Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Forfatterne parlamentsarbejdet, finansiering af DFG Collaborative Research Centre SFB 1181 og TRR 241. Optisk Imaging Center Erlangen (OICE) og i særlige Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (projekt Z2 af DFG CRC 1181) er anerkendt for teknisk ekspertbistand til lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse.

Eksperimenter, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af de relevante lokale myndigheder i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus har været opstaldet på specifikt patogenfrie betingelser. Indsamling af humant blod blev godkendt af de lokale etiske udvalg og institutionelle review board af universitetet i Erlangen-Nürnberg. Hver patient gav skriftlig informeret samtykke.
1. fremkalde allergiske lungebetændelse i mus
<p ...

Den her beskrevne eksperimentelle indstilling giver mulighed for at overvåge den homing lungekapacitet primære human immun celler under in vivo betændelsestilstande og dermed relevant supplerer klassisk udføres in vitro-vedhæftning og chemotaxis assays. For at tage hensyn særlige anatomiske orgel Karakteristik af lungen, vigtige aspekter af immun celle homing (herunder chemotaxis og celle fordeling inden for målorgan) samt klinisk relevans og overførsel af erhvervede data, vi tog ford...

Klassiske inflammatoriske sygdomme i lungerne, såsom allergisk astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er kendt for at være drevet af et øget ansættelse af aktiverede lymfocytter i pulmonal væv1,2. Lymfocyt-udgivet cytokiner (fx, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) yderligere fremme chemotaxis af medfødte og adaptive immunceller, fremkalde fibrotisk luftvejene remodeling eller direkte skader lungerne parenkym2. Hidtil har er de underliggende mekanismer er ansvarlige for patologisk ophobning af lymfocytter i lungevæv endnu ikke fuldt forstået. I analogi med væv-selektiv T celle prægning beskrevet for gut og hud homing, pulmonal dendritiske celler (DCs) er naturligvis stand til prime perifert T-celler til præferentiel lunge infiltration, i det mindste delvist via induktion af CCR4 udtryk på de overfladen af lymfocytter3. Udover CCR4, er luftvejs-infiltrerer T celler også kendetegnet ved en særlig øget ekspression af chemokine receptorer CCR5 og CXCR3 i forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlede, eksisterende data er i overensstemmelse med begrebet at lunge homing af T-lymfocytter fysiologiske eller inflammatoriske betingelser omfatter en række forskellige chemokine receptorer og deres respektive ligander og dermed afhænger en nøje kontrolleret samarbejde mellem medfødte og adaptive immunceller1. Især i den indledende fase af patogen eller allergen eksponering reagerer celler af den medfødte immunsystem TLR stimulation eller IgE-medieret cross-linking af øjeblikkelig løsladelse af forskellige chemoattractants, ligesom LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et mønstereksempel, samspillet mellem PGD2 og chemoattractant receptor CRTh2 er kendt for at være af særlig betydning for chemotaxis Th2 celler og dermed syntes så lovende terapeutiske mål i den kliniske behandling af astma. Faktisk, patienter med moderat astma viste en forbedring af symptomer og en væsentlig forøgelse af den tvungen ekspirationsvolumen i ét sekund (FEV1) efter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist sammenlignet med placebo-gruppen8 ,9. I en mere skred det inflammatoriske respons er allerede ansat T celler i stand til yderligere forstærke pulmonal lymfocyt ophobning via frigivelse af IL-4 og IL-13 som potent stimuli for pulmonal DCs. Efterfølgende er regulere disse myeloid-afledte medfødte celler op-udtryk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-afhængige måde1,10,11.  Selv om kompleksiteten af det beskrevne scenario stadig hindrer en komplet forståelse af T celle lunge homing, tilbyder det et væld af molekylære mål for et potentielt optimeret terapeutisk kontrol af inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme. Derfor er der et presserende behov for innovative eksperimentelle teknikker, som er i stand til yderligere at uddybe og supplere vores viden inden for T-celle chemotaxis og lunge målsøgende.
At lunge homing af lymfocytter i den menneskelige krop er påvirket af flere cellulære og humorale fysiske parametre1, er de fleste af de eksisterende eksperimentelle metoder ikke købedygtig model af denne immunologiske proces hele kompleksitet. I stedet, mange standardprotokoller til analyse af lunge homing selektivt fokusere på et specifikt aspekt, der er involveret i kaskade af lymfocyt tiltrækning, vedhæftning, migration og fastholdelse. Ud over en beskrivende bestemmelse af mRNA eller protein udtryk mønster af integriner og chemokine receptorer på perifere eller lunge-infiltrerer lymfocytter og supplerende måling af respektive chemokine niveauet i blodet, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge væv12,13,14,15, veletablerede in vitro celle kultur assays tillade en funktionel karakterisering af lymfocyt vedhæftning eller chemotaxis ved defineret forsøgsbetingelser16,17,18. I princippet overvåge statiske in vitro-vedhæftning assays bindende kapacitet af kulturperler lymfocytter til en endotel éncellelag eller på glas dias belagt med rekombinant endotelial adhæsionsmolekyler (f.eks. MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard in vitro- chemotaxis assays er normalt anvendes til at kvantificere lymfocytter evne til at overføre langs en chemokine forløb i et transwell system19. Både in vitro-indstillinger aktiverer en kontrolleret justering og graduering af forsøgsbetingelser, men på den anden side mangler vigtige variabler kendt til kritisk indvirkning på in vivo chemotaxis og vedhæftning af lymfocytter. Overvejende, statisk celle kultur assays se bort fra indflydelsen fra shear styrker forårsaget af permanent blod flow19 og forsømme potentielt inddragelse af omkringliggende immunologiske milieu og interagerende ikke-lymfocyt immunceller, begge til stede i en levende organisme. For at overvinde disse begrænsninger, fortolkning af resultaterne opnået i statisk in vitro-chemotaxis eller overholdelse af assays skal yderligere validering i dynamisk friktionskoefficient eksperimenter under flow betingelser20,21 og i i vivo modeller af inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk vigtigt kunne drages konklusioner om regulering af T celle lunge homing inflammatoriske eller allergiske betingelser fra dyreforsøg analysere genetisk modificerede mus i definerede modeller af forskellige lungesygdomme3, 22 , 23. de kvantitative sammenligning af lunge infiltrerer lymfocytter mellem vildtype mus og mus med en mangel, for et bestemt gen af interesse udgør en veletableret og bredt anvendte redskab til at definere virkningen af særlige cellular veje eller receptorer på sygdom-drevne mønster af T celle distribution. Men i modsætning til før drøftet in vitro celle kultur assays, en undersøgelse design baseret på klassisk dyremodeller mangler evnen til at analysere og overvåge primære human T-celler direkte afledt af blod eller BAL af patienter, der lider af en inflammatorisk lunge sygdom. Således er er det stadig udfordrende at funktionelt validere om en diagnostisk angivne lungesygdom er købedygtig Kolofon humane lymfocytter til præferentiel lunge tropisme og hvor langt kliniske parametre kan have indflydelse på dette scenario. For nylig har blev en meget elegant in vivo tilgang indført i forbindelse med inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), som var i stand til at overvinde de fleste af disse begrænsninger og åbnet nye muligheder for avanceret translationel undersøgelser på intestinal lymfocyt homing24 . Drage fordel af protokoller for opløsningsmiddel-baserede væv clearing efterfulgt af tværsnits lys-ark Fluorescens mikroskopi som et kraftfuldt værktøj til afbildning, det var muligt at visualisere infiltration og distribution af adoptively overførte human T celler i tarmen af colitic immundefekte mus24. Især denne eksperimentelle indstilling gennemført to vigtigste nyskabelser: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres på eksperimentelt definerede in vivo betingelser; (2) en temmelig stor område af det syge organ (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan være afbildet i høj opløsning kvalitet, efterfulgt af 3D-genopbygning. Desuden etableret flere nyere undersøgelser med succes brug af opløsningsmiddel-baserede væv clearing og lys-ark Fluorescens mikroskopi som vigtige værktøjer til avanceret lunge imaging25,26. For at drage fordel af dette teknologiske fremskridt inden for pulmonal immunologi, vedtog vi nu system til analyse af lunge målsøgende.
Her præsenteres protokollen giver en trinvis Introduktion hvordan til at rense og fluorescently etiket primære menneskelige T celler for overførsel ind i musene med induceret lunge betændelse, og Derudover beskriver i detaljer den efterfølgende proces med lys-ark Fluorescens mikroskopisk billeddannelse, herunder orgel forberedelse og billedbehandling. Samlet set håber vi at støtte fremtidige translationel undersøgelser inden for inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme ved at indføre en sofistikeret, men ikke desto mindre muligt, eksperimentelle model til overvågning af menneskelige lymfocyt lunge homing på in vivo betingelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Overvældende væv akkumulering af stærkt aktiverede immunceller repræsenterer et adelsmærke for forskellige kroniske inflammatoriske sygdomme og fremstod som et attraktivt terapeutiske mål i den kliniske behandling af ramte patienter. For at optimere yderligere strategier sigter mod terapeutisk regulering af patologisk ude af balance væv infiltration af pro-inflammatoriske immunceller, vil det være af særlig betydning at opnå bedre indsigt i sygdoms - og orgel-specifikke homing egenskaber af perifere lymfocytter. Den her beskrevne eksperimentel protokol giver mulighed for at overvåge lunge ophobning af fluorescently mærket og adoptively overførte humane lymfocytter i forbindelse med papain-induceret lunge betændelse. I modsætning til standard in vitro-assays ofte anvendes til analyse af immun celle migration og chemotaxis, nu indført in vivo indstillingen tages hensyn lunge-specifikke aspekter af væv organisation og indflydelse af de komplekse inflammatoriske scenario finder sted i den levende murine organisme. Desuden tre-dimensionelle tværsnits lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse giver ikke kun kvantitative data på infiltrerer immunceller, men også skildrer mønster af immun celle lokalisering inden for den betændte lunge. Samlet set er vi kan indføre en innovativ teknik af høj værdi for immunologiske forskning vedrørende Kronisk inflammatorisk lungesygdomme, som let kan anvendes ved at følge den angivne trinvise protokol.

Den præsenterede protokol beskriver en eksperimentel musemodel, som giver mulighed for overvågning og kvantificering af ophobning af adoptively overførte humane T lymfocytter i lunge via lys-ark Fluorescens mikroskopi. Figur 1 A giver en skematisk oversigt over de in vivo trin af den eksperimentelle tidsplan. For at garantere pålidelige resultater, er det af væsentlig betydning at sikre en god kvalitet af de isolerede og fluorescently mærket menneskelige CD4+</su...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Her introducerede protokollen tillader karakterisering af primære humane lymfocytter under in vivo betændelsestilstande homing lunge-kapacitet. Pulmonal infiltration af adoptively overførte human immun celler i en musemodel af allergisk betændelse kan afbildet og kvantificeres ved lys-ark Fluorescens mikroskopi af kemisk ryddet lungevæv.

Avanceret billedbehandling af lunge Homing humane lymfocytter i en eksperimenterende i Vivo Model af allergisk betændelse baseret på lys-ark mikroskopi

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Vores teknik giver mulighed for præcis billeddannelse af lunge-akkumulerede menneskelige immunceller i in vivo inflammatoriske tilstande, der giver spændende indsigt i processen med T-celle lunge homing. Denne protokol understøtter translationel forskning i T-celle lunge homing og kan dermed hjælpe med at identificere nye mål for en optimeret behandling af inflammatoriske eller allergiske lungesygdomme. Især evnen til at overveje indflydelsen af sygdomsspecifikke immuncelleegenskaber, lungevæv organisation, og inflammatoriske miljø på T-celle lunge homing gør denne metode meget fordelagtig.Samlet set er vores teknik af høj værdi for immunologisk forskning inden for kroniske inflammatoriske lungesygdomme, som ofte er drevet af en overvældende vævsakkumulering af aktiverede immunceller. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i en mindst 16-gram, seks uger gamle, bedøvet C57 sort 6J mus, skal du bruge en mikropipet til langsomt at levere 10 mikroliters af frisklavet papain opløsning i et næsebor af musen en gang om dagen i tre på hinanden følgende dage. Dagen efter den sidste papainadministration blev lag 10 milliliter Ficoll-medium under humant perifert blod fra en sund frivillig fortyndet i et forhold på 1-2 i PBS for gradientadskillelse ved centrifugering.Det perifere mononukleare blodcelle- eller PBMC-interfaselag overføres til et nyt 50-milliliterrør, og cellerne indsamles ved centrifugering. Dernæst udføre magnetisk mikroperle isolering af CD4 positive celler i henhold til producentens protokol. Gense de isolerede CD4-baserede CD4-celler ved op til en gang ti til de syvende T-celler pr. mindst 500 mikroliter PBS-koncentration.Mærk cellerne med et passende rødt lys excitable celleprolifererende farvestof i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning standses mærkningsreaktionen med fem bind RPMI-medium suppleret med 10% FBS i fem minutter på is efterfulgt af tre skiver i medium. Til adoptivoverførsel af de humane CD4 positive T-celler til papain-eksponerede recipientmus re-suspendere de fluorescerende mærket T-celler til en gange 10 til den syvende celler pr. milliliter koncentration i PBS og belastning 100 mikroliter af celler i en en-milliliter sprøjte udstyret med en 30-gauge nål pr modtager dyr, derefter injicere hele mængden af celler fra en sprøjte i halen vene en papain-behandlet dyr opretholde nålen spidsen i venen for en ekstra fem sekunder efter cellelevering for at forhindre udledning af cellesuspensionen.Tre timer efter adoptivcelleoverførsel punkterer højre hjertekammer for hver aflivet mus med en 21-gauge kanyle forbundet til et kateter og lav et snit i venstre hjertekammer. Langsomt gennemspørge lungerne med 20 milliliter iskold PBS suppleret med fem millimolar EDTA efterfulgt af to milliliter iskold 4% paraformaldehyd. Når alle de fiksative er blevet skyllet gennem vævet, fjerne spytkirtlerne og skære sternal hyoid muskel at tillade en kraftbevildelser, der skal glide under luftrøret at udsætte airtube væv.Udfør en indledende punktering af den eksponerede luftrør med en 30-gauge nål, før du udskifter nålen med en stump 30-gauge kateter for at forhindre yderligere skader på vævet. Brug en nåleholder til at forsegle krydset mellem det indsatte kateter og luftrøret, og fyld forsigtigt luftvejene med ca. 37 grader Celsius 0,75%agarose, indtil lungeen er fuldstændig udfoldet. En stram kryds mellem kateter og luftrør er afgørende for at udvide lungen til sin fysiologiske størrelse og opretholde væv arkitektur for billeddannelse.Når agarose er helt størknet, fjerne kateteret og omhyggeligt overføre lungen i en formørket, to-milliliter rør fyldt med 4% paraformaldehdye. Dernæst dehydreres vævet med sekventielle ethanolinkubationer under kontinuerlig rotation ved 31 rotationer i minuttet og fire grader Celsius som angivet for fire timer pr. inkubation. Efter fuldstændig dehydrering overføres prøven til ethyl cinnamate til nattens inkubation ved stuetemperatur, indtil vævet fremstår gennemsigtigt.For en lys-ark fluorescerende mikroskopi, bruge en lille dråbe organisk opløsningsmiddel stabil lim til at holde lungen til prøveholderen af mikroskopet og sæt lungelappen på holderen i opretstående stilling. Sæt prøveholderen i kammeret, og vælg de relevante lasere til eksperimentet i instrumentsoftwaren. Dernæst skal du bruge skyderne under Optik til at indstille et ark bredde, numerisk blænde, der ensartet afslører hele organet eller en bestemt del af interesse.Brug skyderen til at indstille laserintensiteten under lasertransmissionskontrol for hver valgt laser, og klik på Anvend. Brug Avancerede måleindstillinger til at flette venstre og højre lysark for at oprette et homogent oplyst billede. Definer start- og slutpositionerne for Z-stakken, der skal måles under scanningsområdet, og indstil trinstørrelsen til fem mikrometer, vælg derefter automatisk for at gemme filerne automatisk og begynde målingen for at tage billederne.Når alle billederne er anskaffet, skal du aktivere knappen Overgå i 3D-analysesoftwaren efter billedbehandling og indlæse det første billede fra en Z-stak for at starte åbningen og den automatiske 3D-rekonstruktion af alle andre billeder af den valgte Z-stak, og juster derefter intensiteten, det sorte niveau og kontrasten for hver kanal under Skærmjustering. Hvis du vil sammenligne ophobningen af humane celler i lungevævet på tværs af forskellige prøver, skal du vælge Rediger og beskær 3D for at definere en lungekube med et bestemt volumen. Hvis du vil kvantificere de markerede celler i den definerede lungekube, skal du åbne Tilføj nye pletter på værktøjslinjen, klikke på Spring automatisk oprettelse over, redigere manuelt og vælge 640 nanometerkanalen.Indstil radiusskalaen til 10,00 mikron, klik på Markér, og klik under Rediger skift med venstre museknap for individuelt at markere hver fluorescerende celle med en prik. Det samlede antal optalte celler vises i statistikken. Hvis du vil tage et billede, skal du bruge snapshotværktøjet og eller bruge animationsværktøjet til at optage en video.Mikroperadbaseret celleberigelse og efterfølgende fluorescensmærkning som vist resulterer typisk i en CD4-positiv renhed på mindst 95 % og en vellykket mærkning af disse celler som bestemt ved flowcytometri. Ethyl cinnamate-baseret vævsclearing opnår en høj grad af organgennemsigtighed, hvilket indikerer en vellykket brydningsindeksmatchning. Den auto-fluorescerende signal af lungevævet tilbyder et nyttigt værktøj til at billedet den anatomiske struktur af lungen ved lys-ark mikroskopi, som kan vises som en gennemsnitlig intensitet projektion eller i overfladetilstand.Sammenlignet med konventionel mikroskopi lys-ark mikroskopi giver fordel af hele organ billeddannelse og efterfølgende 3D rekonstruktion giver mulighed for identifikation og visualisering af spredning farvestof-mærket, overførte menneskelige T-celler i forbindelse med hele organet, desuden præference for overførte menneskelige T-celler til selektiv akkumulering i betændt lungevæv af papain-eksponerede dyr understøttes yderligere af det faktum, at humane CD4 positive T-celler ikke kan hentes fra tarmslimhinden af recipienten. Til kvantificering og sammenligning af lungeakkumulering af humane CD4-positive T-celler mellem forskellige forhold kan de mærkede celler også tælles i flere lungekuber af defineret volumen som påvist. Omhyggelig vævspræparat, herunder lungeperfusion, inflation og vævsclearing, er meget vigtigt for en optimeret generation af lysarkskopiske billeder i høj opløsning.For yderligere at bekræfte den vellykkede diapedesis af overførte humane lymfocytter, denne protokol kan nemt kombineres med flow cytometrisk kvantificering af menneskelige lymfocytter i murine bronchoalveolar lavage. Evnen til at overvåge immunceller afledt af individuelle patienter i in vivo betingelser understøtter identifikation af funktionelle ændringer i immunceller præget af en bestemt sygdom eller terapi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Eksperimentel Menneskelig Pneumokok Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Udvikling af en Audio-based Virtual Gaming Miljø til at hjælpe med Navigation Skills i Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metode til isoleret<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en rotte Model: Erfaringer fra at udvikle en rotte EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model til Uddannelse hormonvirkning i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital mikroskopi af Tumor-associerede Vaskulaturen ved hjælp af avancerede dorsale Skinfold vindue kamre på transgene fluorescerende mus

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering af leukocytinfiltrat i en murin model af Fulminant Myocarditis ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...