Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar financiering door de DFG Collaborative Research centra SFB 1181 en TRR 241. De optische Imaging centrum Erlangen (OICE) en in bepaalde Ralf Palmisano, Philipp Tripal en Tina Fraaß (Project Z2 van de DFG CRC-1181) worden erkend voor deskundige technische ondersteuning voor de microscopische beeldvorming licht vel fluorescentie.

Experimenten met dieren werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de bevoegde plaatselijke autoriteiten in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland). Muizen werden gehuisvest onder voorwaarden van specifieke pathogenen vrije. De collectie van menselijk bloed werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie en de institutionele review board van de University of Erlangen-Nuremberg. Elke patiënt gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. het ...

De hier beschreven experimentele instelling biedt de mogelijkheid om te controleren de homing longcapaciteit van primaire menselijke immune cellen onder omstandigheden van in vivo inflammatoire en daardoor relevantly aanvulling klassiek uitgevoerd in vitro hechting en chemotaxis testen. Om te houden met de kenmerken van de specifieke anatomische orgel van de longen, belangrijke aspecten van immuun cel homing (inclusief chemotaxis en cel distributie binnen de doelgroep orgel) evenals de klinis...

Klassieke inflammatoire aandoeningen van de longen, zoals allergische astma en chronische obstructieve longziekte (COPD), zijn bekend om te worden aangedreven door een toegenomen rekrutering van geactiveerde lymfocyten in het Long weefsel1,2. Lymfocyt-vrijgegeven cytokines (b.v., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-gamma en TNF-α) chemotaxis van aangeboren en aanpassings immune cellen verder te bevorderen, veroorzaken fibrotische airway remodelleren of direct beschadigen de longen parenchym2. Tot nu toe zijn de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de pathologische accumulatie van lymfocyten in longweefsel nog niet volledig begrepen. In analogie met weefsel-selectieve T cel inprenting beschreven voor gut en huid homing, pulmonale dendritische cellen (DC's) kunnen uiteraard prime perifere T-cellen voor preferentiële Long infiltratie, ten minste gedeeltelijk via de inductie van CCR4 expressie op de oppervlak van lymfocyten3. Naast CCR4, worden luchtweg-infiltreren T-cellen ook gekenmerkt door een bijzonder verhoogde expressie van de chemokine receptoren CCR5- en CXCR3 in vergelijking met de T-cellen in het perifere bloed1,4,5. Algemene, bestaande gegevens in overeenstemming zijn met het idee dat Long homing van T lymfocyten onder fysiologische of inflammatoire voorwaarden een aantal verschillende chemokine receptoren en hun respectieve liganden omvat en cruciaal dus hangt een nauw samenwerking tussen aangeboren en aanpassings immune cellen1gecontroleerd. Vooral tijdens de eerste fase van pathogenen of allergeen blootstelling reageren cellen van het aangeboren immuunsysteem TLR stimulatie of IgE-bemiddelde cross-linking door de onmiddellijke vrijlating van verschillende chemoattractants, zoals LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 en PGD21,6,7. Als een schoolvoorbeeld, de interactie tussen PGD2 en de chemoattractant receptor CRTh2 is bekend om zijn van bijzonder belang voor chemotaxis Th2 cellen en zodoende verschenen zo veelbelovend therapeutisch doel in de klinische behandeling van astma. Inderdaad, patiënten met matige astma bleek een verbetering van de symptomen en een aanzienlijke stijging van het geforceerde expiratoire volume in één seconde (FEV1) na de behandeling met een selectieve antagonist van de CRTh2 ten opzichte van de placebo groep8 ,9. In een meer gevorderde staat van de inflammatoire respons kunnen reeds aangeworven T cellen pulmonaire lymfocyt accumulatie via de release van de IL-4 en IL-13 als krachtige prikkels voor pulmonaire DCs verder te versterken. Vervolgens reguleren deze myeloïde afkomstige aangeboren cellen up-de uitdrukking van CCL17 en CCL22 in een STAT6-afhankelijke wijze1,10,11.  Hoewel de complexiteit van het beschreven scenario nog een compleet begrip van de T cel Long homing belemmert, biedt het een overvloed aan moleculaire targets voor een potentieel geoptimaliseerde therapeutische controle van inflammatoire of allergische longziekten. Daarom is er een dringende behoefte aan innoverende experimentele technieken, die kunnen verder verdiepen en onze kennis op het gebied van de T cel chemotaxis en longkanker homing aan te vullen.
Wijten aan het feit dat de Long homing van lymfocyten in het menselijk lichaam wordt beïnvloed door meerdere cellulaire en humorale fysieke parameters1, kunnen allermeest naar de bestaande experimentele methoden niet de gehele complexiteit van deze immunologische proces model. In plaats daarvan, vele standaardprotocollen voor de analyse van Long homing selectief richten op een specifiek aspect betrokken in de opeenvolging van lymfocyt aantrekken, hechting, migratie en behouden. Naast een zuiver beschrijvende bepaling van het mRNA of eiwit-expressiepatroon van verschijnsel en chemokinereceptoren op perifere of Long-infiltreren lymfocyten en de aanvullende meting voor respectieve chemokine levels in bloed, bronchoalveolar lavage (BAL) of pulmonaire weefsel12,13,14,15, gevestigde in vitro cel cultuur assays toestaan een functionele karakterisering van lymfocyt hechting of chemotaxis gedefinieerd op experimentele omstandigheden16,17,18. In principe controleren statische hechting van in vitro testen de bindingscapaciteit van gekweekte lymfocyten een endothelial enkelgelaagde of glas dia's bedekt met recombinant endothelial celadhesie-moleculen (bijv. MAdCAM-1, VCAM-1), terwijl de standaard in-vitro chemotaxis tests worden gewoonlijk toegepast om het vermogen van lymfocyten te migreren langs een chemokine verloop in een transwell systeem19kwantificeren. Zowel in vitro instellingen inschakelen een gecontroleerde aanpassing en modulatie van de experimentele omstandigheden, maar aan de andere kant geen belangrijke variabelen bekend aan kritisch gevolgen voor in vivo chemotaxis en hechting van lymfocyten. Voornamelijk statische cel cultuur testen negeren de invloed van shear krachten veroorzaakt door de permanente bloed stroom19 en de betrokkenheid van de omliggende immunologische milieu en interactie niet-lymfocyt immune cellen, potentieel te verwaarlozen beiden aanwezig in een levend organisme. Om deze beperkingen te overwinnen, de interpretatie van de resultaten verkregen in statische in-vitrotests voor chemotaxis of naleving moeten verdere validatie in dynamische wrijvingscoëfficiënt experimenten onder stroom voorwaarden20,21 en met in vivo modellen van inflammatoire orgel pathologie19. Inderdaad, belangrijke conclusies over de regulering van de T cel Long homing bij inflammatoire of allergische konden worden getrokken uit dierstudies analyseren genetisch gemodificeerde muizen in gedefinieerde modellen voor verschillende longziekten3, 22 , 23. kwantitatieve vergelijking van longkanker infiltreren lymfocyten tussen wildtype muizen en muizen met een tekort voor een specifiek gen van belang een gevestigde en in het algemeen gebruikte instrument is voor het bepalen van het effect van bijzondere cellulaire trajecten of receptoren van het ziekte-gedreven patroon van T cel distributie. Echter, in tegenstelling tot voordat besproken in vitro cel cultuur testen, een ontwerp van de studie op basis van klassieke diermodellen ontbreekt de mogelijkheid om analyseren en controleren van primaire menselijke T cellen rechtstreeks afgeleid van het bloed of de BAL van patiënten met een inflammatoire Long ziekte. Dus, het is nog steeds uitdagende functioneel valideren of een diagnostisch opgegeven longziekte vermag Impressum menselijke lymfocyten voor preferentiële Long tropisme en hoe ver klinische parameters kunnen van invloed zijn op dit scenario. Onlangs, een zeer elegante in vivo benadering werd geïntroduceerd in het kader van inflammatoire darmziekten (IBD), die was in staat om de meeste van deze beperkingen te overwinnen en opende nieuwe wegen voor geavanceerde translationeel onderzoek naar intestinale lymfocyt homing24 . Profiteren van protocollen voor op basis van oplosmiddel weefsel clearing gevolgd door transversale licht vel fluorescentie microscopie als een krachtige imaging tool, bleek het mogelijk om te visualiseren de infiltratie en de distributie van adoptively overgedragen menselijke T cellen in de darm van colitic immunodeficiëntie muizen24. In het bijzonder, deze experimentele instelling twee belangrijkste innovaties uitgevoerd: (1) primaire menselijke immune cellen kunnen worden geanalyseerd onder experimenteel gedefinieerde omstandigheden in een in vivo; (2) een eerder groot gebied van de zieke orgel (ongeveer 1,5 x 1,5 cm) kan worden beeld in hoge resolutie kwaliteit, gevolgd door 3D-reconstructie. Bovendien vastgesteld verscheidene recente studies met succes het gebruik van op basis van oplosmiddel weefsel clearing en licht vel fluorescentie microscopie als belangrijke instrumenten voor geavanceerde Long imaging25,26. Om te kunnen profiteren van deze technologische vooruitgang op het gebied van pulmonaire immunologie, we nu het systeem voor de analyse van longkanker homing aangenomen.
Het hier gepresenteerde protocol bestaat uit een stapsgewijze inleiding hoe te zuiveren en fluorescently label primaire menselijke T cellen voor overdracht in muizen met geïnduceerde pulmonaire ontsteking en, bovendien, beschrijft in detail het daaropvolgende proces van licht-blad fluorescentie microscopische beeldvorming, met inbegrip van de voorbereiding van het orgel en de beeldverwerking. Wij hopen over het geheel genomen ter ondersteuning van toekomstige translationeel studies op het gebied van inflammatoire of allergische longziekten door de invoering van een verfijnd, maar toch haalbaar, experimenteel model voor het toezicht op menselijke lymfocyt Long homing op omstandigheden in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Overweldigend weefsel accumulatie van zeer geactiveerde immune cellen vertegenwoordigt van een kenmerk van verschillende chronische ontstekingsziekten en naar voren gekomen als een aantrekkelijke therapeutisch doel in de klinische behandeling van de betrokken patiënten. Om strategieën die gericht zijn op therapeutische regulering van pathologisch onevenwichtige weefsel infiltratie van pro-inflammatoire immune cellen verder te optimaliseren, zal het van bijzonder belang voor het bereiken van betere inzichten in de ziekte - en orgel-specifieke homing eigenschappen van perifere lymfocyten. Het hier beschreven experimentele protocol kunt controleren Long accumulatie van fluorescently geëtiketteerde en adoptively overgedragen menselijke lymfocyten in het kader van papaïne-geïnduceerde pulmonaire ontsteking. In tegenstelling tot de standaard in-vitrotests vaak gebruikt bij de analyse van immuun cel migratie en chemotaxis, de nu geïntroduceerde in vivo instelling rekening wordt gehouden met Long-specifieke aspecten van weefsel organisatie en de invloed van de inflammatoire complex scenario plaatsvinden in de lymfkliertest levend organisme. Bovendien, driedimensionale transversale licht vel fluorescentie microscopische beeldvorming voorziet niet alleen kwantitatieve gegevens over infiltreren immune cellen, maar ook ziet u het patroon van immuun cel localisatie binnen de ontstoken Long. We kunnen over het algemeen om een innovatieve techniek van grote waarde voor immunologische onderzoek op het gebied van chronische inflammatoire longziekten, die gemakkelijk kunnen worden toegepast door het volgen van het verstrekte stapsgewijze protocol.

Het gepresenteerde protocol beschrijft een experimentele muismodel, waarmee toezicht en kwantificeren van de accumulatie van adoptively overgedragen menselijke T lymfocyten in de longen via licht-blad fluorescentie microscopie. Figuur 1 A biedt een schematisch overzicht van de in vivo stappen van het experimentele schema. Met het oog op een betrouwbare resultaten, het is van wezenlijk belang om een goede kwaliteit van de afgelegen en fluorescently label menselijke CD4+...

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Onze techniek maakt het mogelijk om de nauwkeurige beeldvorming van longgeaccumuleerde menselijke immuuncellen in in vivo ontstekingsaandoeningen te geven die opwindende inzichten geven in het proces van T-cellonghoing. Dit protocol ondersteunt translationeel onderzoek naar T-cellongen en kan daardoor helpen bij de identificatie van nieuwe doelen voor een geoptimaliseerde therapie van ontstekings- of allergische longziekten. In het bijzonder, de mogelijkheid om de invloed van ziekte-specifieke immuuncel eigenschappen, longweefsel organisatie, en inflammatoire milieu op T-cel long homing te overwegen maakt deze methode zeer voordelig.Over het algemeen is onze techniek van grote waarde voor immunologisch onderzoek op het gebied van chronische ontstekingslongziekten, die vaak worden gedreven door een overweldigende weefselaccumulatie van geactiveerde immuuncellen. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een ten minste 16-gram, zes weken oude, verdoofde C57 zwarte 6J muis, gebruik maken van een micropipet om langzaam te leveren 10 microliters van vers bereide papaïne oplossing in een neusgat van de muis een keer per dag gedurende drie opeenvolgende dagen. De dag na de laatste papaïne toediening, laag 10 milliliter ficoll medium onder menselijk perifeer bloed van een gezonde vrijwilliger voorverdund op een een-twee verhouding in PBS voor dichtheid gradiënt scheiding door centrifugatie.Breng de perifere mononucleaire bloedcel of PBMC interfase laag in een nieuwe 50-milliliter buis en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Voer vervolgens magnetische microbead isolatie van CD4 positieve cellen volgens het protocol van de fabrikant. Het opnieuw opschorten van de kraal geïsoleerde CD4 positieve T-cellen op een tot een keer tien tot de zevende T-cellen per ten minste 500 microliter van PBS-concentratie.Label de cellen met een geschikte rood licht prikkelbare cel proliferatie kleurstof gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, arresteer de etikettering reactie met vijf volumes van RPMI medium aangevuld met 10% FBS gedurende vijf minuten op ijs, gevolgd door drie wasbeurten in medium. Voor adoptieve overdracht van de menselijke CD4 positieve T-cellen in papaïne-blootgestelde ontvangermuizen, de fluorescerende T-cellen opnieuw op te schorten tot een één keer 10 tot de zevende cel per milliliterconcentratie in PBS en 100 microliter cellen in één met één milliliter spuit uitgerust met een 30-gauge naald per ontvangerdier te laden en vervolgens het volledige volume cellen uit één spuit in de staartader te injecteren, een papainbehandeld dier dat de tipnaal in de ader houdt voor een extra vijf seconden na de cellevering om ontlading van de celsuspensie te voorkomen.Drie uur na adoptieceloverdracht prikt u de rechterventrikel van elke geëuthanaseerde muis met een 21-meter canule die is aangesloten op een katheter en maak een incisie in de linkerventrikel. Langzaam doorsnede de long met 20 milliliter ijskoude PBS aangevuld met vijf millimolar EDTA, gevolgd door twee milliliter ijskoud 4%paraformaldehyde. Wanneer alle van de fixatieve is gespoeld door het weefsel, verwijder de speekselklieren en snijd de sternale hyoid spier om een tang te worden geschoven onder de luchtpijp om de luchtbuis weefsel bloot te leggen.Voer een eerste punctie van de blootgestelde luchtpijp uit met een naald van 30 meter voordat u de naald vervangt door een stompe 30-meter katheter om verdere schade aan het weefsel te voorkomen. Gebruik een naaldhouder om de verbinding tussen de ingebrachte katheter en de luchtpijp te verzegelen en vul de luchtwegen voorzichtig met ongeveer 37 graden Celsius 0,75%agarose tot volledige ontplooiing van de long. Een nauwe verbinding tussen katheter en luchtpijp is van cruciaal belang voor het uitbreiden van de long naar zijn fysiologische grootte en het behoud van weefselarchitectuur voor beeldvorming.Wanneer de agarose volledig gestold is, verwijder de katheter en breng de long voorzichtig over in een verduisterde, twee-milliliter buis gevuld met 4%paraformaldehdye. Vervolgens dehydrateren het weefsel met sequentiële ethanol incubaties onder continue rotatie bij 31 rotaties per minuut en vier graden Celsius, zoals aangegeven voor vier uur per incubatie. Breng het monster na volledige uitdroging over in ethylcinnamate voor een nachtelijke incubatie bij kamertemperatuur totdat het weefsel doorschijnend lijkt.Voor een lichtblad fluorescerende microscopie, gebruik een kleine druppel organische oplosmiddel stabiele lijm om de long aan de monsterhouder van de microscoop te plakken en de longkwab rechtop op de houder te plaatsen. Plaats de monsterhouder in de kamer en selecteer de juiste lasers voor het experiment in de instrumentsoftware. Gebruik vervolgens de schuifregelaars onder Optica om een bladbreedte in te stellen die numeriek diafragma dat het hele orgaan of een specifiek gedeelte van belang uniform openbaart.Gebruik de schuifregelaar om de laserintensiteit in te stellen onder lasertransmissiebesturingselement voor elke geselecteerde laser en klik op Toepassen. Gebruik geavanceerde meetinstellingen om de linker- en rechterlichtbladen samen te voegen om een homogeen verlicht beeld te maken. Definieer de begin- en eindposities van de Z-stack die moet worden gemeten onder scanbereik en stel de stapgrootte in op vijf micrometer en selecteer vervolgens automatisch opslaan om de bestanden automatisch op te slaan en begin met de meting om de beelden vast te leggen.Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, activeert u de Knop Overtreffen in de 3D-analysesoftware na de beeldvorming en laadt u de eerste afbeelding van één Z-stack om de opening en automatische 3D-reconstructie van alle andere afbeeldingen van de geselecteerde Z-stack te starten, en pas u onder Weergaveaanpassing de intensiteit, het zwarte niveau en het contrast voor elk kanaal aan. Als u de accumulatie van menselijke cellen in het longweefsel over verschillende monsters wilt vergelijken, selecteert u 3D bewerken en bijsnijden om een longkubus met een specifiek volume te definiëren. Als u de gelabelde cellen in de gedefinieerde longkubus wilt kwantificeren, opent u Nieuwe vlekken toevoegen op de werkbalk, klikt u op Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken en selecteert u het kanaal van 640 nanometer.Stel de straalschaal in op 10,00 micron, klik op Selecteren en klik onder Bewerken op Shift met de linkermuisknop om elke fluorescerende cel afzonderlijk met een stip te markeren. Het totale aantal getelde cellen wordt weergegeven in de statistieken. Als u een afbeelding wilt vastleggen, gebruikt u het animatiegereedschap en gebruikt u het animatiegereedschap om een video vast te leggen.Microbead-gebaseerde celverrijking en daaropvolgende fluorescentie etikettering zoals aangetoond meestal resulteren in een CD4 positieve zuiverheid van ten minste 95%en een succesvolle etikettering van deze cellen, zoals bepaald door flow cytometrie. Ethylcinnamate-gebaseerde weefselclearing bereikt een hoog niveau van orgaantransparantie dat wijst op een succesvolle refractieve indexmatching. Het auto-fluorescerende signaal van het longweefsel biedt een nuttig hulpmiddel om de anatomische structuur van de long beeld door licht-sheet microscopie die kan worden weergegeven als een gemiddelde intensiteit projectie of in de oppervlakte-modus.In vergelijking met conventionele microscopie, lichtbladmicroscopie biedt het voordeel van hele orgaanbeeldvorming en de daaropvolgende 3D-reconstructie waardoor de identificatie en visualisatie van proliferatie met het label kleurstof, overgedragen menselijke T-cellen in de context van het hele orgaan, bovendien wordt de voorkeur van overgedragen menselijke T-cellen voor selectieve accumulatie binnen het ontstoken longweefsel van papaïne-blootgestelde dieren verder ondersteund door het feit dat menselijke CD4-positieve T-cellen niet kunnen worden opgehaald uit het darmslijmvlies van de ontvangende dieren. Voor de kwantificering en vergelijking van de longaccumulatie van menselijke CD4-positieve T-cellen tussen verschillende omstandigheden, kunnen de gelabelde cellen ook worden geteld in verschillende longblokjes van gedefinieerd volume zoals aangetoond. Zorgvuldige weefselvoorbereiding, waaronder longperfusie, inflatie en weefselclearing is zeer belangrijk voor een geoptimaliseerde generatie van hoge resolutie lichtplaatmicroscopische beelden.Om de succesvolle diapedese van overgedragen menselijke lymfocyten verder te bevestigen, kan dit protocol gemakkelijk worden gecombineerd met de stroming cytometrische kwantificering van menselijke lymfocyten in de murine bronchoalveolar lavage. Het vermogen om immuuncellen afgeleid van individuele patiënten in in vivo omstandigheden te controleren, ondersteunt de identificatie van functionele veranderingen in immuuncellen die door een bepaalde ziekte of therapie zijn ingeprent.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentele Human Pneumokokken vervoer

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Ontwikkeling van een Audio-based Virtual Gaming Milieu om te helpen met Navigatie Vaardigheden in het Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

WERKWIJZE Geïsoleerde<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Longperfusie in een Rat Model: Lessen uit het ontwikkelen van een Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...