Name: a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager at JoVE.com

我们要感谢布隆菲尔德集团基金会通过亨特医学研究所 (hmri 13-02) 提供的资金支持。x. z 通过纽卡斯尔大学和 hcra 生物标志物旗舰博士奖学金获得 apa 奖学金。

请注意:两个细胞系应该单独处理。如果未指定, 应将以下过程应用于单个单元格。
1. 优化伤前的细胞密度
<ol><li>在 t75 厘米2组织培养瓶中培养粘附细胞, 在37°c 与 5% co 2, 以10% 的胎牛血清 (fbs)、200 mm l-谷氨酰胺和2μgml 胰岛素为补充, 约80% 融合在酚类红自由的 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 中 ,大多数癌细胞系的标准培养条件, 培养配方与细胞系有关...

<ol>
	<li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control.">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li><li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis.">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis.">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li><li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research.">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).</li><li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment.">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li></ol>

迁移和入侵是评估癌细胞流动性的重要参数。通过使用96针划伤工具, 可以同时在2d 和3d 中进行伤口愈合检测。除了促进自动扫描, 提供稳定的细胞培养环境, 最大限度地中断, 使用96针划伤工具进行划痕检测提供了一致的划痕伤口, 使实验更加强大和重现。96孔板的格式提供了增加细胞系数量或不同药物治疗的额外选择。此外, 还可以记录细胞形态变化和动态运动, 以便进一步分析。
<p class="jove_con...

细胞迁移和侵袭是使人体正常功能的重要生物过程, 如伤口闭合、胎盘侵入子宫和乳腺形态发生1,2,3。人体对这些生物事件有精确而严格的控制;但是, 也有一些例外。恶性肿瘤, 例如, 能够逃脱这种保护, 表现出异常增殖, 并侵入邻近组织, 这被称为转移。转移是导致癌症相关死亡的主要原因4。
乳腺癌是妇女最常见的癌症, 也是全世界发达国家妇女癌症相关死亡的第二大原因5。乳腺癌起源于由一个或多个上皮细胞层组成的导管或小叶。在正常乳房中, 上皮细胞通过膜蛋白 (如 e-钙粘蛋白和整合素 6) 相互粘附并粘附到基底膜上。然而, 浸润性乳腺癌细胞已经失去了极性和细胞粘附, 并经典地进行上皮间充质转变 (emt), 并获得移动能力。外渗后, 这些细胞在细胞外基质 (ecm) 上移动, 进入血管或淋巴系统, 然后是静脉内和转移生长7。了解这种情况发生的机制具有重要意义, 因为转移是癌症相关死亡的最常见原因, 与癌细胞迁移/浸润密切相关。为了想象癌细胞的运动, 迁移和入侵检测是研究二维和三维细胞运动的理想模型。迁移直接评估细胞的运动, 而入侵则涉及与微环境的相互作用和降解生物屏障的能力。这两个过程并不完全独立, 因为移徙是入侵的要求。
研究移民和入侵的方法有几种。根据 kramer 等人的评论, 移情检测, 如伤口愈合, 围栏和微载体检测产生一个无细胞的区域, 使细胞进入, 评估区域的变化;然而, 经井和毛细血管检测是基于向吸引物8移动的细胞数量。例如, 对于入侵检测, 必须使用 ecm 凝胶或胶原蛋白建立 ecm 环境, 并可通过监测入侵区域、距离和细胞计数 (如转井检测、鸭排检测)来评估3d 运动。另一种类型的入侵检测是将浸润性细胞与非侵入性细胞结合起来, 并评估浸润细胞的行为 (例如球体检测)。上述方法有其优缺点, 在相似的工作流程中, 一种易于接近、易于重复、并在相似工作流程中结合迁移分析和入侵分析的方法是有利的。
该协议描述了使用活细胞成像仪测量细胞迁移和入侵的方法。它是安装在标准细胞培养孵化器中的实时细胞监测系统。它通过对细胞或荧光目标应用适当的掩模, 根据设定的扫描间隔和测量方法拍摄高清晰度图像。迁移/入侵检测模块包括使用96针划伤工具, 该工具适用于在96孔板的细胞单层上制造均匀的划痕伤。该机制基于体外伤口愈合检测, 监测塑料或涂层表面的2d 细胞运动。还可以评估划伤伤口内其他 ecm 的入侵或3d 运动。图 1显示了一个简短的工作流。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30028-02</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 2x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMQAX1000</td>
			<td style="width:167px;">Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 1 (Alconox)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">242985</td>
			<td style="width:167px;">0.5% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 2 (Virkon S)</td>
			<td style="width:100px;">VetProduct DIRECT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:309px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21063-045</td>
			<td style="width:167px;">Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &#956;g/ml insulin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">ECM Gel (matrigel)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6909</td>
			<td style="width:167px;">Growth-factor reduced, phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">EVE Counting slides</td>
			<td style="width:100px;">BioTools</td>
			<td style="width:119px;">EVS-50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:100px;">Bovogen Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">SFBS-F-500ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4444</td>
			<td style="width:167px;">Including CoolBox, 2x CoolSink</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">IncuCyte Cell migration kit</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4493</td>
			<td style="width:167px;">Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">IncuCyte ZOOM</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Live cell analysis system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">19278-5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">L-glutamine solution (100x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-091</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Tissue culture flask, 75 cm2 growth area</td>
			<td style="width:100px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">658175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager

癌细胞的移动性是开始转移的关键。因此, 对细胞运动和侵入能力的调查具有重要意义。迁移检测提供了2d 水平细胞运动的基本见解, 而入侵检测在生理上更相关, 在体内模拟体内癌细胞从原始部位脱落, 并通过细胞外基质入侵。当前协议为迁移和入侵检测提供了一个单一的工作流。与用于实时高清图像的集成自动化显微镜相机和内置分析模块相结合, 它为研究人员提供了一个省时、简单且可重复的实验选项。该协议还包括耗材的替换和供用户选择的替代分析方法。

这种迁移/入侵检测是基于伤口愈合试验, 该试验评估了细胞进入96针划伤工具创建的无细胞区域的速度。迁移和入侵检测之间的区别在于, 迁移检测测量在组织培养处理的塑料表面上移动的细胞, 以及在 ecm 凝胶上移动的入侵措施细胞。
划痕工具的设计是为了在指定的盘子里制造一致的划痕伤细胞成像仪的设计是为了拍摄实时高...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager at JoVE.com

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

使用自动活单元成像仪的简单迁移/入侵工作流

目前的协议描述了一种实时研究癌症细胞迁移和入侵的综合方法, 为研究细胞迁移和形态提供了一个易于重现和省时的选择。

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

癌细胞流动性是转移启动的关键。因此，对肿瘤细胞细胞运动和侵入性能力的调查具有极大的关注性。这种用于实时在单个平台上调查癌细胞迁移和入侵的综合方法，为研究细胞移动性和病理学提供了一个易于重现且具有时效率的选项。该方法可以通过细胞外基质提供对癌细胞入侵的洞察，并可应用于其他细胞类型。为了达到最佳的划痕时间，确保种子密度得到优化，并且一旦细胞单层达到100%的汇合，就不要延长孵育期。要确定迁移测定的种子细胞的最佳数量，请将细胞在 96 壁板中三分之一密度范围内放置。将板放入实时单元格成像器中，然后从成像器软件中的任务列表中选择计划扫描。在抽屉设置窗格中，确定板的位置，然后单击"添加容器"以选择板类型。在扫描设置窗格中，根据实验板设置选择或编辑扫描模式，并设置扫描类型为标准。右键单击时间线，然后选择设置间隔。然后设置添加扫描每'到两个小时 24 小时，然后单击应用。24 小时后，打开抽屉设置以选择实验板，然后单击移除容器。选择三到六个代表性图像，并将它们放在新的图像集合中。要确定正确的处理定义，请使用分段调整、清理和滤镜来应用适当的汇合蒙版，并使用预览电流 all'查看蒙版的准确性。启动分析工作，并确定优化的细胞密度，根据大约 100% 的汇合时间，在 6 到 18 小时内，具体取决于迁移测定何时开始。然后，将汇合处理分析工具应用于自动收集的高清相位对比度图像，以生成与时间相对的细胞增殖曲线。在开始检测之前，用50微升的细胞外基质凝胶在冰冷的细胞培养基中稀释，以每毫升浓度100微克涂覆为入侵测定板。然后，将盘子放在细胞培养孵化器中过夜。第二天下午，轻轻吸吸多余的介质，以优化密度将细胞以三分之一分型板入细胞外基质涂层板的适当孔中，并放入一个额外的未涂覆的96孔板中。然后，将板放在细胞培养培养箱中过夜。第二天早上，将未涂覆的迁移检测板放入刮擦工具的底板支架中，并使用导向型销板小心地将支架的顶部放在底座上。按住黑色操纵杆，小心地抬起销块，以划伤。每一个井的划痕应该用肉眼和显微镜可见。然后，用预热培养培养器清洗盘子一两次，以去除任何分离的细胞或细胞片。对于入侵测定，划伤涂层板，正如刚刚证明的。取出任何分离的电池和板材后，使用预冷冷盒在四摄氏度下平衡板五分钟，然后小心吸气冷介质。接下来，将50微升稀释的细胞外基质凝胶加入适当的孔中，并将板放入细胞培养箱30分钟。使用细胞外基质凝胶时，气泡很常见，但可以通过吸出 70% 的乙醇来消除气泡。然后添加100微升的新鲜、温暖的介质，带或不带试验化合物，加入迁移或入侵检测板的适当孔中，并将该板放入活细胞成像平台。要清洁刮擦工具，请将顶部销块放在单独的 45 毫升洗涤船上，其中含有 5% 的洗涤剂 1、1% 洗涤剂 2、无菌蒸馏水或 70% 乙醇，每次洗涤时间为 5 分钟，然后将刮擦工具放回底板上，以储存在无尘环境中。对于伤口的成像分析，在允许板平衡五分钟后，选择容器类型"作为图像日志平面，并设置扫描类型为划痕伤口。根据实验板设置选择或编辑扫描模式，并安排 24 小时重复扫描，每 1 到 2 小时扫描 72 小时，或直到伤口愈合，如证明。当所有伤口愈合后，停止扫描，并选择三到六个代表性的图像，跨越一系列声音百分比，包括伤口制作后的图像，伤口闭合率为 10% 和 50%。要确定正确的处理定义，请应用适当的划痕蒙版和所演示的汇合蒙版，并使用预览电流 all'查看蒙版的准确性。然后，启动分析作业。在迁移测定中，伤口宽度是伤口旁边的细胞片之间的平均距离。伤口汇合是伤员区内的汇合。理想的初始伤口汇合应接近百分之零。相对伤口密度和伤口汇合表明占据划痕伤口区域的细胞的速度。这些数据几乎重叠在这两个代表性的单元格行。不同的细胞系表现出非常不同的伤口愈合能力，表明细胞系之间的不同迁移能力。例如，在迁移开始时，在迁移前的这个乳腺癌细胞系中观察到拉梅利波迪亚，而这种产生粘液1的乳腺癌细胞系在同一时间点没有细胞迁移的迹象。此外，乳腺癌线的相对伤口密度在50小时后饱和，而产生乳酸的乳酸1产生乳腺癌细胞系的相对伤口密度没有随着时间的推移而变化，突出了腺癌细胞的侵入性高表型和粘液1产生乳腺癌细胞的非侵入性。腺癌细胞在通过细胞外基质凝胶入侵时也表现不同，显示出具有前向突起的拉长形态，在迁移测定中，在迁移前看到一个出血。电镀时，请记住，如果种子的细胞太少，划痕将不能正常形成，如果种子细胞太多，就会出现过度拥挤。按照此过程，可以添加跟踪处理，从而可以适应高通量轨道筛选。这种方法允许研究人员在单一平台上进行这些检测，这是高通量，并允许研究人员实时监测他们的细胞，而不是在实验终点。用于消毒刮擦工具的消毒剂可能很危险。确保根据相关的 MSDS 和设施的常规触发线收集和处置解决方案。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

向上移动: 一个简单而灵活的体外三维入侵检测协议

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

科研

癌症研究

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

长期活细胞成像对紫杉醇反应细胞命运的评估

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

腺病毒报告系统 TGF β/Smad3 信号通路的活体细胞成像

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

突变黑色素细胞干细胞引发小鼠黑色素瘤的时空控制

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

体外测定研究肿瘤-巨噬菌体相互作用

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

数据集成工作流，以识别针对合成致命相互作用的药物组合

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

自动差分核染色测定，准确测定三元细胞毒性

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

快速筛选工作流程，利用患者衍生胶质瘤干细胞确定GBM的潜在组合疗法

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

用于低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动解剖方案

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

一种人外周血淋巴细胞γ-H2AX病灶测定的自动显微镜评分方法

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...