>
			<td>Peira TM900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pretargeted radioimmunotherapy based on the inverse electron demand diels-alder reaction

Enquanto radioimmunotherapy (RIT) é uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, o Half-Life longo farmacocinético de anticorpos radiolabeled pode resultar em doses de radiação para os tecidos saudáveis. Talvez não surpreendentemente, várias estratégias diferentes foram desenvolvidas para contornar esta limitação preocupante. Uma das mais promissoras dessas abordagens é pretargeted radioimmunotherapy (Thayse). Thayse baseia-se na dissociação entre o radionuclídeo de imunoglobulina a, injetá-las separadamente e em seguida, permitindo-lhes combinar na vivo no tecido-alvo. Esta abordagem aproveita as propriedades excepcionais do tumor-direcionamento de anticorpos enquanto contornando seus inconvenientes farmacocinéticos, desse modo reduzindo a doses de radiação para os tecidos não-alvo e facilitar o uso de radionuclídeos com meias-vidas considerado demasiado curto para uso em radioimmunoconjugates tradicionais. Nos últimos cinco anos, nosso laboratório e outros desenvolveram uma abordagem na vivo pretargeting baseado na reação de Diels-Alder (IEDDA) de elétrons-demanda inversa entre trans- cyclooctene (TCO) e tetrazine (Tz). Esta estratégia tem sido aplicada com sucesso a pretargeted tomografia por emissão de pósitrons (PET) e de emissão de fóton único computadorizada (SPECT) de imagem com uma variedade de sistemas de antígeno-anticorpo. Em um par de publicações recentes, temos demonstrado a eficácia de Thayse IEDDA-baseado em modelos murino de adenocarcinoma ductal do pâncreas e carcinoma colorrectal. Neste protocolo, descrevemos os protocolos para Thayse usando um radioligantes tetrazine Lu-DOTA-rotulado de 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) e uma variante de TCO-modificado do câncer colorretal direcionamento anticorpo huA33 (huA33-TCO). Mais especificamente, iremos descrever a construção de huA33-TCO, a síntese e radioativos de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz e o desempenho de biodistribuição no vivo e estudos longitudinais terapia em modelos murino de carcinoma colorretal.

A conjugação de TCO para huA33 baseia-se o acoplamento entre o TCO-NHS-amina reativos e os resíduos de lisina na superfície da imunoglobulina a. Este método é altamente robusto e reprodutível e confiável, produz um grau de-rotulagem de 2-4 TCO/mAb. Neste caso, a espectrometria de massa MALDI-ToF foi empregada para confirmar um grau de rotulagem de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; um valor semelhante foi obtido usando um fluoróforo-modificado tetrazine como um repórter<sup class="xre...

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Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

Este protocolo descreve a síntese e caracterização de um trans- cyclooctene (TCO)-anticorpo e uma 177tetrazine Lu-rotulado (Tz) radioligantes para pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) modificados. Além disso, ele detalha o uso dessas duas construções para na vivo biodistribuição e estudos longitudinais terapia em um modelo murino de câncer colorretal.

Pretargeted Radioimmunotherapy baseado na reação de Diels-Alder de demanda inversa elétron

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Este protocolo descreve como aplicar uma metodologia pretargeted à radioterapia direcionada de xenógrafos de câncer no modelo do camundongo. A radioimunoterapia pretargeted ou PRIT nos permite injetar o anticorpo e radioligand separadamente, e deixar os dois combinarem in vivo usando química de clique. Enquanto apresentamos PRIT usando um modelo de xenógrafo de câncer colorretal, esta técnica pode ser aplicada a qualquer anticorpo de alvo de antígeno superficial.É importante selecionar um antígeno que não internalize rapidamente ou desadeudo extensivamente, pois estes podem reduzir a eficácia da abordagem. Para sintetizar huA33-TCO, prepare pela primeira vez uma solução de 125 microliter de 40 mililígenos por mililitro TCO-NHS em metilaformamida seca em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Esta solução pode ser alitada e congelada a 80 graus celsius para uso em experimentos futuros.Em um tubo de microcentrifuge separado de 1,7 mililitro prepara uma solução de cinco miligramas por mililitro de huA33 em um mililitro de salina tamponada de fosfato. Utilizando pequenas alíquotas de carbonato de sódio molar de 0,1, ajuste o pH da solução de anticorpos para entre 8,8 e 9,0. Use papel pH ou um medidor de pH com um microeletrodo para monitorar o pH, e tenha cuidado para que o pH não exceda 9,0.Adicione um volume correspondente a 40 equivalência molar de TCO-NHS à solução de anticorpos. Para evitar a precipitação do TCO-NHS hidrofóbico, adicione-o lentamente e com agitação. Deixe a reação incubar a 25 graus celsius em uma batedeira térmica por uma hora com leve agitação.Antes de purificar o imunoconjugado huA33-TCO usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável pré-embalada, equilibre a coluna de exclusão de tamanho descrita pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento que geralmente envolve lavar a coluna cinco vezes com um volume de PBS que corresponde ao volume da coluna. Adicione a mistura de reação à coluna de exclusão de tamanho, observando o volume da mistura de reação. Depois que a mistura de reação entrar, a coluna adiciona uma quantidade apropriada de PBS para trazer o volume total de solução adicionado à coluna até 2,5 mililitros.Colete o produto usando dois mililitros de PBS como eluente. Meça a concentração do huA33-TCO usando um espectotómetro UV vis monitorando o comprimento de onda em 280 nanômetros. Se uma solução com maior concentração de imunoconjugado for desejada concentre a solução huA33-TCO usando uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de 50.000 seguindo as instruções do fabricante.Armazene o imunoconjugado huA33-TCO completo a 4 graus celsius no escuro. Se for para ser usado mais de quatro dias no futuro armazene-o a 80 graus celsius no escuro. Em um tubo de centrífugas de 1,7 mililitros adicione 200 microliters de 0,25 tampão de acetato de amônio molar ajustado para pH 5.5.Adicione a quantidade desejada de cloreto de Lutetium-177 à solução tampão. A quantidade adicionada dependerá do número de indivíduos no experimento e das doses radioativas que estão sendo administradas. Adicione Tetrazine PEG7-DOTA em DMSO à mistura radioativa.O valor adicionado depende do número de indivíduos que estão sendo testados. Deixe a solução incubar a 37 graus celsius por 20 minutos. Verifique se a rotulagem de rádio está completa usando cromatografia de camada fina radio-instantânea com 50 milimões EDTA pH 5.5 como fase móvel.O Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine permanecerá na linha de base, enquanto o Lutetium-177 livre será coordenado pelo EDTA e viajará com a frente solvente. É fundamental que a colocação dos tumores subcutâneos não interfira na sua técnica de contenção. Recomendo colocá-los no lado flanco que é oposto à sua mão de contenção.Desde que me contenha com a mão esquerda, escolhi colocar os tumores no flanco direito. Classificar camundongos nus atrímicos femininos com xenógrafo de câncer colorretal, de modo que o volume médio de tumor em cada coorte é aproximadamente igual. Para isso, liste os números de identificação animal, padrão de entalhe de ouvido e volume de tumor em três colunas separadas de um programa de planilha.Classifique os dados do menor ao maior volume de tumores. Em uma quarta coluna atribuir a cada animal um número de gaiola. Pedale pelas gaiolas em um padrão parecido com uma cobra até que todos os animais sejam designados para uma gaiola.Uma vez que as gaiolas são atribuídas classificam os dados por número de gaiola. Para injetar as doses de imunoconjugados de 150 microliters de solução huA33-TCO em seringas pré-tratadas com albumina de soro bovino de 1% na PBS, e armazenar essas seringas no gelo. Para injetar o radioligand, primeiro desenhe doses em 150 microliters de soro fisiológico 0,9% estéril contendo 1,1 equivalência molar da Tetrazine-PEG7-DOTA radiolabeled em relação à quantidade de huA33-TCO administrado.Use pinças para medir o lado mais longo do tumor oblongo, bem como a largura que é perpendicular ao comprimento. Pesar cada rato em um equilíbrio para acompanhar o ganho de peso ou a perda de peso ao longo do tempo. Finalmente, calcule o volume usando a fórmula para o volume de um elipsoide assumindo que a altura é aproximadamente igual à largura.Mostrado aqui é a biodistribução de um in vivo pretargeting com huA33-TCO e Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine em camundongos nude atrímicos com tumores de caner colorretal humano s.1222 humanos. Todos os intervalos de injeção produzem altas concentrações de atividade no tecido tumoral, bem como baixas concentrações de atividade em órgãos saudáveis. O intervalo de injeção de 24 horas proporciona a maior absorção tumoral em 120 horas após a injeção.Com base nesses achados, foi escolhido um intervalo de 24 horas para o estudo subsequente de terapia longitudinal. Aqui é mostrado o estudo de terapia longitudinal de cinco grupos de camundongos com tumores SW1222 subcutâneos retratados no volume médio do tumor em função do tempo, e o volume do tumor normalizado para o volume inicial em função do tempo. Há uma grande diferença na resposta das coortes experimentais em comparação com os grupos de controle.Enquanto os tumores nos camundongos que receberam apenas um componente da estratégia de radioimunoterapia pretargeted continuaram a crescer sem controle, os tumores dos camundongos que receberam o regime completo de radioimunoterapia pretargeted pararam de crescer e, finalmente, encolheram. É importante ressaltar que não foram observados efeitos colaterais tóxicos, e todos os animais mantiveram um peso dentro de 20% de sua massa inicial. Surpreendentemente, os ratos das coortes experimentais tinham um registro perfeito de sobrevivência no final da investigação.Ao tentar este procedimento é de extrema importância medir com precisão e reprodutivelmente os tumores. Ao trabalhar com radioatividade consulte o oficial de segurança de radiação da sua instituição para desenvolver protocolos e instalações seguras. Ter controles de segurança adequados no local limitará sua exposição e evitará contaminação.Pretargeting oferece uma dose de radiação menor para órgãos de fundo do que a radioimunoterapia tradicional. Ao compartilhar este protocolo, esperamos que outros possam testar seus próprios modelos e ideias que levarão a novos e emocionantes avanços para o tratamento do paciente.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Intramolecular Dehydrogenative Diels-Alder Reactions for the Synthesis of Functionalized Naphthalenes/Solvatochromic Dyes

Microondas assistidas Intramoleculares Dehydrogenative Diels Alder-Reações para a síntese de Naftalenos funcionalizados / Corantes solvatocrômico

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to ...

Química

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Amide Coupling Reaction for the Synthesis of Bispyridine-based Ligands and Their Complexation to Platinum as Dinuclear Anticancer Agents

Acoplamento de amida de reacção para a síntese de ligandos baseados em Bispyridine e sua complexação com platina como agentes anticancerígenos dinucleares

Amide coupling reactions can be used to synthesize bispyridine-based ligands for use as bridging linkers in multinuclear platinum anticancer drugs. ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

Uma abordagem de análise inversa à caracterização dos Transportes Química em Tintas

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

1,3,5-Triphenylbenzene and Corannulene as Electron Receptors for Lithium Solvated Electron Solutions

1,3,5-Triphenylbenzene e Corannulene como Electron Receptores de lítio solvatado Electron Solutions

The authors report on conductivity studies carried out on lithium solvated electron solutions (LiSES) prepared using two types of polyaromatic ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A preparação e propriedades de termo-reversível reticulada Química Rubber Via Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Um método de síntese rápida para Au, Pd e Pt Aerogels através de redução direta baseada em solução

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

Análise quantitativa do local atômico de defeitos funcionais/pontos em materiais cristalinos por Microanálise Aprimorada por Canalização eletrônica

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident ...

Picometer-Precision Atomic Position Tracking through Electron Microscopy

Picometer-Precision Rastreamento de posição atômica através de microscopia eletrônica

The modern aberration-corrected scanning transmission electron microscopes (AC-STEM) have successfully achieved direct visualization of atomic columns ...