Name: a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00
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Nous tenons à souligner notre soutien financier de la fondation du groupe Bloomfield à travers le Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z est soutenu par une bourse d’études de l’APA par le biais de l’Université de Newcastle et la bourse de doctorat HCRA biomarqueurs phare.

Remarque : Deux lignées de cellules doivent être traitées séparément. Les procédures suivantes devraient être appliquées à une ligne de cellules du même si n’est pas spécifiées.
1. optimiser la densité cellulaire avant blessant
<ol><li>La culture des cellules adhérentes dans des flacons de culture de tissus2 T75 cm à environ 80 % confluent dans de Dulbecco gratuit-rouge de phénol modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 200...

<ol>
	<li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control.">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li><li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis.">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis.">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li><li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research.">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).</li><li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment.">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li></ol>

Migration et invasion sont des paramètres importants pour évaluer la mobilité des cellules cancéreuses. En utilisant l’outil de grattage 96 broches, il est possible de procéder à la guérison des dosages en 2D et 3D en même temps. En dehors de faciliter la numérisation automatique, offrant un milieu de culture des variétés de cellule stables avec le minimum de perturbations, la gratter essai effectué à l’aide de l’outil de grattage 96 broches fournit des plaies gratter cohérentes, permettant des expér...

La migration cellulaire et l’invasion sont des processus biologiques importants qui permettent les fonctions normales du corps humain, comme la fermeture de la plaie, invasion du placenta dans l’utérus et glandes mammaires morphogenèse1,2,3. Le corps humain a un contrôle rigoureux et précis de ces événements biologiques ; Cependant, il y a quelques exceptions près. Les tumeurs malignes, par exemple, sont en mesure d’échapper à cette sauvegarde, pièce prolifération anormale et envahir dans les tissus voisins, qu’on appelle des métastases. Métastase est la principale cause de mortalité liée au cancer4.
Le cancer du sein est le plus couramment diagnostiqué le cancer chez les femmes et est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes dans les pays développés dans le monde entier5. Le cancer provient de conduits ou lobules qui consistent en une ou plusieurs couches de cellules épithéliales. Dans le sein normal, les cellules épithéliales sont rattachés les uns et à la membrane de sous-sol par l’intermédiaire de protéines membranaires telles que E-cadhérine et les intégrines6. Cependant, les cellules du cancer du sein invasif ont perdu leur polarité et l’adhérence de cellules et classiquement subissent une transition mésenchymateuse épithéliale (EMT) et acquièrent la capacité de se déplacer. Après extravasation, ces cellules se déplacent sur la matrice extracellulaire (ECM) et entrer dans le vaisseau sanguin ou le système lymphatique, suivie ensuite d’intravasation et croissance métastatique7. La compréhension des mécanismes par lesquels ceci se produit est d’une grande importance, puisque les métastases est la cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer et est étroitement lié au cancer cell migration/invasion. Afin de visualiser le mouvement des cellules cancéreuses, les essais de migration et invasion sont les modèles idéales pour étudier le mouvement cellulaire 2D et 3D, respectivement. Migration évalue directement le mouvement des cellules tandis qu’invasion implique une interaction avec le microenvironnement et la capacité à dégrader les barrières biologiques. Les deux processus ne sont pas totalement indépendants d’un de l’autre, que la migration est une exigence d’invasion.
Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier les migrations et l’invasion. Tel que revu par Kramer et al., des tests de migration comme la cicatrisation, clôture et analyses micro-transporteur génèrent une zone acellulaire pour permettre les cellules habitable, à évaluer le changement de zone ; considérant que, essais transwell et capillaire sont basés sur le nombre de cellules qui se déplacent vers un attractant8. Pour les analyses d’invasion, un environnement ECM doit être mis en place avec du gel de l’ECM ou collagène par exemple, et le mouvement 3D peut être évaluée en surveillant les comtes invasion de zone, de distance et de cellule (p. ex. transwell dosage, dosage de l’ornithorynque)8. Un autre type de test de l’invasion est de combiner les cellules invasives avec les cellules non invasif et évaluer le comportement des cellules envahissantes (p. ex. sphéroïde dosages). Les méthodes ci-dessus ont leurs avantages et inconvénients et une manière facile d’approche, facile à répéter et à combiner le test de migration et invasion dans un flux de travail similaire est préférentiel dans une conception expérimentale.
Ce protocole décrit la mesure de la migration cellulaire et l’invasion à l’aide d’un imageur de cellules vivantes. C’est une cellule en temps réel système installé dans un incubateur de culture cellulaire standard de surveillance. Il prend des images haute définition avec le jeu de numérisation des intervalles et des mesures en appliquant des masques appropriés pour les cellules ou les cibles fluorescents. Le module de test de migration/invasion inclut à l’aide d’un outil de grattage 96 broches, qui est adapté pour la fabrication des plaies gratter homogènes sur une monocouche de cellules dans une plaque à 96 puits. Le mécanisme est basé sur une plaie in vitro tests de guérison, de surveillance des mouvements de cellules 2D sur un plastique ou revêtement. Invasion ou mouvement 3D à travers un ECM supplémentaire dans le scratch enroulé également peut être évaluée. Un flux de travail bref est illustrée à la Figure 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30028-02</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 2x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMQAX1000</td>
			<td style="width:167px;">Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 1 (Alconox)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">242985</td>
			<td style="width:167px;">0.5% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 2 (Virkon S)</td>
			<td style="width:100px;">VetProduct DIRECT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:309px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21063-045</td>
			<td style="width:167px;">Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &#956;g/ml insulin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">ECM Gel (matrigel)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6909</td>
			<td style="width:167px;">Growth-factor reduced, phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">EVE Counting slides</td>
			<td style="width:100px;">BioTools</td>
			<td style="width:119px;">EVS-50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:100px;">Bovogen Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">SFBS-F-500ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4444</td>
			<td style="width:167px;">Including CoolBox, 2x CoolSink</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">IncuCyte Cell migration kit</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4493</td>
			<td style="width:167px;">Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">IncuCyte ZOOM</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Live cell analysis system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">19278-5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">L-glutamine solution (100x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-091</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Tissue culture flask, 75 cm2 growth area</td>
			<td style="width:100px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">658175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager

Cancer cellule mobilité est cruciale pour l’ouverture de la métastase. Enquête du mouvement cellulaire et la capacité invasive est donc d’une grande importance. Les essais de migration donnent une idée de base du mouvement cellulaire au niveau 2D, tandis que les analyses d’invasion sont plus physiologiquement pertinents, imitant le détachement cellulaire in vivo cancer du site original et envahir par l’intermédiaire de la matrice extracellulaire. Le protocole actuel prévoit un seul flux de travail pour les essais de migration et invasion. Avec la caméra intégrée de microscopique automatisée pour les images HD en temps réel et le module d’analyse intégré, il donne des chercheurs un temps-efficace, simple et reproductible option expérimentale. Ce protocole comprend également des substitutions pour les consommables et les méthodes d’analyse des choix pour les utilisateurs à choisir.

Ce test de migration/invasion repose sur le dosage de guérison de blessure, qui évalue le taux des cellules se déplaçant dans une zone acellulaire, créée par l’outil de grattage 96 broches. La différence entre les essais de migration et invasion sont que migration des analyses des cellules de mesure se déplaçant sur les culture de tissus traitée en plastique surface invasion mesures des cellules et se déplaçant à travers le gel de l’ECM.
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A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

La mobilité des cellules cancéreuses est cruciale pour l’initiation de la métastase. Par conséquent, l’investigation du mouvement cellulaire et de la capacité envahissante des cellules de tumeur est d’un grand intérêt. Cette méthode intégrée pour étudier la migration et l’invasion des cellules cancéreuses, sur une seule plate-forme en temps réel, offre une option facilement reproductible et efficace dans le temps pour étudier la mobilité cellulaire et la pathologie.Cette méthode peut fournir un aperçu de l’invasion des cellules cancéreuses, par le biais de la matrice extracellulaire, et peut être appliquée à d’autres types de cellules. Pour obtenir un temps d’égratignure optimal, assurez-vous que la densité d’ensemencement a été optimisée et ne prolongez pas la période d’incubation une fois que le monocouche cellulaire a atteint 100 pour cent de confluence. Pour déterminer le nombre optimal de cellules ensemencées pour un test de migration, placez les cellules dans une gamme de densités en triplicate dans une plaque de 96 paroi.Placez la plaque dans l’imageur de cellule en direct et sélectionnez les analyses d’horaire à partir de la liste de tâches dans le logiciel d’imageur. Dans le volet d’installation du tiroir, déterminez les positions de la plaque et cliquez sur ajouter vessel’to select the plate type. Dans le volet de configuration de l’analyse, sélectionnez ou modifiez le modèle d’analyse en fonction de la configuration expérimentale de la plaque, et définissez le type d’analyse en standard.Cliquez à droite sur la chronologie et sélectionnez des intervalles définis. Ensuite, réglez ajouter des scans toutes les deux heures pendant 24 heures, et cliquez sur appliquer. Après 24 heures, ouvrez la configuration du tiroir pour permettre la sélection de la plaque expérimentale et cliquez sur retirer le navire.Sélectionnez trois à six images représentatives et placez-les dans une nouvelle collection d’images. Pour déterminer une définition de traitement appropriée, utilisez le réglage de segmentation, le nettoyage et les filtres pour appliquer un masque de confluence approprié et utilisez le courant d’aperçu all’to afficher l’exactitude des masques. Lancez le travail d’analyse et déterminez une densité cellulaire optimisée, selon une confluence d’environ 100 pour cent par rapport au temps, dans les six à dix-huit heures, selon le moment où l’analyse de migration commence.Ensuite, appliquez l’outil d’analyse de traitement des confluences aux images de contraste de phase haute définition automatiquement collectées pour générer une courbe de prolifération cellulaire par rapport au temps. Avant de commencer l’analyse, enduire la plaque pour l’essai d’invasion de 50 microlitres de gel matriciel extracellulaire, dilué dans le milieu de culture des cellules glacées, à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.L’après-midi suivant, aspirez doucement l’excès de milieu et plaquez les cellules à la densité optimisée, en triplicate, dans les puits appropriés de la plaque extracellulaire enduite de matrice, et dans une plaque supplémentaire non encorée de 96 puits. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, placez la plaque d’analyse de migration non encoated dans le support de plaque de base de l’outil à gratter, et utilisez les chevilles directrices pour placer soigneusement le dessus du support sur la base.Appuyez et maintenez le levier noir tout en soulevant soigneusement le bloc d’épingles pour faire les rayures. Les rayures de chaque puits doivent être visibles à l’œil nu, ainsi qu’au microscope. Ensuite, lavez la plaque une ou deux fois avec un milieu de culture préchauffé pour enlever les cellules détachées ou les feuilles cellulaires.Pour l’essai d’invasion, grattez la plaque enduite comme juste démontré. Après avoir enlevé les cellules et les feuilles détachées, utilisez une boîte froide pré-réfrigérée pour équilibrer la plaque à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le milieu froid. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de gel matriciel extracellulaire dilué dans les puits appropriés et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trente minutes.Les bulles sont courantes lorsqu’elles travaillent avec du gel matriciel extracellulaire, mais elles peuvent être éliminées en aspirant 70 % d’éthanol. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu frais et chaud, avec ou sans le composé d’essai, aux puits appropriés de la plaque d’essai de migration ou d’invasion, et placez la plaque dans la plate-forme d’imagerie cellulaire vivante. Pour nettoyer l’outil à gratter, placez le bloc d’épingles supérieur dans des bateaux de lavage individuels de 45 millilitres, contenant 5 % de détergent un, un pour cent de détergent deux, de l’eau distillée stérile, ou 70 % d’éthanol pendant cinq minutes par lavage avant de remettre l’outil à gratter sur sa plaque de base, pour le stockage dans un environnement exempt de poussière.Pour l’imagerie des analyses de blessure, après avoir permis à la plaque d’équilibrer pendant cinq minutes, sélectionnez type de navire comme le plan de journal d’image, et définir le type d’analyse comme blessure à gratter. Sélectionnez ou modifiez le modèle d’analyse, selon la configuration expérimentale de la plaque, et planifiez 24 heures de répétition toutes les une à deux heures pendant 72 heures, ou jusqu’à ce que les blessures soient guéries comme démontré. Lorsque toutes les blessures ont guéri, arrêtez l’analyse et sélectionnez trois à six images représentatives, couvrant une gamme de pourcentages sonores, y compris des images juste après que la plaie a été faite, et la fermeture de la plaie de 10 et 50 pour cent.Pour déterminer une définition de traitement appropriée, appliquez un masque de plaie à gratter approprié et un masque de confluence tel que démontré, et utilisez le courant d’aperçu all''to afficher l’exactitude des masques. Ensuite, lancez le travail d’analyse. Lors d’un test de migration, la largeur de la plaie est la distance moyenne entre les feuilles cellulaires à côté de la plaie.La confluence de la plaie est la confluence dans la zone blessée. La confluence initiale idéale de blessure devrait être près de zéro pour cent. La densité relative de la plaie et la confluence de la plaie suggèrent la vitesse des cellules occupant la zone de la plaie à gratter.Ces données se chevauchent presque dans ces deux lignées cellulaires représentatives. Différentes lignées cellulaires démontrent des capacités de cicatrisation des plaies très différentes, ce qui indique des capacités migratoires différentielles entre les lignées cellulaires. Par exemple, la lamellipodie sont observées dans cette lignée cellulaire d’adénocarcinome de sein au front de migration au début de la migration, alors que cette lignée de cellules de cancer du sein productrices de mucine 1 n’a montré aucun signe de migration cellulaire au même moment.En outre, la densité relative de blessure de la ligne d’adénocarcinome de sein a été saturée après 50 heures, alors que la densité relative de blessure de la ligne de cellules cancéreuses du sein mucin 1-produisant n’a pas changé au fil du temps, soulignant le phénotype fortement invasif des cellules d’adénocarcinome et et la non-invasiveness des cellules cancéreuses de sein mucin 1-productrices. Les cellules d’adénocarcinome se sont également comportées différemment tout en envahissant par le gel extracellulaire de matrice, démontrant une morphologie allongée avec des saillies principales, et dans des analyses de migration, un bleb au front de migration a été visualisé. Lors du placage, rappelez-vous que si trop peu de cellules sont ensemencées, l’égratignure ne se formera pas correctement, et si trop de cellules sont ensemencées, il y aura surpeuplement.Suite à cette procédure, des traitements de suivi peuvent être ajoutés, ce qui permet d’adapter cette méthode pour le dépistage des voies à haut débit. Cette méthode permet aux chercheurs d’effectuer ces essais sur une seule plate-forme, qui est à haut débit, et permet aux chercheurs de surveiller leurs cellules en temps réel, plutôt qu’en fin de compte expérimental. Les désinfectants utilisés pour stériliser l’outil à gratter peuvent être dangereux.Assurez-vous de collecter et d’éliminer les solutions en fonction du MSDS concerné et des lignes de déclenchement régulières de votre établissement.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Recherche

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