Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

امتنان يعترف الكتاب تمويل مراكز البحوث التعاونية DFG SFB 1181 و 241 تر. بصري تصوير المركز ارلنجن (OICE) وخاصة رالف بالميسانو وفيليب Tripal وتينا Fraaß (Z2 المشروع من DFG CRC 1181) معترف بها لخبراء الدعم الفني للتصوير المجهري fluorescence الورقة الضوء.

وأجريت التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا لبروتوكولات معتمدة من قبل السلطات المحلية ذات الصلة في ارلنجن (ريجيرونج فون اونترفرانكين، فورتسبورغ، ألمانيا). تم إيواء الفئران تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض. جمع الدم البشري أقرته اللجنة الأخلاقية المحلية ومجلس المراجعة المؤسساتية ...

الإعداد التجريبية الموصوفة هنا يوفر الفرصة لرصد قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا المناعية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية، ومما الناقوس يكمل كلاسيكي التصاق في الأنابيب وانزيمية فحوصات. على أن تراعي الهيئة التشريحية محددة الخصائص في الرئة، جوانب هامة من الخلاي?...

الكلاسيكية اضطرابات التهاب في الرئة، مثل حساسية الربو ومرض انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، معروفة جيدا يكون مدفوعا توظيف المتزايد لتنشيط الخلايا الليمفاوية في أنسجة الرئة1،2. صدر اللمفاويات السيتوكينات (مثلاً، وايل-4، وايل-5، 9 إيل، إيل-13، IFN-γ وتنف-α) مواصلة تعزيز إنزيمية للخلايا المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، والحث على إعادة عرض مجرى الهواء تليفية أو أضرار مباشرة في لحمه الرئة2. وحتى الآن، الآليات الأساسية المسؤولة عن تراكم المرضية للخلايا الليمفاوية داخل أنسجة الرئة لا بعد فهم فهما كاملا. قياسا إلى الطباعة النسيج انتقائية تي خلية وصفت لصاروخ موجه القناة الهضمية والجلد، الخلايا الجذعية الرئوية (DCs) قادرة ومن الواضح أن رئيس الوزراء خلايا تي الطرفية لتسلل الرئة تفضيلية، على الأقل جزئيا عن طريق تنظيم دورات تعريفية للتعبير CCR4 على سطح الخلايا الليمفاوية3. بالإضافة إلى CCR4، وخلايا تي التسلل إلى مجرى الهواء تتميز أيضا بتعبير لا سيما زيادة مستقبلات chemokine CCR5 و CXCR3 بالمقارنة مع خلايا T داخل الدم الطرفية1،،من45. البيانات الشاملة، القائمة تتسق مع مفهوم أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا اللمفية تي تحت ظروف فسيولوجية أو تحريضية ينطوي على عدد من مستقبلات تشيموكيني مختلفة وعلى يغاندس كل منهما وهكذا حاسمة يتوقف على عن كثب التحكم في التعاون بين الخلايا المناعية الفطرية والتكيف1. خصوصا، خلال المرحلة الأولى من التعرض للعوامل الممرضة أو المسببة للحساسية، خلايا نظام المناعة الفطرية الاستجابة للتحفيز TLR أو لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة العابرة للربط بالإفراج الفوري عن تشيمواتراكتانتس المختلفة، مثل لتب4، CCL1، CCL17، CCL22، CCL20، CXCL10، و PGD21،،من67. كمثال، التفاعل بين PGD2 ومستقبلات تشيمواتراكتانت CRTh2 ومن المعروف أن تكون ذات أهمية خاصة بالنسبة إنزيمية خلايا Th2 وهكذا يبدو الهدف العلاجي كما تبشر بالخير في الإدارة السريرية للربو. وفي الواقع، مرضى الربو المعتدل أظهرت تحسنا في الأعراض وزيادة كبيرة في حجم الزفير القسري في ثانية واحدة (FEV1) بعد العلاج مع خصم CRTh2 انتقائية مقارنة مع مجموعة الغفل8 ،9. في حالة أكثر تقدما من الاستجابة الالتهابية، خلايا تي المعينين أصلاً قادرة على تضخيم زيادة تراكم اللمفاويات الرئوي عن طريق الإفراج عن إيل-4، وايل-13 كمحفزات قوية لوحدات تحكم المجال Dc الرئوية. في وقت لاحق، هذه الخلايا الفطرية النقوي المشتقة يصل-تنظيم التعبير عن CCL17 و CCL22 في STAT6-تعتمد على طريقة1،،من1011.  على الرغم من أن الطابع المعقد للسيناريو الذي وصف لا يزال يعوق فهم كامل للرئة الخلية تي صاروخ موجه، ويقدم مجموعة كبيرة أهداف الجزيئية لعنصر تحكم علاجية المحتملة أمثل لأمراض الجهاز التنفسي التهابات أو حساسية. ولذلك، هناك حاجة ملحة للتقنيات التجريبية المبتكرة، التي قادرة على تعميق وتكمل معرفتنا في مجال إنزيمية خلية تي والرئة صاروخ موجه.
يرجع ذلك إلى حقيقة أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا الليمفاوية داخل جسم الإنسان يتأثر ب معلمات الخلوية وخلطيه ومادية متعددة1، معظم الأساليب التجريبية الحالية ليست قادرة على نموذج كامل مدى تعقيد هذه العملية المناعية. بدلاً من ذلك، يركز العديد من البروتوكولات القياسية لتحليل الرئة صاروخ موجه بشكل انتقائي على جانب محدد تشارك في سلسلة من جاذبية اللمفاويات والالتصاق، والهجرة والاحتفاظ بها. وإلى جانب تحديد وصفية بحتة لنمط التعبير مرناً أو البروتين مستقبلات إينتيجرينس وتشيموكيني في الخلايا اللمفية الطرفية أو التسلل إلى الرئة وقياس مستويات كل منها تشيموكيني في الدم، مكملة للفيسيولوجيا الغسل (بال) أو أنسجة الرئة12،13،،من1415، ثقافة راسخة الخلايا في المختبر فحوصات السماح لتوصيف وظيفي لالتصاق الخلايا اللمفاوية أو إنزيمية عند تعريف الظروف التجريبية16،،من1718. من حيث المبدأ، رصد فحوصات التصاق في الأنابيب ثابت قدرة الربط لمفاوية مثقف لأحادي الطبقة غشائي أو شرائح زجاجية مغطاة بجزيئات الالتصاق غشائي المؤتلف (مثلاً، مادكام-1، VCAM-1)، بينما المعيار في المختبر عادة ما يتم تطبيق فحوصات إنزيمية من أجل قياس قدرة الخلايا الليمفاوية ترحيل على طول تدرج تشيموكيني في نظام ترانسويل19. كلا الإعدادات في المختبر تمكن من التكيف التي تسيطر عليها والتحوير للظروف التجريبية، ولكن من ناحية أخرى تفتقر إلى متغيرات هامة تعرف بالغة الأثر على إنزيمية في الحية والتصاق الخلايا الليمفاوية. يغلب عليها الطابع، تجاهل تأثير قوي القص الناتجة عن تدفق الدم الدائمة19 فحوصات الثقافة الخلية ثابت ويحتمل أن إهمال مشاركة الوسط المناعية المحيطة والمتفاعلة الخلايا المناعية غير اللمفاويات، كل هذا في حي. وللتغلب على هذه القيود، تفسير النتائج المكتسبة في ثابتة في المختبر فحوصات إنزيمية أو الانضمام تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في تجارب التصاق الحيوية تحت ظروف تدفق20،21 وفي فيفو نماذج من أمراض التهابات الجهاز19. في الواقع، يمكن استخلاص استنتاجات بشأن تنظيم الرئة الخلية تي صاروخ موجه تحت ظروف التهابات أو حساسية من الدراسات الحيوانية الهامة تحليل وراثيا تعديل الفئران في نماذج محددة لمختلف الأمراض الرئوية3، 22 , 23-مقارنة كمية من التسلل إلى الخلايا الليمفاوية بين wildtype الفئران والفئران مع نقص جين معين من الفائدة يمثل أداة راسخة والمستخدمة على نطاق واسع لتحديد أثر الخلوية خاصة الرئة المسارات أو مستقبلات على نمط توزيع T خلية يحركها المرض. ومع ذلك، خلافا لقبل مناقشة الثقافة الخلايا في المختبر فحوصات، تصميم دراسة استناداً إلى نماذج حيوانية الكلاسيكية يفتقر إلى القدرة على تحليل ورصد خلايا تي البشرية الأولية المستمدة مباشرة من الدم أو بال للمرضى الذين يعانون من التهابات الرئة المرض. وهكذا، فإنه لا يزال تحديا وظيفيا التحقق من صحة ما إذا كان مرض الرئة دياجنوستيكالي محدد قادرة على بصمة الخلايا الليمفاوية البشرية انتحاء الرئة تفضيلية ومدى المعلمات السريرية قد يؤثر على هذا السيناريو. ومؤخرا، تم إدخال نهج المجراة في أنيقة جداً في سياق أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، التي تمكنت من التغلب على معظم هذه القيود وفتح آفاقاً جديدة لدراسات متقدمة متعدية الجنسيات في اللمفاويات المعوية صاروخ موجه24 . الاستفادة من البروتوكولات لإزالة النسيج المستندة إلى المذيبات تليها مجهرية مستعرضة ورقة الضوء الفلورية كأداة قوية لتصوير، كان من الممكن تصور تسلل وتوزيع الخلايا البشرية المنقولة أدوبتيفيلي في الأمعاء من الفئران العوز كوليتيك24. على وجه الخصوص، تطبيق هذا الإعداد التجريبية اثنان من الابتكارات الرئيسية: يمكن تحليل الخلايا المناعية البشرية الأولية (1) تحت ظروف المجراة في تجريبيا محددة؛ (2) منطقة كبيرة بدلاً من الجهاز المريضة (حوالي 1.5 × 1.5 سم) يمكن تصويرها بجودة عالية الدقة، تليها 3D-التعمير. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات الأخيرة نجحت في إنشاء استخدام النسيج المستندة إلى المذيبات المقاصة والأسفار الضوء-ورقة الفحص المجهري كأدوات هامة للرئة المتقدمة التصوير،من2526. من أجل الاستفادة من هذا التقدم التكنولوجي في مجال علم المناعة الرئوية، ونحن الآن اعتمد النظام لتحليل الرئة صاروخ موجه.
يوفر البروتوكول المعروضة هنا مقدمة خطوة بخطوة كيفية تنقية والتسمية تي البشرية الأولية الخلايا لنقل في الفئران مع التهاب رئوي المستحث، وعلاوة على ذلك، يصف بالتفصيل عملية لاحقة للضوء--ورقة فلوريسسينتلي التصوير المجهري الأسفار، بما في ذلك إعداد الجهاز ومعالجة الصور. وعموما، نأمل لدعم الدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل في مجال أمراض الرئة التهابات أو حساسية بإدخال متطورة، لكن نموذج مجدية، والتجريبية لرصد صاروخ موجه الرئة اللمفاويات البشرية بناء على ظروف المجراة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

الساحقة تراكم الأنسجة للغاية تنشيط الخلايا المناعية يمثل سمة مميزة لمختلف الأمراض المزمنة التحريضية، وبرزت بوصفها هدفا جذاباً علاجية في المعالجة السريرية للمرضى المتضررين. من أجل مواصلة تحسين استراتيجيات تهدف إلى تنظيم العلاجية من تسلل الخلايا المناعية برو-التهابات أنسجة مرضية غير متوازن، ستكون ذات أهمية خاصة لتحقيق رؤى تحسن في حدة المرض والجهاز صاروخ موجه خصائص الخلايا اللمفية الطرفية. يسمح البروتوكول التجريبي المبين هنا لرصد تراكم الرئة من الخلايا الليمفاوية البشرية المسماة فلوريسسينتلي ونقلت أدوبتيفيلي في سياق التهاب الرئوي الناجم عن غراء. وعلى النقيض من فحوصات في المختبر القياسية استخداماً لتحليل الهجرة الخلية المناعية وانزيمية، الإعداد المجراة في أدخلت الآن يأخذ في الحسبان الجوانب الخاصة بالرئة من الأنسجة المنظمة وتأثير المجمع التحريضية السيناريو تجري في الحي مورين. وعلاوة على ذلك، التصوير المجهري الفلورية الضوء-ورقة مقطعية ثلاثية الأبعاد لا توفر البيانات الكمية فقط على التسلل إلى الخلايا المناعية، ولكن أيضا يصور نمط الخلية المناعية التعريب داخل الرئة الملتهبة. وعموما، نحن قادرون على الأخذ تقنيات مبتكرة ذات قيمة عالية للبحوث المناعية في مجال الأمراض المزمنة التهاب الرئة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة باتباع البروتوكول خطوة بخطوة المتوفرة.

البروتوكول قدم وصف لنموذج ماوس تجريبية، والذي يسمح برصد وقياس تراكم أدوبتيفيلي المنقولة لمفاوية T البشرية في الرئة عن طريق المجهري الفلورية الضوء-ورقة. الشكل 1 A لمحة تخطيطي الخطوات المجراة في الجدول الزمني التجريبي. من أجل ضمان نتائج موثوقة، أنها ذات أهمية كبيرة...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

يسمح البروتوكول أدخل هنا وصف قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية. تسلل الرئوية أدوبتيفيلي نقل الخلايا المناعية البشرية في نموذج ماوس للالتهاب التحسسي يمكن تصويرها وكمياً بالفحص المجهري الفلورية الضوء-ورقة من أنسجة الرئة المطهرة كيميائيا.

المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

يسمح أسلوبنا التصوير الدقيق للخلايا المناعية البشرية المتراكمة في الرئتين في ظروف التهابية الجسم الحي توفير رؤى مثيرة في عملية توجيه الرئة الخلية T. يدعم هذا البروتوكول البحوث الانتقالية على توجيه الرئة الخلية T وبالتالي قد يساعد في تحديد أهداف جديدة للعلاج الأمثل من الأمراض الرئوية الالتهابية أو التحسسية. على وجه الخصوص، والقدرة على النظر في تأثير خصائص الخلايا المناعية خاصة بالأمراض، وتنظيم الأنسجة الرئوية، والوسط الالتهابي على توجيه الرئة خلية T يجعل هذه الطريقة مفيدة للغاية.عموما، لدينا تقنية ذات قيمة عالية للبحوث المناعية في مجال أمراض الرئة الالتهابية المزمنة، والتي غالبا ما تكون مدفوعة تراكم الأنسجة الساحقة من الخلايا المناعية المنشطة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في ما لا يقل عن 16 غرامًا ، ستة أسابيع ، تخدير C57 أسود ماوس 6J ، استخدم micropipet لتسليم 10 ميكرولترات ببطء من محلول باباين حديث الإعداد في أنف واحد من الفأر مرة واحدة في اليوم لمدة ثلاثة أيام متتالية. في اليوم التالي لإدارة الباباين الماضي ، طبقة 10 ملليلتر من Ficoll المتوسطة تحت الدم المحيطي البشري من متطوع صحي مخففة قبل نسبة واحد إلى اثنين في PBS لفصل التدرج الكثافة عن طريق الطرد المركزي.نقل خلية الدم أحادية النية الطرفية أو طبقة PBMC interphase في أنبوب جديد 50 ملليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بإجراء عزل ميكروبات مغناطيسي للخلايا الإيجابية CD4 وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. إعادة تعليق الخرز عزل CD4 الخلايا التائية الإيجابية في ما يصل إلى واحد مرات عشر إلى الخلايا التائية السابعة لكل ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من تركيز برنامج تلفزيوني.تسمية الخلايا مع ضوء أحمر مناسب صبغة الانتشار الخلايا مثير لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اعتقال رد فعل وضع العلامات مع خمسة مجلدات من متوسطة RPMI تكملها 10٪ FBS لمدة خمس دقائق على الجليد تليها ثلاثة يغسل في المتوسط. لنقل بالتبني من الخلايا T CD4 الإنسان إيجابية في الفئران المتلقية البابين المكشوفة، إعادة تعليق الخلايا التائية المسمى fluorescently إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر التركيز في برنامج تلفزيوني وتحميل 100 ميكرولتر من الخلايا في حقنة واحدة ملليلتر مجهزة إبرة 30 قياس لكل المتلقي، ثم حقن كامل حجم الخلايا من حقنة واحدة في الوريد الذي يعالج باباين الحفاظ على طرف إبرة داخل الوريد للحصول على إضافية خمس ثوان بعد تسليم الخلية لمنع تفريغ تعليق الخلية.بعد ثلاث ساعات من نقل الخلايا بالتبني، ثقب البطين الأيمن لكل فأر القتل الرحيم مع قنية قياس 21 متصلة قسطرة وجعل شق في البطين الأيسر. اثقب الرئة ببطء مع 20 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني تكملها خمسة ملليمولار EDTA تليها ملليلتر اثنين من الجليد البارد 4٪ شبهformaldehyde. عندما تم مسح كل من المثبت من خلال الأنسجة، وإزالة الغدد اللعابية وقطع العضلات الهنوية القصية للسماح ملقط أن تنزلق تحت القصبة الهوائية لفضح أنسجة الأنابيب الهوائية.قم بإجراء ثقب أولي في القصبة الهوائية المكشوفة بإبرة من 30 مقياسًا قبل استبدال الإبرة بقسطرة حادة عيار 30 لمنع المزيد من الضرر في الأنسجة. استخدام حامل إبرة لختم تقاطع بين القسطرة إدراج والقصبة الهوائية، وملء بعناية الشعب الهوائية مع ما يقرب من 37 درجة مئوية 0.75٪ agarose حتى تتكشف كاملة من الرئة. يعد وجود تقاطع محكم بين القسطرة والقصبة الهوائية أمرًا بالغ الأهمية لتوسيع الرئة إلى حجمها الفسيولوجي والحفاظ على بنية الأنسجة للتصوير.عندما تتوطد agarose تماما، وإزالة القسطرة ونقل بعناية الرئة إلى مظلمة، أنبوب مليلتر مملوءة 4٪ paraformaldehdye. بعد ذلك، تجفيف الأنسجة مع حضانات الإيثانول المتتابعة تحت التناوب المستمر في 31 دوران في الدقيقة وأربع درجات مئوية كما هو مبين لمدة أربع ساعات لكل حضانة. بعد الجفاف الكامل، نقل العينة إلى cinnamate الإيثيل لاحتضان ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة حتى الأنسجة تظهر شفافة.للحصول على مجهر الفلورسنت ورقة الضوء، استخدم قطرة صغيرة من الغراء مستقرة المذيبات العضوية لعصا الرئة إلى حامل العينة من المجهر وتعيين فص الرئة على حامل في وضع مستقيم. ضع حامل العينة في غرفته وحدد أشعة الليزر المناسبة للتجربة في برنامج الجهاز. بعد ذلك ، استخدم المتزلجون تحت Optics لتعيين عرض الورقة التي الفتحة العددية التي تكشف بشكل موحد عن الجهاز بأكمله أو قسم معين من الاهتمام.استخدم شريط التمرير لتعيين شدة الليزر تحت التحكم في انتقال الليزر لكل ليزر محدد وانقر فوق تطبيق. استخدم إعدادات القياس المتقدمة لدمج أوراق الضوء اليمنى والأيسر لإنشاء صورة مضيئة بشكل متجانس. حدد مواضع البداية والنهاية للرصيف Z ليتم قياسها تحت نطاق المسح الضوئي وقم بتعيين حجم الخطوة إلى خمسة ميكرومترات ثم حدد الحفظ التلقائي لحفظ الملفات تلقائيًا وبدء القياس لالتقاط الصور.عندما تم الحصول على جميع الصور، قم بتنشيط الزر تجاوز في برنامج تحليل ما بعد التصوير ثلاثي الأبعاد وقم بتحميل الصورة الأولى من مكدس Z واحد لبدء عملية إعادة البناء الافتتاحية والتلقائية ثلاثية الأبعاد لجميع الصور الأخرى للكومة Z المحددة، ثم تحت ضبط الشاشة، وضبط الكثافة، ومستوى اللون الأسود والتباين لكل قناة. لمقارنة تراكم الخلايا البشرية داخل الأنسجة الرئوية عبر عينات مختلفة، حدد تحرير والمحاصيل ثلاثية الأبعاد لتحديد مكعب الرئة بحجم معين. لتحديد عدد الخلايا المسماة داخل مكعب الرئة المحدد، افتح إضافة نقاط جديدة في شريط الأدوات، وانقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي، وتحرير يدويًا، وحدد قناة 640 نانومتر.تعيين مقياس نصف قطرها إلى 10.00 ميكرون، انقر فوق تحديد، وتحت تحرير، Shift انقر بزر الماوس الأيسر لوضع علامة على حدة كل خلية الفلوريسينغ مع نقطة. سيتم عرض العدد الإجمالي للخلايا التي تم حسابها في الإحصائيات. لالتقاط صورة، استخدم أداة اللقطة أو استخدم أداة الحركة لالتقاط فيديو.ينتج عن تخصيب الخلايا المستندة إلى الميكروبات ووضع العلامات المفلورة اللاحقة كما هو موضح عادةً نقاءً إيجابيًا لـ CD4 بنسبة 95٪ على الأقل ووضع علامات ناجحة لهذه الخلايا على النحو المحدد من خلال عملية استئصال الخلايا المتدفقة. الإيثيل cinnamate الأنسجة المستندة إلى المقاصة يحقق مستوى عال من شفافية الجهاز مما يدل على نجاح معامل الانكسار مطابقة. توفر إشارة الفلورسنت التلقائية للأنسجة الرئوية أداة مفيدة لتصوير البنية التشريحية للرئة عن طريق المجهر ورقة الضوء التي يمكن عرضها كتوقع متوسط كثافة أو في الوضع السطحي.مقارنة بالمجهر التقليدي، يقدم المجهر ورقة الضوء ميزة تصوير الجهاز كله وإعادة الإعمار 3D اللاحقة السماح لتحديد وتصور الانتشار صبغة التسمية، ونقل الخلايا التائية البشرية في سياق الجهاز كله، وعلاوة على ذلك، فإن تفضيل الخلايا التائية الإنسان المنقولة للتراكم الانتقائي داخل أنسجة الرئة الملتهبة من الحيوانات يتعرض باباين هو مدعوم كذلك من حقيقة أن الخلايا T CD4 الإيجابية لا يمكن استردادها من الغشاء المخاطي المعوي للحيوانات المتلقية. بالنسبة للكمية والمقارنة بين التراكم الرئوي للخلايا التائية الإيجابية CD4 البشرية بين الحالات المختلفة، يمكن أيضاً أن تحسب الخلايا المسماة في عدة مكعبات الرئة من الحجم المحدد كما هو موضح. إعداد الأنسجة بعناية بما في ذلك ضخ الرئة، والتضخم والأنسجة المقاصة مهم للغاية لجيل الأمثل من الصور المجهرية ورقة الضوء عالية الدقة.لمزيد من تأكيد الانقسامات الناجحة للخلايا الليمفاوية البشرية المنقولة ، يمكن بسهولة الجمع بين هذا البروتوكول مع القياس الكمي التدفقي للخلايا الليمفاوية البشرية داخل لافراج المورين القصبي. القدرة على رصد الخلايا المناعية المستمدة من المرضى الفردية في ظروف الجسم الحي يدعم تحديد التعديلات الوظيفية في الخلايا المناعية مطبوعة بمرض معين أو العلاج.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

تطوير بيئة المستندة إلى الصوت الألعاب الافتراضية للمساعدة في مهارات التنقل في مكفوفين

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

طريقة معزولة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الإرواء الرئة في الفئران نموذج: الدروس المستفادة من تطوير برنامج EVLP الجرذ

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

الفوسفور 31 الرنين المغناطيسي الطيفي: أداة لقياس<em&gt; في فيفو</em&gt; القدرة الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية في العضلات الهيكلية البشرية

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...