Name: a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00
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Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Fundación del grupo de Bloomfield a través del Instituto de investigación médica Hunter (HMRI 13-02). XZ es apoyado por una beca de la APA a través de la Universidad de Newcastle y la beca de doctorado HCRA biomarcadores insignia.

Nota: Dos líneas celulares deben tratarse por separado. Los siguientes procedimientos deben aplicados a una línea de celular solo si no se especifica.
1. optimizar la densidad de la célula antes de la herida
<ol><li>Las células adherentes en frascos de cultivo de tejidos T75 cm2 a cerca de 80% de la cultura confluencia en de rojo de fenol libre Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 200 mM L-glutamina y 2 insulin...

<ol>
	<li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control.">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li><li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis.">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li><li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+driving+epithelial+wound+healing.">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis.">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li><li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research.">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).</li><li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment.">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li></ol>

Migración y la invasión son parámetros importantes para evaluar la movilidad de las células cancerosas. Mediante la herramienta scratch de 96 pines, es posible llevar a cabo la cicatrización análisis en 2D y 3D simultáneamente. Aparte de facilitar la exploración automática, proporcionando un ambiente de cultura de célula estable con mínima interrupción, el rasguño ensayo realizado con la herramienta scratch de 96 pines proporciona constantes heridas rasguños, permitiendo experimentos que son más robustos y...

Migración celular y la invasión son procesos biológicos importantes que permiten las funciones normales del cuerpo humano, como el cierre de la herida, invasión de la placenta en el útero y glándula mamaria morfogénesis1,2,3. El cuerpo humano tiene el control preciso y estricto de estos acontecimientos biológicos; sin embargo, hay algunas excepciones. Tumores malignos, por ejemplo, son capaces de escapar de esta salvaguardia, exhibir proliferación anormal e invadir el tejido vecino, que se llama metástasis. La metástasis es la causa principal de mortalidad relacionada con cáncer4.
Cáncer de mama es el más comúnmente diagnosticado cáncer en la mujer y es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer entre las mujeres en los países desarrollados en todo el mundo5. El cáncer de mama se origina de los conductos o lobulillos que constan de una o más capas de células epiteliales. En la mama normal, las células epiteliales se adhieren unos a otros y a la membrana basal a través de proteínas de membrana como la E-cadherina e integrinas6. Sin embargo, las células de cáncer de mama invasivo han perdido su polaridad y la adherencia de la célula, clásico experimentan la transición epitelial mesenquimal (EMT) y obtienen la capacidad de moverse. Después de la extravasación, estas células mover a través de la matriz extracelular (ECM) y entrar en los vasos sanguíneos o el sistema linfático, seguido luego por intravasación y crecimiento metastásico7. Comprensión de los mecanismos por los cuales esto se produce es de gran importancia, puesto que la metástasis es la causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer y está estrechamente relacionado con el cáncer migración/invasión de la célula. Para visualizar el movimiento de las células cancerosas, ensayos de migración y la invasión son modelos ideales para el estudio de movimiento de la célula 2D y 3D, respectivamente. Migración evalúa directamente el movimiento de las células mientras que la invasión implica la interacción con el microambiente y la capacidad para degradar barreras biológicas. Los dos procesos no son totalmente independientes uno del otro, como la migración es un requisito de la invasión.
Varios métodos se han desarrollado para estudiar la migración y la invasión. Como revisado por Kramer et al., ensayos de migración como la cicatrización de heridas, análisis de micro-portador y cerca de generan un área libre para permitir a las células para que mover, evaluar el cambio de área; mientras que los análisis transwell y capilar se basan en el número de células que se mueven hacia un atrayente8. Para los ensayos de invasión, un ambiente de ECM tiene que configurarse con gel de ECM o colágeno por ejemplo, y movimiento 3D puede evaluarse mediante el control de las cuentas de área, distancia y celular de la invasión (e.g. transwell ensayo, ensayo de platypus)8. Otro tipo de ensayo de invasión es combinar las células invasoras con células no-invasivo y evaluar el comportamiento de las células invasoras (e.g. ensayos de esferoide). Los métodos tienen sus pros y contras y una manera fácil de enfoque, fácil de repetir y combinar el análisis de la migración y la invasión en un flujo de trabajo similar es preferencial en diseño experimental.
Este protocolo describe la medición de la migración celular y la invasión utilizando un reproductor de imágenes de células vivas. Es un celular en tiempo real sistema instalado en una incubadora de cultivo de célula estándar de monitoreo. Toma imágenes de alta definición según el sistema de análisis de intervalos y mediciones aplicando máscaras apropiadas a las células o fluorescentes blancos. El módulo de análisis de migración/invasión incluye el uso de una herramienta scratch de 96 pines, que es conveniente para hacer heridas de rasguño homogéneas en una monocapa de células en una placa de 96 pocillos. El mecanismo se basa en in vitro herida curación ensayos, control de movimiento celular 2D en un plástico o superficie cubierta. Invasión o movimiento 3D a través de un ECM adicional dentro de la raya de la herida también puede ser evaluada. Un breve flujo de trabajo se ilustra en la figura 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30028-02</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 2x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMQAX1000</td>
			<td style="width:167px;">Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 1 (Alconox)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">242985</td>
			<td style="width:167px;">0.5% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Detergent 2 (Virkon S)</td>
			<td style="width:100px;">VetProduct DIRECT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1% working concentration</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:309px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21063-045</td>
			<td style="width:167px;">Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &#956;g/ml insulin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">ECM Gel (matrigel)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6909</td>
			<td style="width:167px;">Growth-factor reduced, phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">EVE Counting slides</td>
			<td style="width:100px;">BioTools</td>
			<td style="width:119px;">EVS-50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:100px;">Bovogen Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">SFBS-F-500ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4444</td>
			<td style="width:167px;">Including CoolBox, 2x CoolSink</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">IncuCyte Cell migration kit</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;">4493</td>
			<td style="width:167px;">Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">IncuCyte ZOOM</td>
			<td style="width:100px;">Essen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Live cell analysis system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">19278-5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">L-glutamine solution (100x)</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-091</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Tissue culture flask, 75 cm2 growth area</td>
			<td style="width:100px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">658175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple migration/invasion workflow using an automated live-cell imager

Movilidad de la célula de cáncer es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación de movimiento celular y capacidad invasiva es de gran importancia. Ensayos de migración proporcionan información básica del movimiento de la célula en un nivel 2D, mientras que los ensayos de invasión son más fisiológicamente relevantes, imitando el desplazamiento de la célula de cáncer en vivo desde el sitio original e invadiendo a través de la matriz extracelular. El protocolo actual proporciona un único flujo de trabajo para los ensayos de migración y la invasión. Junto con la cámara microscópica automatizada integrada para el módulo de análisis integrado y en tiempo real imágenes de alta definición, da a investigadores un tiempo eficiente, simple y reproducible opción experimental. Este protocolo también incluye sustituciones para los consumibles y los métodos de análisis alternativos para los usuarios elegir.

Este análisis de migración/invasión se basan en el análisis de curación de herida, que evalúa la tasa de las células en un área libre creada por la herramienta scratch de 96 pines. La diferencia entre los ensayos de migración y la invasión es que migración ensayos de medida de células en el cultivo de tejidos tratado superficie e invasión medidas células plásticas moviéndose a través del gel de la ECM.
La herram...

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A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

La movilidad de las células cancerosas es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación del movimiento celular y la capacidad invasiva de las células tumorales es de gran interés. Este método integrado para investigar la migración e invasión de células cancerosas, en una sola plataforma en tiempo real, proporciona una opción fácilmente reproducible y eficiente en el tiempo para estudiar la movilidad celular y la patología.Este método puede proporcionar información sobre la invasión de células cancerosas, a través de la matriz extracelular, y se puede aplicar a otros tipos de células. Para lograr un tiempo óptimo de rayado, asegúrese de que la densidad de siembra se ha optimizado y no prolonga el período de incubación una vez que la monocapa celular ha alcanzado el 100 por ciento de confluencia. Para determinar el número óptimo de celdas sembradas para un ensayo de migración, coloque las células en un rango de densidades en triplicado en una placa de 96 paredes.Coloque la placa en el imager de celda en vivo y seleccione los escaneos de programación de la lista de tareas en el software imager. En el panel de configuración del cajón, determine las posiciones de la placa y haga clic en Agregar recipiente para seleccionar el tipo de placa. En el panel de configuración del análisis, seleccione o edite el patrón de escaneado de acuerdo con la configuración de la placa experimental y establezca el tipo de escaneado como estándar.Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione establecer intervalos. A continuación, establezca agregar exploraciones cada dos horas durante 24 horas y haga clic en Aplicar. Después de 24 horas, abra la configuración del cajón para permitir que se seleccione la placa experimental y haga clic en Quitar recipiente.Seleccione de tres a seis imágenes representativas y colóquelas en una nueva colección de imágenes. Para determinar una definición de procesamiento adecuada, utilice el ajuste de segmentación, la limpieza y los filtros para aplicar una máscara de confluencia adecuada y utilice la vista previa actual all'para ver la precisión de las máscaras. Inicie el trabajo de análisis y determine una densidad celular optimizada, de acuerdo con una confluencia aproximada del 100 por ciento contra el tiempo, dentro de seis a dieciocho horas, dependiendo de cuándo comience el ensayo de migración.A continuación, aplique la herramienta de análisis de procesamiento de confluencia a las imágenes de contraste de fase de alta definición recopiladas automáticamente para generar una curva de proliferación celular frente al tiempo. Antes de comenzar el ensayo, cubra la placa para el ensayo de invasión con 50 microlitros de gel de matriz extracelular, diluido en medio de cultivo celular helado, a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Luego, coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante la noche.A la tarde siguiente, aspirar suavemente el exceso de medio, y placar las células en la densidad optimizada, en triplicado, en los pozos apropiados de la placa recubierta de matriz extracelular, y en una placa adicional sin recubrimiento de 96 pozos. A continuación, coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante la noche. A la mañana siguiente, coloque la placa de ensayo de migración sin recubrimiento en el soporte de la placa base de la herramienta de arañazos, y utilice los tacos guía para colocar cuidadosamente la parte superior del soporte en la base.Mantenga pulsada la palanca negra mientras levanta cuidadosamente el bloque de pasador para hacer los arañazos. Los arañazos en cada pozo deben ser visibles a simple vista, así como bajo el microscopio. Luego, lave la placa una o dos veces con un medio de cultivo precalecido para eliminar las células o láminas de celda separadas.Para el ensayo de invasión, rasque la placa recubierta como se acaba de demostrar. Después de retirar las células y láminas desprendidas, utilice una caja fría pre-refrigerada para equilibrar la placa a cuatro grados Celsius durante cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente el medio frío. A continuación, agregue 50 microlitros de gel de matriz extracelular diluido en los pozos apropiados y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante treinta minutos.Las burbujas son comunes cuando se trabaja con gel de matriz extracelular, pero se pueden eliminar aspirando un 70 por ciento de etanol. A continuación, agregue 100 microlitros de medio fresco y cálido, con o sin el compuesto de prueba, a los pozos apropiados de la placa de ensayo de migración o invasión, y coloque la placa en la plataforma de imágenes de células vivas. Para limpiar la herramienta de arañazos, coloque el bloque de pasador superior en recipientes individuales de lavado de 45 mililitros, que contienen un 5 por ciento de detergente uno, un porcentaje de detergente dos, agua destilada estéril o 70 por ciento de etanol durante cinco minutos por lavado antes de volver a colocar la herramienta de arañazos en su placa base, para su almacenamiento en un entorno libre de polvo.Para obtener imágenes de los ensayos de la herida, después de permitir que la placa se equilibre durante cinco minutos, seleccione el tipo de recipiente como el plano de registro de la imagen y establezca el tipo de escaneo como herida de arañazo. Seleccione o edite el patrón de escaneo, de acuerdo con la configuración de la placa experimental, y programe 24 horas de exploración repetida cada una o dos horas durante 72 horas, o hasta que las heridas se curen como se ha demostrado. Cuando todas las heridas se hayan curado, detenga la exploración y seleccione de tres a seis imágenes representativas, que abarcan una serie de porcentajes de sonido, incluidas las imágenes justo después de que se haya hecho la herida, y el cierre de la herida en un 10 y un 50 por ciento.Para determinar una definición de procesamiento adecuada, aplique una máscara de herida de arañazo adecuada y una máscara de confluencia como se ha demostrado, y utilice la vista previa actual all' para ver la precisión de las máscaras. A continuación, inicie el trabajo de análisis. En un ensayo de migración, el ancho de la herida es la distancia media entre las hojas de celda junto a la herida.La confluencia de la herida es la confluencia dentro de la zona herida. La confluencia inicial ideal de la herida debe estar cerca del cero por ciento. La densidad relativa de la herida y la confluencia de la herida sugieren la velocidad de las células que ocupan el área de la herida de arañazo.Estos datos casi se superponen en ambas líneas celulares representativas. Diferentes líneas celulares demuestran habilidades de cicatrización de heridas muy diferentes, lo que indica capacidades migratorias diferenciales entre las líneas celulares. Por ejemplo, la lamellipodia se observan en esta línea celular de adenocarcinoma mamario en el frente de migración al comienzo de la migración, mientras que esta línea celular de cáncer de mama productora de mucina 1 no mostró signos de migración celular al mismo tiempo.Además, la densidad relativa de la herida de la línea del adenocarcinoma mamario se saturaba después de 50 horas, mientras que la densidad relativa de la herida de la línea celular de cáncer de mama productora de mucina 1 no cambió con el tiempo, subrayando el fenotipo altamente invasivo de las células del adenocarcinoma y la no invasividad de las células cancerosas mamarias productoras de mucina 1. Las células del adenocarcinoma también se comportaron de manera diferente mientras invadieron a través del gel de matriz extracelular, demostrando una morfología alargada con protuberancias líderes, y en ensayos de migración, se visualizó un bleb en el frente migratorio. Al enchapar, recuerde que si se siembran muy pocas células, el rasguño no se formará correctamente, y si se siembran demasiadas células, habrá hacinamiento.Después de este procedimiento, se pueden agregar tratamientos de seguimiento, lo que permite adaptar este método para el cribado de pistas de alto rendimiento. Este método permite a los investigadores realizar estos ensayos en una sola plataforma, que es de alto rendimiento, y permite a los investigadores monitorear sus células en tiempo real, en lugar de en el punto final experimental. Los desinfectantes utilizados para esterilizar la herramienta de arañazos pueden ser peligrosos.Asegúrese de recopilar y desechar las soluciones de acuerdo con el MSDS relevante y las líneas de activación regulares de su instalación.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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