Name: a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00
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Nós gostaríamos de reconhecer nosso apoio financiamento pela Fundação de grupo de Bloomfield, através do Instituto de pesquisa médica do Hunter (HMRI 13-02). X.Z é suportado por uma bolsa de APA através da Universidade de Newcastle e a bolsa de doutoramento HCRA biomarcadores emblemática.

Nota: Duas linhas de célula devem ser tratadas separadamente. Os procedimentos a seguir devem ser aplicados a uma linha única célula se não especificados.
1. otimizar a densidade celular antes ferindo
<ol><li>Cultura de células aderentes em frascos de cultura de tecidos de2 T75 cm a cerca de 80% confluência no de vermelho de fenol livre Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 mM L-glutamina e 2 insulina ?...

<ol>
	<li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control.">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li><li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis.">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis.">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li><li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research.">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).</li><li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment.">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li></ol>

Migração e invasão são parâmetros importantes para avaliar a mobilidade das células cancerosas. Usando a ferramenta para raspar 96-pin, é possível realizar a ferida cura ensaios em 2D e 3D simultaneamente. Além de facilitar a varredura automática, proporcionando um ambiente de cultura celular estável com o mínimo de interrupção, o zero ensaio realizado com o uso da ferramenta para raspar 96 pinos fornece consistentes feridas zero, permitindo que as experiências que são mais robustas e pode ser reproduzido...

Migração celular e invasão são importantes processos biológicos que permitem que as funções normais do corpo humano, tais como fechamento de ferida, invasão da placenta no útero e glândula mamária morfogênese1,2,3. O corpo humano tem controle preciso e rigoroso destes eventos biológicos; no entanto, existem algumas exceções. Tumores malignos, por exemplo, são capazes de escapar esta salvaguarda, apresentam proliferação anormal e invadir no tecido vizinho, que é chamado de metástase. Metástase é a principal causa de mortalidade relacionadas ao câncer4.
Câncer de mama é o mais comumente diagnosticado câncer em mulheres e é a segunda maior causa de morte por câncer entre as mulheres em países desenvolvidos no mundo5. Câncer de mama origina-se ductos ou lóbulos que consistem em uma ou mais camadas de células epiteliais. Na mama normal, as células epiteliais aderem um ao outro e a membrana basal através de proteínas de membrana, tais como E-caderina e integrinas6. No entanto, as células de câncer de mama invasivo perderam sua polaridade e adesão célula-célula e classicamente submetido a transição mesenquimal epitelial (EMT) e ganham a habilidade de mover-se. Após o extravasamento, estas células se movem a matriz extracelular (ECM) e insira o vaso sanguíneo ou o sistema linfático, seguido depois por intravasation e crescimento metastático7. Compreender os mecanismos pelos quais isso ocorre é de grande importância, desde que a metástase é a causa mais comum de mortalidades relacionadas ao câncer e está intimamente relacionado ao câncer celular migração/invasão. Para visualizar o movimento de células cancerosas, os ensaios de migração e invasão são modelos ideais para estudar o movimento de célula 2D e 3D, respectivamente. Migração avalia diretamente o movimento das células Considerando que invasão envolve a interação com o microambiente e a capacidade de degradar as barreiras biológicas. Os dois processos não são totalmente independentes um do outro, como a migração é uma exigência da invasão.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar a migração e invasão. Como comentado por Kramer et al., ensaios de migração, tais como a cicatrização de feridas, vedação e ensaios de microtransportadora geram uma área livre de célula para permitir que as células a habitar, avaliando a mudança de área; Considerando que, em ensaios transwell e capilar baseiam-se no número de células que se movem em direção a um atrator8. Para ensaios de invasão, um ambiente de ECM deve ser instituído com gel de ECM ou colágeno por exemplo, e movimento 3D pode ser avaliado, monitorando as contagens de área, distância e célula de invasão (por exemplo, transwell ensaio, ensaio de ornitorrinco)8. Um outro tipo de ensaio de invasão é combinar as células invasoras com células não-invasiva e avaliar o comportamento das células invasoras (por exemplo, ensaios de esferoide). Os métodos acima tem seus prós e contras e uma maneira fácil de abordagem, fácil de repetir e combinar o ensaio de migração e invasão de ensaio em um fluxo de trabalho semelhante é preferencial em delineamento experimental.
Este protocolo descreve a medição da migração celular e invasão usando um gerador de imagens de viver-pilha. É uma célula em tempo real, monitoramento de sistema instalado em uma incubadora de cultura de célula padrão. É preciso de imagens de alta definição, de acordo com o conjunto de varredura intervalos e medições, aplicando máscaras adequadas para as células ou alvos fluorescentes. O módulo de ensaio de migração/invasão inclui o uso de uma ferramenta para raspar 96 pinos, que é apropriada para fazer feridas zero homogêneas em uma monocamada de células em uma placa de 96 poços. O mecanismo baseia-se em vitro ferida cura ensaios, monitorar a movimentação de pilha 2D em um plástico ou superfície revestida. Invasão ou movimento 3D através de um ECM adicional dentro do zero ferido também pode ser avaliado. Um fluxo de trabalho breve é ilustrado na Figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30028-02</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 2x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMQAX1000</td>
			<td style="width:167px;">Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 1 (Alconox)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">242985</td>
			<td style="width:167px;">0.5% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 2 (Virkon S)</td>
			<td style="width:100px;">VetProduct DIRECT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:309px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21063-045</td>
			<td style="width:167px;">Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &#956;g/ml insulin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">ECM Gel (matrigel)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6909</td>
			<td style="width:167px;">Growth-factor reduced, phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">EVE Counting slides</td>
			<td style="width:100px;">BioTools</td>
			<td style="width:119px;">EVS-50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:100px;">Bovogen Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">SFBS-F-500ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4444</td>
			<td style="width:167px;">Including CoolBox, 2x CoolSink</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">IncuCyte Cell migration kit</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4493</td>
			<td style="width:167px;">Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">IncuCyte ZOOM</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Live cell analysis system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">19278-5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">L-glutamine solution (100x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-091</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Tissue culture flask, 75 cm2 growth area</td>
			<td style="width:100px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">658175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager

Mobilidade de células de câncer é crucial para a iniciação de metástase. Portanto, a investigação do movimento da célula e capacidade invasiva é de grande importância. Ensaios de migração fornecem uma visão básica do movimento de célula a um nível 2D, Considerando que os ensaios de invasão são fisiologicamente mais relevantes, imitando a expulsão de célula de câncer em vivo do site original e invadindo através da matriz extracelular. O protocolo atual fornece um único fluxo de trabalho para os ensaios de migração e invasão. Juntamente com a automatizado microscópica câmera integrada para imagens HD em tempo real e análise de built-in módulo, dá pesquisadores um tempo-eficiente, simples e reprodutível opção experimental. Este protocolo inclui também substituições para os consumíveis e métodos de análise alternativos para os usuários a escolher de.

Este ensaio de migração/invasão baseia-se o ensaio de cura da ferida, que avalia a taxa das células entrando uma área livre de celular criada pela ferramenta zero 96 pinos. A diferença entre os ensaios de migração e invasão são que ensaios de migração células medida movendo-se sobre os tecido-cultura tratada plástico superfície e invasão medidas células movendo gel de ECM.
A ferramenta para raspar é projetada p...

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A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

A mobilidade celular cancerígena é crucial para o início da metástase. Portanto, a investigação do movimento celular e da capacidade invasiva das células tumorais é de grande interesse. Este método integrado para investigar a migração e invasão de células cancerígenas, em uma única plataforma em tempo real, fornece uma opção facilmente reproduzível e eficiente para estudar mobilidade celular e patologia.Este método pode fornecer informações sobre a invasão de células cancerosas, através da matriz extracelular, e pode ser aplicado a outros tipos de células. Para alcançar um tempo ideal de risco, certifique-se de que a densidade de semeadura tenha sido otimizada e não prolongue o período de incubação uma vez que a monocamada celular tenha atingido 100% de confluência. Para determinar o número ideal de células semeadas para um ensaio de migração, coloque as células em uma variedade de densidades em triplicado em uma placa de 96 paredes.Coloque a placa no imager de célula ao vivo e selecione as varreduras de agendamento da lista de tarefas no software imager. No painel de configuração da gaveta, determine as posições da placa e clique em adicionar vaso para selecionar o tipo de placa. No painel de configuração da digitalização, selecione ou edite o padrão de varredura de acordo com a configuração da placa experimental e defina o tipo de varredura como padrão.Clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione intervalos definidos. Em seguida, defina adicionar varreduras a cada duas horas durante 24 horas e clique em aplicar. Após 24 horas, abra a configuração da gaveta para permitir que a placa experimental seja selecionada e clique em remover o vaso.Selecione de três a seis imagens representativas e coloque-as em uma nova coleção de imagens. Para determinar uma definição adequada de processamento, use ajuste de segmentação, limpeza e filtros para aplicar uma máscara de confluência apropriada e use a corrente de visualização all'to ver a precisão das máscaras. Inicie o trabalho de análise e determine uma densidade celular otimizada, de acordo com uma confluência aproximada de 100% contra o tempo, dentro de seis a dezoito horas, dependendo de quando o ensaio migratório começa.Em seguida, aplique a ferramenta de análise de processamento de confluência às imagens de contraste de fase de alta definição coletadas automaticamente para gerar uma curva de proliferação celular contra o tempo. Antes de iniciar o ensaio, cubra a placa para o ensaio de invasão com 50 microliters de gel de matriz extracelular, diluído em meio de cultura celular gelada, a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular durante a noite.Na tarde seguinte, aspire suavemente o excesso médio, e emplaque as células na densidade otimizada, em triplicado, nos poços apropriados da placa revestida de matriz extracelular, e em uma placa adicional não revestida de 96 poços. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular durante a noite. Na manhã seguinte, coloque a placa de ensaio de migração não revestida no suporte da placa base da ferramenta de arranhão e use as dowels guiantes para colocar cuidadosamente a parte superior do suporte sobre a base.Pressione e segure a alavanca preta enquanto levanta cuidadosamente o bloco do pino para fazer os arranhões. Os arranhões em cada poço devem ser visíveis a olho nu, bem como sob o microscópio. Em seguida, lave a placa uma ou duas vezes com meio de cultura pré-aquecido para remover quaisquer células ou folhas de células separadas.Para o ensaio de invasão, arranhe a placa revestida como apenas demonstrado. Depois de remover quaisquer células e folhas separadas, use uma caixa fria pré-refrigerada para equilibrar a placa em quatro graus Celsius por cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente o meio frio. Em seguida, adicione 50 microliters de gel de matriz extracelular diluído nos poços apropriados e coloque a placa na incubadora de cultura celular por trinta minutos.Bolhas são comuns quando se trabalha com gel de matriz extracelular, mas podem ser eliminadas aspirando 70% de etanol. Em seguida, adicione 100 microliters de meio fresco e quente, com ou sem o composto de teste, aos poços apropriados da placa de ensaio de migração ou invasão, e coloque a placa na plataforma de imagem celular viva. Para limpar a ferramenta de risco, coloque o bloco de pinos superiores em barcos individuais de lavagem de 45 mililitros, contendo 5% de detergente, um por cento de detergente dois, água destilada estéril ou 70% de etanol por cinco minutos por lavagem antes de colocar a ferramenta de risco de volta em sua placa base, para armazenamento em um ambiente sem poeira.Para a imagem dos ensaios da ferida, depois de permitir que a placa se equilibre por cinco minutos, selecione o tipo de vaso como o plano de registro de imagem e defina o tipo de varredura como ferida de arranhão. Selecione ou edite o padrão de varredura, de acordo com a configuração da placa experimental, e agende 24 horas de repetição a cada uma ou duas horas durante 72 horas, ou até que as feridas sejam curadas como demonstrado. Quando todas as feridas tiverem cicatrizado, pare a varredura e selecione de três a seis imagens representativas, abrangendo uma série de percentagens sonoras, incluindo imagens logo após a ferida ter sido feita, e fechamento da ferida em 10 e 50%.Para determinar uma definição adequada de processamento, aplique uma máscara de ferida de arranhão apropriada e uma máscara de confluência como demonstrado, e use a corrente de visualização all'to ver a precisão das máscaras. Então, inicie o trabalho de análise. Em um ensaio de migração, a largura da ferida é a distância média entre as folhas celulares ao lado da ferida.A confluência da ferida é a confluência dentro da área ferida. A confluência inicial de ferida ideal deve ser próxima de zero por cento. A densidade relativa da ferida e a confluência da ferida sugerem a velocidade das células que ocupam a área da ferida de arranhão.Esses dados quase se sobrepõem em ambas as linhas celulares representativas. Diferentes linhas celulares demonstram habilidades de cicatrização de feridas muito diferentes, indicando habilidades migratórias diferenciais entre as linhas celulares. Por exemplo, a lamellipodia é observada nesta linha celular de adenocarcinoma mamário na frente de migração no início da migração, enquanto esta linha de células cancerígenas de mama produtora de mucina não exibiu nenhum sinal de migração celular ao mesmo tempo.Além disso, a densidade relativa da ferida da linha de adenocarcinoma mamário foi saturada após 50 horas, enquanto a densidade relativa da ferida da linha de células cancerígenas de mama produtora de mucina 1 não mudou com o tempo, ressaltando o fenótipo altamente invasivo das células adenocarcinoma e a não invasiva das células cancerígenas de mama produtoras de mucina 1. As células de adenocarcinoma também se comportaram de forma diferente enquanto invadiam o gel da matriz extracelular, demonstrando uma morfologia alongada com saliências líderes, e em ensaios migratórios, um bleb na frente migratória foi visualizado. Ao emplacar, lembre-se que se poucas células forem semeadas, o arranhão não se formará adequadamente, e se muitas células forem semeadas, haverá superlotação.Após este procedimento, podem ser adicionados tratamentos de pista, permitindo que este método seja adaptado para triagem de faixa de alto rendimento. Esse método permite que os pesquisadores realizem esses ensaios em uma única plataforma, que é de alto rendimento, e permite que os pesquisadores monitorem suas células em tempo real, em vez de em ponto final experimental. Os desinfetantes utilizados para esterilizar a ferramenta de arranhão podem ser perigosos.Certifique-se de coletar e descartar as soluções de acordo com o MSDS relevante e as linhas de gatilho regulares de sua instalação.

Research

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Cancer Research

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