Name: advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy at JoVE.com

Les auteurs remercient financement par la DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 et 241 de la TRR. L’Optical Imaging Centre Erlangen (OICE) et en particulier Ralf Palmisano, Philipp Tripal et Tina Fraaß (projet Z2 de la DFG CRC 1181) sont reconnus pour un soutien technique spécialisé pour l’imagerie microscopique de fluorescence lumière-feuille.

Dans les expériences impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par les autorités locales compétentes à Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne). Souris ont été logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. La collecte de sang humain a été approuvée par le comité local d’éthique et de la Commission de révision institutionnelle de l’Université d’Erlangen-Nuremberg. Chaque patient a donné consentement éclair?...

Le paramètre expérimental décrit ici offre la possibilité de contrôler la capacité de radioralliement pulmonaire des principales cellules immunitaires humaines sous des conditions inflammatoires in vivo et donc pertinente compléments classiquement effectuée chimiotactisme et adhérence in vitro dosages. Pour prendre en compte les caractéristiques spécifiques organe anatomique du poumon, des aspects importants de cellules immunitaires d’autoguidage (incluant la distribution de chim...

Troubles inflammatoires classiques du poumon, telles que l’asthme allergique et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), sont bien connus pour être chassés par un augmentation du recrutement des lymphocytes activés dans le tissu pulmonaire1,2. Les cytokines lymphocytes-réalisé (par exemple, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ et TNF-α) promouvoir davantage le chimiotactisme des cellules immunitaires innées et adaptatives, induire de remodelage des voies aériennes fibreuses ou endommager directement le poumon parenchyme2. Jusqu'à présent, les mécanismes sous-jacents responsables de l’accumulation pathologique des lymphocytes dans les tissus pulmonaires ne sont pas encore bien compris. Par analogie avec l’empreinte de tissus sélective des cellules T pour le homing gut et cutanée, pulmonaires cellules dendritiques (CD) sont évidemment en mesure d’amorcer des cellules T périphériques pour l’infiltration pulmonaire préférentiels, au moins en partie par l’intermédiaire de l’induction de l’expression CCR4 sur la surface des lymphocytes3. Outre CCR4, voies respiratoires-infiltration des lymphocytes T sont également caractérisés par une expression particulièrement accrue des récepteurs chimiokines CCR5 et CXCR3 par rapport aux cellules T dans le sang périphérique1,4,5. Dans l’ensemble, les données sont compatibles avec le concept que homing poumon des lymphocytes T dans des conditions physiologiques ou inflammatoires implique un certain nombre de récepteurs de chimiokines différents et leurs ligands respectifs et donc dépend une étroite collaboration contrôlé la collaboration entre cellules immunitaires innée et adaptative1. En particulier, au cours de la phase initiale d’exposition pathogène ou allergène, les cellules du système immunitaire inné répondent à stimulation TLR ou à médiée par les IgE réticulation par la libération immédiate des chimioattractants différents, comme LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 et PGD21,6,7. Comme un excellent exemple, l’interaction entre PGD2 et le récepteur du facteur chimiotactique CRTh2 est connu pour être d’une importance particulière pour le chimiotactisme des cellules Th2 et apparaît donc aussi prometteur cible thérapeutique dans la prise en charge clinique de l’asthme. En effet, les patients souffrant d’asthme modéré a montré une amélioration des symptômes et une augmentation significative du volume expiratoire forcé en une seconde (VEMS1) après le traitement avec un antagoniste sélectif de CRTh2 par rapport au groupe placebo8 ,9. Dans un état plus ont progressé de la réponse inflammatoire, déjà recruté des lymphocytes T sont capables d’augmenter davantage accumulation pulmonaire lymphocytaire via la libération d’IL-4 et IL-13 comme stimulus puissants pour des contrôleurs de domaine pulmonaires. Par la suite, ces cellules myéloïdes innées de la régulation l’expression de CCL17 et CCL22 dans une fonction STAT6 manière1,10,11.  Bien que la complexité du scénario décrit empêche toujours une compréhension complète de poumon de cellules de T d’autoguidage, elle offre une multitude de cibles moléculaires pour un contrôle optimisé potentiellement thérapeutique des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques. Par conséquent, il y a un besoin urgent de techniques expérimentales novatrices, qui sont en mesure d’approfondir et compléter nos connaissances dans le domaine du chimiotactisme des cellules T et domiciliation de poumon.
Due au fait que homing poumon des lymphocytes dans le corps humain est influencé par plusieurs paramètres physiques, humorale et cellulaire1, la plupart des méthodes expérimentales existantes n’est pas en mesure de modéliser la complexité entière de ce processus immunologique. Au lieu de cela, beaucoup de protocoles normalisés pour l’analyse du poumon homing sélectivement se concentrent sur un aspect précis impliqué dans la cascade d’attraction lymphocytaire, adhésion, la migration et rétention. Outre une décision purement descriptive du ARNm ou protéine modèle expression des intégrines et chemokine récepteurs sur les lymphocytes périphériques ou poumon-infiltration et la mesure complémentaire des niveaux respectifs de chemokine dans le sang, lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou tissu pulmonaire12,13,14,15, essais de culture in vitro de cellules bien établies permettent une caractérisation fonctionnelle de l’adhérence des lymphocytes ou chimiotactisme dès défini des conditions expérimentales16,17,18. En principe, tests d’adhérence in vitro statique surveillent la capacité de liaison des lymphocytes cultivés à une monocouche endothéliale ou à lames en verre recouverts de molécules d’adhérence endothéliales recombinante (p. ex., MAdCAM-1, VCAM-1), alors que norme in vitro la chimiotaxie dosages sont généralement appliqués pour quantifier la capacité des lymphocytes à migrent le long d’un gradient de chemokine dans un système de transwell19. Les deux paramètres in vitro permettent un ajustement contrôlé et la modulation des conditions expérimentales, mais n’ont pas d’autre part des variables importantes qui critique les répercussions sur la chimiotaxie in vivo et l’adhérence des lymphocytes. Essentiellement, des essais de culture des cellules statiques ne pas tenir compte de l’influence des forces de cisaillement provoquées par le flux de sang permanent19 et potentiellement négligent l’implication du milieu immunologique environnante et interaction des cellules immunitaires des lymphocytes, tous deux présents dans un organisme vivant. Afin de surmonter ces limitations, l’interprétation des résultats acquis en statiques essais in vitro de chimiotactisme et de l’adhérence besoin encore validation dans des expériences d’adhérence dynamiques sous des conditions de débit20,21 et en Vivo modèles de pathologie inflammatoire orgue19. En effet, important pourraient tirer des conclusions sur la régulation de poumon de cellules de T d’autoguidage dans des conditions inflammatoires ou allergiques provenant d’études animales analyser génétiquement modifié souris dans des modèles définis de différentes maladies pulmonaires3, 22 , 23. la comparaison quantitative du poumon infiltration lymphocytes entre les souris de type sauvage et des souris ayant un déficit pour un gène spécifique d’intérêt représente un outil bien établi et largement utilisé pour définir l’impact du cellulaire particulière voies ou récepteurs sur le modèle axée sur la maladie de distribution de cellules T. Cependant, contrairement à avant discuté des essais de culture cellulaire in vitro, une conception de l’étude basée sur des modèles animaux classiques n’a pas la capacité d’analyser et de surveiller des cellules T humaines primaires directement dérivés du sang ou le BAL des patients souffrant d’une inflammation pulmonaire maladie. Ainsi, il reste encore difficile à valider sur le plan fonctionnel si une maladie pulmonaire diagnostique spécifié est apte imprimer des lymphocytes humains de tropisme préférentiel pulmonaire et dans quelle mesure les paramètres cliniques peuvent influer sur ce scénario. Récemment, une approche très élégante in vivo a été introduite dans le cadre des maladies inflammatoires de l’intestin (MII), qui est parvenue à surmonter la plupart de ces limitations et ouvert de nouvelles avenues de hautes études translationnelles sur lymphocytes intestinaux homing24 . Profitant des protocoles pour la compensation des tissus à base de solvants suivie de fluorecence feuilles lumière transversale comme un puissant outil d’imagerie, il était possible de visualiser les infiltrations et la distribution de cellules de T humaines moutschen transférés dans l’intestin des souris immunodéficientes colitic24. En particulier, ce paramètre expérimental mis en place deux innovations principales : (1) des cellules immunitaires humaines primaires peuvent être analysés dans des conditions déterminées expérimentalement in vivo ; (2) une assez grande surface de l’organe malade (environ 1,5 x 1,5 cm) peut être photographiée en qualité haute résolution, suivie de reconstruction 3D. En outre, plusieurs études récentes établi avec succès l’utilisation de tissus à base de solvant de compensation et la microscopie de fluorescence lumière-feuille comme des outils importants pour poumon avancé d’imagerie25,26. Pour bénéficier de cette avancée technologique dans le domaine de l’immunologie pulmonaire, nous avons adopté maintenant le système d’analyse des homing de poumon.
Le protocole présenté ici constitue une introduction étape par étape comment purifier et fluorescent étiquette primaire T humain cellules pour le transfert à des souris avec une inflammation pulmonaire induite et, en outre, décrit en détail le processus ultérieur de lumière-feuille microscopiques imagerie de fluorescence, y compris la préparation de l’orgue et de traitement d’image. Dans l’ensemble, nous espérons pouvoir soutenir les futures études translationnelles dans le domaine des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques en introduisant une sophistiqué, mais néanmoins réalisable modèle expérimental de surveillance homing poumon lymphocytes humains conditions in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1129px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Agarose NEEO Ultra</td>
			<td style="width:436px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:151px;">2267.4</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>304060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K2981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cannula 21 G</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>301300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell proliferation dye eflour670</td>
			<td>eBioscience Inc., San Diego, USA</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD4 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>21066001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethly cinnamate (ECi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>112372-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol &#8805; 99.5 % (EtOH)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS (fetal bovine serum) Good Forte</td>
			<td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 100 &#181;m&#160;</td>
			<td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich, Switzerland</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImspectorPro software</td>
			<td>Abberior Instruments GmbH, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamin&#160;</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>3617KET-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LaVision UltraMicroscope II</td>
			<td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multifly cannula 20 G</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>851638035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 G needle</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9161502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>C-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pattex Glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>PSK1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>anprotec</td>
			<td>AC-AF-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI medium&#160;</td>
			<td>(Gibco) Life Technologies GmbH,&#8232;Darmstadt, Germany</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Papain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,071,440,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 anti-human CD4</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>317428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, &#954; isotype Ctrl</td>
			<td>BioLegend, San Diego, USA</td>
			<td>400337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serological pipette 10 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">86.1254.001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany</td>
			<td>9166017V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 5 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 20 ml</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA</td>
			<td align="right">260069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>72,706,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72.695.400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 2 ml, brown</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">72,695,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 15 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube 50 ml</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:151px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazin (Rompun 2%)</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>KPOBD32</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced imaging of lung homing human lymphocytes in an experimental in vivo model of allergic inflammation based on light-sheet microscopy

Accumulation dans les tissus de cellules immunitaires activées hautement représente une caractéristique de diverses maladies inflammatoires chroniques et a émergé comme une cible thérapeutique séduisante dans la prise en charge clinique des patients affectés. Afin d’optimiser les stratégies visant à un règlement thérapeutique de l’infiltration des tissus pathologiquement déséquilibrée des cellules immunitaires pro-inflammatoires, il sera particulièrement important pour atteindre les aperçus améliorés en maladie et organe-spécifiques propriétés homing des lymphocytes périphériques. Le protocole expérimental décrit ici permet de contrôler l’accumulation des lymphocytes humains fluorescent étiquetés et moutschen transférés dans le cadre d’une inflammation pulmonaire induite par la papaïne poumon. Contrairement aux tests in vitro standards fréquemment utilisés pour l’analyse de la migration des cellules immunitaires et la chimiotaxie, le paramètre in vivo maintenant introduit tienne compte des aspects spécifiques du poumon d’organisation tissulaire et l’influence du complexe inflammatoire scénario qui se déroulent dans l’organisme murine vivant. En outre, imagerie microscopique en trois dimensions transversales lumière-feuille fluorescence ne fournit pas uniquement des données quantitatives sur l’infiltration de cellules immunitaires, mais représente aussi le modèle de la localisation des cellules immunitaires dans l’inflammation pulmonaire. Dans l’ensemble, nous sommes en mesure de présenter une technique innovante de haute valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des pneumopathies inflammatoire chronique, qui peut être facilement appliqué en suivant le protocole étape par étape fourni.

Le protocole présenté décrit un modèle expérimental de souris, qui permet la surveillance et quantification de l’accumulation de moutschen transféré les lymphocytes T humains dans les poumons par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille. Figure 1 A fournit un aperçu schématique des étapes de la planification expérimentale in vivo. Afin de garantir des résultats fiables, il est d’une importance essentielle pour assurer une bonne q...

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Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Notre technique permet l’imagerie précise des cellules immunitaires humaines accumulées dans des conditions inflammatoires in vivo fournissant des aperçus passionnants dans le processus de l’homing pulmonaire à cellule T. Ce protocole soutient la recherche translationnelle sur l’homing pulmonaire à cellules T et peut ainsi aider à l’identification de nouvelles cibles pour une thérapie optimisée des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques. En particulier, la capacité de considérer l’influence des propriétés de cellules immunitaires spécifiques à la maladie, l’organisation des tissus pulmonaires, et le milieu inflammatoire sur l’homing pulmonaire à cellule T rend cette méthode très avantageuse.Dans l’ensemble, notre technique est de grande valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des maladies pulmonaires inflammatoires chroniques, qui sont souvent entraînées par une accumulation massive de tissus de cellules immunitaires activées. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris C57 noire 6J d’au moins 16 grammes et de six semaines, utilisez un micropipet pour livrer lentement 10 microlitres de solution de papain fraîchement préparée dans une narine de la souris une fois par jour pendant trois jours consécutifs. Le lendemain de la dernière administration de papain, couche 10 millilitres de milieu ficoll sous le sang périphérique humain d’un volontaire sain pré-dilué à un rapport d’un à deux dans PBS pour la séparation de gradient de densité par centrifugation.Transférer la cellule sanguine mononucléaire périphérique ou la couche interphase PBMC dans un nouveau tube de 50 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Ensuite, effectuer l’isolement microbille magnétique des cellules CD4 positives selon le protocole du fabricant. La re-suspension de la perle a isolé les lymphocytes T CD4 positifs jusqu’à une fois dix à sept lymphocytes T pour au moins 500 microlitres de concentration de PBS.Étiquetez les cellules avec un colorant approprié de prolifération de cellules excitables de lumière rouge pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction d’étiquetage avec cinq volumes de rpmi moyen complété avec 10%FBS pendant cinq minutes sur la glace suivie de trois lavages à moyen. Pour le transfert adoptif des lymphocytes T positifs CD4 humains chez des souris receveurs exposées à la papain, suspendre à nouveau les cellules T étiquetées fluorescentes à une concentration d’une fois 10 à la septième cellule par millilitre dans PBS et charger 100 microlitres de cellules dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 30 par animal receveur, puis injecter tout le volume de cellules d’une seringue dans la veine de la queue un animal traité à la papaine qui maintient la pointe de l’aiguille dans la veine pour un supplément cinq secondes après l’accouchement cellulaire pour empêcher la décharge de la suspension cellulaire.Trois heures après le transfert de cellules adoptives, perforer le ventricule droit de chaque souris euthanasié avec une canule de calibre 21 reliée à un cathéter et faire une incision dans le ventricule gauche. Parfusez lentement le poumon avec 20 millilitres de PBS glacé complété par cinq millimolar EDTA suivis de deux millilitres de paraformaldéhyde glacé de 4%. Lorsque tout le fixatif a été rincé à travers le tissu, enlever les glandes salivaires et couper le muscle hyoïde sternal pour permettre à un forceps d’être glissé sous la trachée pour exposer le tissu airtube.Effectuez une ponction initiale de la trachée exposée à l’aide d’une aiguille de calibre 30 avant de remplacer l’aiguille par un cathéter contondant de calibre 30 afin d’éviter d’autres dommages au tissu. Utilisez un porte-aiguille pour sceller la jonction entre le cathéter inséré et la trachée, et remplissez soigneusement les voies respiratoires avec environ 37 degrés Celsius 0,75% agarose jusqu’à ce que le déroulement complet du poumon. Une jonction étroite entre le cathéter et la trachée est essentielle pour étendre le poumon à sa taille physiologique et maintenir l’architecture tissulaire pour l’imagerie.Lorsque l’agarose s’est complètement solidifiée, retirez le cathéter et transférez soigneusement le poumon dans un tube sombre de deux millilitres rempli de 4 % de paraformaldehdye. Ensuite, déshydratez le tissu avec des incubations séquentielles d’éthanol sous rotation continue à 31 rotations par minute et quatre degrés Celsius comme indiqué pendant quatre heures par incubation. Après une déshydratation complète, transférer l’échantillon dans un cinnamate éthylique pour une incubation d’une nuit à température ambiante jusqu’à ce que le tissu semble translucide.Pour une microscopie fluorescente à feuilles lumineuses, utilisez une petite goutte de colle stable au solvant organique pour coller le poumon au porte-échantillon du microscope et placez le lobe pulmonaire sur le support en position verticale. Placez le porte-échantillon dans sa chambre et sélectionnez les lasers appropriés pour l’expérience dans le logiciel d’instrument. Ensuite, utilisez les curseurs sous Optique pour définir une largeur de feuille qui aperture numérique qui révèlent uniformément l’organe entier ou une section spécifique d’intérêt.Utilisez le curseur pour définir l’intensité laser sous contrôle de transmission laser pour chaque laser sélectionné et cliquez sur Appliquer. Utilisez des paramètres de mesure avancés pour fusionner les feuilles de lumière gauche et droite pour créer une image homogènement éclairée. Définissez les positions de début et de fin de la pile Z à mesurer sous la plage d’analyse et définissez la taille de l’étape à cinq micromètres, puis sélectionnez autosave pour enregistrer les fichiers automatiquement et commencer la mesure pour capturer les images.Lorsque toutes les images ont été acquises, activez le bouton Surpass dans le logiciel d’analyse post-imagerie 3D et chargez la première image à partir d’une pile Z pour lancer la reconstruction 3D d’ouverture et automatique de toutes les autres images de la pile Z sélectionnée, puis sous réglage d’affichage, ajustez l’intensité, le niveau noir et le contraste pour chaque canal. Pour comparer l’accumulation de cellules humaines dans le tissu pulmonaire à travers différents échantillons, sélectionnez Modifier et Crop 3D pour définir un cube pulmonaire avec un volume spécifique. Pour quantifier les cellules étiquetées dans le cube pulmonaire défini, ouvrez Ajouter de nouvelles taches dans la barre d’outils, cliquez sur Sauter la création automatique, modifier manuellement et sélectionnez le canal de 640 nanomètres.Réglez l’échelle de rayon à 10,00 microns, cliquez sur Sélectionnez, et sous Modifier, Cliquez sur Déplacer avec le bouton de la souris gauche pour marquer individuellement chaque cellule de fluoration avec un point. Le nombre total de cellules comptées sera affiché dans les statistiques. Pour capturer une image, utilisez l’outil instantané et utilisez l’outil d’animation pour capturer une vidéo.L’enrichissement cellulaire à base de microbilles et l’étiquetage subséquent de fluorescence tel que démontré entraînent généralement une pureté positive cd4 d’au moins 95 % et un étiquetage réussi de ces cellules tel que déterminé par cytométrie d’écoulement. La compensation des tissus à base de cinnamate éthylique atteint un niveau élevé de transparence des organes indiquant un appariement réussi de l’indice réfractif. Le signal auto-fluorescent du tissu pulmonaire offre un outil utile pour imager la structure anatomique du poumon par microscopie à feuilles lumineuses qui peut être affichée comme une projection d’intensité moyenne ou en mode surface.Par rapport à la microscopie conventionnelle, la microscopie à feuilles de lumière offre l’avantage de l’imagerie des organes entiers et de la reconstruction 3D subséquente permettant l’identification et la visualisation de lymphocytes T humains étiquetés par colorant de prolifération dans le contexte de l’ensemble de l’organe, en outre, la préférence des lymphocytes T humains transférés pour l’accumulation sélective dans le tissu pulmonaire enflammé des animaux exposés à la papaine est encore soutenue par le fait que les lymphocytes T positifs CD4 humains ne peuvent pas être récupérés de la muqueuse intestinale des animaux receveurs. Pour la quantification et la comparaison de l’accumulation pulmonaire des lymphocytes T positifs CD4 humains entre différentes conditions, les cellules étiquetées peuvent également être comptées dans plusieurs cubes pulmonaires de volume défini tel que démontré. Une préparation minutieuse des tissus, y compris la perfusion pulmonaire, l’inflation et le dégagement des tissus, est très importante pour une génération optimisée d’images microscopiques à haute résolution.Pour confirmer davantage la diapedésie réussie des lymphocytes humains transférés, ce protocole peut facilement être combiné avec la quantification cytométrique d’écoulement des lymphocytes humains dans le lavage bronchoalveolar murine. La capacité de surveiller les cellules immunitaires dérivées de patients individuels dans des conditions in vivo soutient l’identification des altérations fonctionnelles des cellules immunitaires imprimées par une maladie ou une thérapie particulière.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Médecine

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